Abstract
Protein arginin metyltransferase 5 (PRMT5) spiller flere roller i en lang rekke cellulære prosesser, og dens subcellulære lokalisering er regulert dynamisk under musen utvikling og cellulær differensiering. Men lite er kjent om de funksjonelle forskjeller mellom PRMT5 i cytoplasma og PRMT5 i kjernen. Her viste vi at PRMT5 hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma av prostata kreft celler. Subcellulære lokalisering analyser konstruert for å strekke seg over hele den åpne leserammen til PRMT5 proteinet viste nærvær av tre kjernefysiske eksklusjons signaler (Ness) i PRMT5 protein. PRMT5 og P44 /MED50 /WD45 /WDR77 co-lokalisere i cytoplasma, og begge er nødvendig for vekst av prostata kreft celler i en PRMT5 metyltransferase aktivitet avhengig måte. I motsetning til dette, PRMT5 i kjernen hemmet cellevekst i et metyltransferase-aktivitet-uavhengig måte. I samsvar med disse observasjonene, PRMT5 lokalisert i kjernen ved benign prostata epitel, mens den lokalisert i cytoplasma i prostata premaligne og kreftvev. Vi videre funnet at PRMT5 alene metylert både histon H4 og SmD3 proteiner, men PRMT5 kompleks med P44 og pICln denaturert SmD3 men ikke histon H4. Disse resultatene antyder en ny mekanisme som PRMT5 styrer cellevekst og bidrar til prostata tumorigenesis
Citation. Gu Z, Li Y, Lee P, Liu T, Wan C, Wang Z (2012) Protein Arginin metyltransferase 5 funksjoner i Opposite måter i cytoplasma og Nucleus av prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (8): e44033. doi: 10,1371 /journal.pone.0044033
Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA
mottatt: 6 februar 2012; Godkjent: 01.08.2012; Publisert: 27 august 2012
Copyright: © Gu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd 1R01 DK065156 01 fra National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer, United States National Institutes of Health (NIH) (til ZW), ved Cancer Center Support (Core) stipend CA16672 fra National Cancer Institute , NIH til The University of Texas MD Anderson Cancer Center ved NYUSOM Urology Center of Excellence midler til PL, og ved National Natural Science Foundation of China (81171922) og Key Prosjekt forskningsfond av Shaanxi Provincial Science and Technology Program, Kina. (2008K27G01) til ZP. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
protein arginin metyltransferase 5 (PRMT5) er en type II protein arginin metyltransferase som katalyserer symmetrisk dimetylering av argininrester innenfor target proteiner [1]. PRMT5 er sterkt konservert blant gjær, dyr og høyere planter, og har vært implisert i diverse cellulære og biologiske prosesser, inkludert transkripsjonsregulering [2], [3], [4], RNA metabolismen [1], [5], ribosom biogenese 6], Golgi-apparatet struktur vedlikehold [7], og cellesyklusprogresjon [2]. PRMT5 er også involvert i bakterie celle formasjon, spesifikasjon og vedlikehold [8], [9], [10], [11], [12], [13]. I pattedyrceller, PRMT5 lokaliserer til både cytoplasma og kjernen, og det methylates flere histon og nonhistone proteiner [1]. I kjernen, har PRMT5 blitt funnet i SWI /SNF og Nurd kromatin-remodeling komplekser [14], [15], hvor det methylates histoner, så vel som transkripsjonsfaktorer /regulatorer [2], [3], [4]. I cytoplasma, danner PRMT5 en 20S protein arginin metyltransferase kompleks, kalt «methylosome,» bestående av spliceosomal snRNP Sm proteiner, PRMT5, pICln, og WD gjenta protein (MEP50 /WD45) [16], [17], [18] . I dette komplekse, PRMT5 metylert Sm-proteiner [16], [19], og som for metylering øker bindingsaffiniteten til disse Sm proteiner for overlevelse motoriske nevroner (SMN), spinal muskelatrofi sykdom genproduktet [20], [21] . Senere har PRMT5- og SMN-komplekser samarbeide for å laste Sm proteiner bort på U snRNAer, danner U snRNPer [22]. Selv
in vitro
biokjemiske bevis indikerte at symmetrisk arginin dimetylering er avgjørende for pre-mRNA spleising [23], i hvilken grad PRMT5 påvirker spleising
in vivo
fortsatt ukjent. PRMT5 er avgjørende for mus embryonale utvikling [8].
Vi renset og klonet en roman androgen reseptor (AR) -interacting protein, betegnet P44 [24], [25]. Proteinsekvensen av P44 er identisk med en komponent (MEP50) av methylosome komplekset [18] og en subenhet (WD45) av SMN komplekset [17]. Den P44-proteinet inneholder 342 aminosyrerester og syv antatte WD-40 gjentar, og er også betegnet WDR77 i genbanken (Accession: AAH9411.1). Den samvirker med AR og regulerer ekspresjon av et sett av androgen målgener i prostatakjertelen og i prostata kreft [24], [25], [26], [27]. Den P44-proteinet lokaliseres i cytoplasma av prostata epitelceller hos mus som er yngre enn 28 dager; P44 kjernefysisk trans begynner i en alder av 28 dager, og er ferdig i en alder av 45 dager [28]. Nukleær translokasjon av P44 er korrelert med en dramatisk reduksjon i formeringshastigheten av epitel-celler [28] og med funksjonelle cytodifferentiation av luminal celler, som forekommer sammen med ekspresjonen av prostata-spesifikke sekretoriske proteiner [29], [30], [31] , [32]. Således blir P44 cytoplasmatisk lokalisering forbundet med prostata epitelcelleproliferasjon, mens dens nukleære lokaliserings er forbundet med epitelial celledifferensiering. Immunhistokjemisk farging av prostata prøvene viste at P44-proteinet lokaliseres i kjernen av benigne epiteliale celler og i cytoplasma av prostatakreftceller [25]. Translokasjon av P44 fra kjernen til cytoplasma forekommer i prostata intraepitelial neoplasi og prostatakreft lesjoner [25], [26]. Tvunget kjernefysiske lokalisering av P44 hemmet veksten av prostata kreft celler i vev kultur [25] og fullstendig avskaffet veksten av prostata tumorxenotransplantater i hårløse mus [26]. Denne veksthemming var assosiert med oppregulering av
p21 Hotell og
p27
genekspresjon; nedregulering av
cyclin A
,
cyclin B
, og
CDK2
genekspresjon; og cellesyklus arrest på G
1 /G
0 fasen [25], [26]. Dermed er P44 funksjon reguleres av sin subcellulære lokalisering.
(A) PC3 og LNCaP celler ble immunohistochemically farget med anti-PRMT5 og -p44 antistoffer (paneler AG) eller anti-PRMT5 pluss -coilin antistoffer (panel h ). De fluorescente signalene ble observert under et mikroskop med konfokal et rødt filter (for å påvise PRMT5) eller grønt filter (for å påvise P44 eller coilin). Høyre panel viser fusjonerte bilder av PRMT5 og P44 eller coilin farging. Hvit og grønn pilspisser indikerer PRMT5 og P44 eller coilin signaler i kjernen, henholdsvis. (B) Western blot av cytoplasmiske og kjernefraksjoner av LNCaP og PC3-celler med anti-PRMT5, -p44, -HSP90, eller anti-B-antistoff lamin. C, cytoplasma; N, kjernen.
PRMT5 danner en støkiometrisk kompleks med P44 /MEP40 /WD45 /WDR77 i ulike celler [33], [34], [35], og dens subcellulære lokalisering er dynamisk regulert under muse utvikling [8]. Den funksjonelle rollen til PRMT5 i cytoplasma og cellekjernen og forholdet mellom dets subcellulære lokalisering til prostata cancer er ikke undersøkt. I denne studien fant vi at cytoplasma PRMT5 er viktig for vekst av prostata kreft celler, mens kjernekraft PRMT5 hemmer prostatakreft cellevekst. I samsvar med disse observasjonene, PRMT5 lokaliserer i kjernen i benign prostata epitelceller og, i motsetning, lokaliserer i cytoplasma i premaligne og kreftprostatavevet. Derfor er PRMT5 funksjon reguleres ved sin subcellulære lokalisering, og dette nucleocytoplasmic transport kan spille en viktig rolle i prostata tumorigenesis.
(A) Diagram av de PRMT5 trunkeringer uttrykt som GFP-fusjonsproteiner. Prosentene av celler med GFP-PRMT5 trunkeringer i cytoplasma (C), nucleus (N), eller cytoplasma pluss nucleus (C /N) er vist til høyre. (B) subcellulære lokalisering av isolerte kjernefysiske eksport signaler. Cellene ble transfektert med pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), -PRMT5 (500-560), -PRMT5 (576-637), eller pcDNA-GFP og observert under et konfokal mikroskop. (C) Western blot analyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner av celler transfektert med pcDNA-f: GFP-PRMT5, -PRMT5 (1-90), PRMT5 (500-560), eller PRMT5 (576-637) med anti-FLAG, -HSP90, eller -lamin B antistoff.
Materialer og metoder
Vår forskning ikke involverer menneskelige deltakere og dyr, bare bruk av menneskelige prostata kreft vev. Pasientene kan ikke identifiseres, direkte eller indirekte, gjennom identifikatorer knyttet til fagene. Dermed forskningsprosjektet var fritatt etter Fritak 4 (45 CFR Part 46) og et etisk utsagn er ikke nødvendig.
(A) diagrammer av PRMT5 trunkeringer. Cellene ble transfektert med pcDNA-GFP-P44 og pcDNA-PRMT5 eller pcDNA-PRMT5 trunkeringer, og prosentandelen av celler med GFP-P44 i cytoplasma (C) eller cytoplasma pluss nucleus (C /N) er vist til høyre. (B) Cytoplasmatiske translokasjon av GFP-P44 drevet av PRMT5. -Celler ble transfektert med pcDNA-GFP-P44 alene eller sammen med pcDNA-f: PRMT5, -f: PRMT5 (91-637), eller f: PRMT5 (325-637), og GFP-P44 subcellulære lokaliseringen ble observert under et konfokalmikroskop. (C) Western blot analyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner av Cos 7 celler som er beskrevet i B med anti-P44, -HSP90, eller -lamin B antistoff.
Prostate Cancer Prøver og Immunohistochemistry
Godartede og kreft prostata vev ble avledet fra radikal prostatektomi eksemplarer av 19 pasienter med prostatakreft behandles ved New York University Medical Center, og studieprotokollen ble godkjent av sin Institutional Review board. Pasient identiteter ble fjernet fra alle prøver og fritak fra behovet for samtykke ble gitt av Institutional Review Board of New York University School of Medicine, slik at ingen informert samtykke var nødvendig. Vevene ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin og innstøpt i parafin. ble utført immunhistokjemisk analyse på de 19 menneskelige prostata kreft prøver som beskrevet tidligere [36], [37]. Antistoffer (anti-P44 antistoff, 1:50, anti-PRMT5 antistoff, 1:20, fra BD Transduction Laboratories) ble benyttet i lysbilde seksjoner og inkuberes over natten. En streptavidin-biotin peroksidase deteksjonssystem med 3,3′-diaminobenzidin som substrat ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (DAKO A /S, Grostrup, Danmark).
(A) Mutasjoner i P44 avskaffet PRMT5 drevet P44 cytoplasma trans. -Celler ble transfektert med pcDNA-GFP-P44 (WT) eller pcDNA-GFP-P44 (MT) alene eller sammen med pcDNA-PRMT5. Kjernen var farget med Far-rød, og subcellulære lokalisering av GFP-P44 ble observert under et konfokal mikroskop. (B) Mutasjoner i P44 avskaffet samspillet mellom P44 med PRMT5. Cellene ble transfektert med pcDNA-f: P44 (WT) (spor 1) eller pcDNA-f: P44 (MT) (baner 2-5), og hel-cellelysater var forberedt på immunoprecipitation med anti-FLAG antistoff (M2 agarose) . Western blot med anti-PRMT5 ble utført for å påvise det utfelte PRMT5 (nedre panel). Toppanel viser ekspresjon av villtype (WT) eller mutert (MT) P44 i lysatene som benyttes for immunpresipitasjon.
dyrkede celler ble dyrket på kammers objektglass og fiksert med kald metanol (-20 ° C) i 10 min. Uspesifikke proteiner ble blokkert i 4% fiskegelatin i PBS i 20 min. Inkubering over natten ved 4 ° C med primære antistoffer ble utført, etterfulgt av en 1-timers inkubasjon med anti-mus eller anti-kanin-IgG-antistoff merket med Alexa 595 (1:500; Invitrogen) ved romtemperatur. Prøvene ble vasket i PBS og deretter motfarget med TOPRO 3, Far-rød, grønn eller Sytox (Molecular Probes) i 10 minutter ved romtemperatur, montert i Histogel (Linaris Histogel), og analysert direkte ved fluorescens konfokal mikroskopi. For dobbeltfarging, anti-PRMT5 og anti-P44 eller anti-PRMT5 og anti-coilin (1:100, ProteinTech) ble inkubert med cellene over natten ved 4 ° C. De sekundære antistoffer (anti-kanin-IgG merket med DyLight 488, 1:1,000, og anti-muse-IgG merket med DyLight 649, 1, 1000) ble anvendt
(A) shRNA-mediert stanse av PRMT5. eller P44 uttrykk i prostatakreftceller. Western blot-analyse av hel-cellelysater fremstilt fra LNCaP-celler infisert med lentivirus som uttrykker ikke-target (NT) shRNA (søyle 1, 5), PRMT5 (kolonnene 2-4) eller P44 (felt 6) shRNAs. Den shRNA-resistente PRMT5 (spor 3) eller PRMT5 R368A mutant (kolonne 4) ble uttrykt i PRMT5-uttrykkende LNCaP-celler. (B) Vekstkurver av prostata kreft celler uttrykker NT shRNA, PRMT5 shRNAs, P44 shRNA, PRMT5 shRNAs pluss PRMT5, P44 shRNA pluss P44, eller PRMT5 shRNAs pluss PRMT5mt.
Cell Culture and Growth analysen
LNCaP, PC3, og COS 7-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Cellgro) med 10% (v /v) føtalt bovint serum (HyClone). For cellevekstanalyse ble celler (5.000 per brønn) sådd ut på 24-brønners plater, og celleantallet ble tellet hver dag i 7 dager.
(A) Dempe PRMT5 uttrykk P44 reduserte proteinnivåer i cytoplasma . LNCaP celler ble infisert med NT-shRNA eller PRMT5 shRNA og immunostained med anti-PRMT5 eller -p44 antistoff. Kjernen ble kontra med Sytox grønn (midten paneler, grønn). Prøvene ble observert under et konfokalt mikroskop. (B) Western blot av cytoplasmatisk (C) og kjerne (N) fraksjoner av LNCaP-celler som uttrykker NT-shRNA, PRMT5 shRNA, eller P44 shRNA med anti-P44 eller anti-PRMT5 antistoff.
DNA konstruerer og Transient transfeksjon
PRMT5 cDNA-fragmenter ble amplifisert fra det pcDNA-PRMT5 konstruere [24] og subklonet inn i pcDNA-f: GFP konstruere [28] for å gi uttrykk for den N-terminale f: GFP-fusjonsproteiner av PRMT5 trunkeringer. Alle konstruksjoner ble verifisert ved restriksjonsenzymkutting og ved DNA-sekvensering. Den sterke kjernelokaliseringssignal (RKKKRKV) ble sammensmeltet ved den N-terminale ende av PRMT5 å uttrykke NLS-PRMT5 fusjonsprotein. DNA-konstruksjoner (1 mikrogram for hver konstruksjon) ble transient transfektert inn LNCaP, PC3, eller Cos 7-celler (1 x 10
5) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. De transfekterte celler ble fiksert med kald (-20 ° C) metanol i 10 minutter og farget med TO-PRO 3 (10 mikrogram /ml) (Molecular Probes), montert i Histogel (Linaris), og analysert direkte ved fluorescens konfokal mikroskopi.
(A) PRMT5 protein i LNCaP celler som uttrykker PRMT5, PRMT5mt, NLS-PRMT5, eller NLS-PRMT5mt ble immunostained med anti-PRMT5 antistoff. Prøvene ble observert under et konfokalt mikroskop. (B) Western blot av cytoplasmatisk (C) og kjerne (N) fraksjoner av LNCaP-celler som uttrykker PRMT5, f: PRMT5mt, NLS-PRMT5, eller NLS-PRMT5mt med anti-PRMT5, -p44, -lamin B, eller -HSP90 antistoffet . (C) Vekstkurver av prostatakreft LNCaP celler som uttrykker PRMT5, f. PRMT5mt, NLS-PRMT5, eller NLS-PRMT5mt
RNA interferens
P44 shRNA (P44-shRNA) (target-sekvens: 5′-GGGAACTAGATGAGAATGA-3 «), PRMT5 shRNA (target-sekvens: 5′-GGATAAAGCTGTATGCTGT-3′), og en nontargeting shRNA (NT-shRNA) (target-sekvens: 5»-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «) var utformet med en hårnål og klebrige ender (Clal og Mlul). Oligonukleotidene ble hybridisert til den lentiviral genet overføringsvektor, pLVTHM, ved hjelp ClaI- og Mlul-restriksjonsenzymseter. DNA-konstruksjoner ble sekvensert for å teste for riktig innsetting og lengden av innsatsene. Lentivirus ble deretter fremstilt ved å transfektere humane embryonale nyreceller (293ft; Invitrogen) med sekvens-verifisert PLVTHM vektor, den emballasjen plasmid (MD2G), og konvolutten plasmid (PAX2), som er nødvendig for virusproduksjon. Tre dager senere ble den virale supernatanten oppsamlet og filtrert for å fjerne cellulært avfall. LNCaP-celler (1 x 10
5) ble sådd ut på seks-brønns plater og transdusert med lentivirus vektorpartikler. Etter 16 timer ble den virusinneholdende medium fjernet og erstattet med normal vekstmedium. Tre dager etter infeksjon ble cellene splittet på 1:06, og ble dyrket i 3 dager. Hel-cellelysater (5 mikrogram protein) laget av de infiserte celler ble analysert ved Western blot.
(A) SDS-PAGE av PRMT5 komplekser produsert av co-uttrykk i
E. coli
. (B) metylering av SmD3 og histon H4 underlag av PRMT5 og PRMT5 holdige komplekser. Øverst: autoradiografi av gelen. Bunn:. Coomassieblå farging av gelen
Nontargetable PRMT5 og P44 Expression
For å lage nontargetable PRMT5 og P44 ekspresjonsvektorer ble nukleotidsekvenser målrettet av shRNAs mutert hjelp av en oligo- direkte mutagenese kit. Målet sekvens GGATAAAGCTGTATGCTGT av PRMT5 shRNA ble mutert til GGATAAAattaTATGCTGT. Målsekvensen GGGAACTAGATGAGAATGA av P44 ble mutert til GGGAAtTgGAtGAGAATGA. Mutanten PRMT5 eller P44-cDNA ble subklonet inn i lentiviral ekspresjonsvektor (DsRed-og2). Det rekombinante lentivirus ble produsert med 293T, som beskrevet ovenfor. For å befri PRMT5 eller P44 uttrykk, LNCaP PRMT5-shRNA eller P44-shRNA-celler ble sådd ut på seks-brønns plater og transdusert med virus inneholdende enten den nontargetable PRMT5 eller P44 ekspresjonsvektor eller tom vektor. Etter 48 timer ble cellene på nytt belagt, og den PRMT5 eller P44-ekspresjon ble bekreftet ved Western blot.
. Immunhistokjemisk farging av P44 og PRMT5 i menneskelige godartede (topp paneler), prostata epitelial hyperplasia (PIN, midtre paneler), og ondartet prostata (PCA, Gleason grad 4, bunnplater) vev.
Cytoplasmatiske og Nuclear Extract Forberedelse
Cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner ble preparert fra dyrkede celler ved hjelp av Nuclear Extract Kit (katalog # 40010 og 40410, Aktiv Motif) som beskrevet tidligere [28].
Western blot Analysis
PRMT5 og P44 ble påvist i de totale celleekstrakter (5 mikrogram) med 10% SDS-PAGE og overført til en Immobilon-P overføring membran (Millipore). Membranene ble vasket i Tris-bufret saltvann med Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20) og blokkert med 5% fettfri melk i Tris-bufret saltvann med Tween 20 i 1 time . Blottene ble deretter probet over natten med primære antistoffer ved fortynninger på 1:2,000 (anti-P44), 1:1,000 (anti-PRMT5), 1:1000 (anti-HSP90, Santa Cruz Biotechnology), 1, 500 (anti-Lamin B, Santa Cruz Biotechnology), og 1:1,000 (anti-β-aktin, Sigma-Aldrich). Etter 1,5 timers inkubasjon med pepperrot peroksid-konjugert sekundært antistoff, ble immunreaktive proteiner oppdaget av forbedret chemiluminescence hjelp av ECL deteksjonssystemet per produsentens instruksjoner (GE Healthcare). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av Bradford protein assay (Bio-Rad).
Co-immunoprecipitation
PC3 celler (3,6 × 10
6) ble transfektert med 6 mikrogram pcDNA- f: P44, -f: P44 (26-27AAA) -f: P44 (29-31AAA) -f: P44 (35-37AAA), eller -f: P44 (42-44AAA) med Lipofectamine 2000. hele -celle lysater ble fremstilt fra transfekterte celler 48 timer etter transfeksjon og inkubert med 15 ul av M2 agarose (Sigma) i 2 timer ved 4 ° C i et sluttvolum på 0,5 ml inneholdende 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,2 mM EDTA , 20% glyserol, 2 mM DTT, 300 mM KCl, og 0,1% NP40. Kulene ble vasket fem ganger (1 ml hver) med inkubasjonsbuffer. De bundne proteiner ble eluert med 30 mikroliter av FLAG peptider (0,2 mg /ml) i 30 minutter ved 4 ° C og analysert ved hjelp av Western blot med anti-PRMT5 antistoff.
Protein Expression og rensing
PRMT4, P44, pICln, eller SmD3 cDNA ble klonet inn i pET15d (Novagen) som skal uttrykkes som en amino-terminal His
6-kodede protein. For PRMT5 ko-ekspresjon med P44 eller pICln, ble PRMT5 klonet inn pACYCDuet (Novagen) med en amino-terminal His
6 tag, og P44 eller pICln kodende region ble klonet inn i det andre multiple kloningssete av den samme vektor med en N-terminal FLAG-epitop tag. For PRMT5 ko-ekspresjon med P44 og pICln, ble PRMT5 klonet inn pACYCDuet med en amino-terminal His
6 tag, den pICln kodende region ble klonet inn i det andre multiple kloningssete av den samme vektor, og den kodende regionen av P44 ble klonet inn en pET vektor med en N-terminal FLAG-epitop tag. Proteiner ble uttrykt i BL21 (DE3) celler ved 30 ° C i 3 timer etter induksjon med 0,1 mM isopropyl-1-tio-β-D-galaktopyranosid. Celler ble lysert ved ultralydbehandling tre ganger i 5 minutter hver i lyseringsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 0,3 M KCl, 0,1% NP40, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 2 βg /ml pepstatin A, og 2 mikrogram /ml leupeptin). Proteinene ble renset ved hjelp av Ni-NTA-agarose (Qiagen) ifølge produsentens protokoll med imidazol eluering og deretter renset på M2 agarose (Sigma-Aldrich) med FLAG-peptid-eluering for PRMT5-inneholdende komplekser. Histoner ble renset fra HeLa-celler som tidligere beskrevet [24].
metyltransferase-analysen
metylering reaksjoner ble utført som tidligere beskrevet med noen modifikasjoner [24]. Reaksjoner inneholdende 6 fmol av PRMT5 eller PRMT5-inneholdende kompleksene, en mikrogram av SmD3 eller histoner, og en microCi av S- [metyl-
3H] adenosymethionine (PerkinElmer) ble inkubert i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EGTA og 1 mM EDTA ved 30 ° C i 1 time. Reaksjoner ble kokt i SDS-prøvebuffer og separert på en 15% polyakrylamidgel. Gelene ble fiksert i 30 minutter i 40% metanol-10% eddiksyre, inkuberes i 20 ml forsterke (Amersham Life Science) i 10 minutter, tørket og eksponert for røntgenfilm ved -80 ° C.
Resultatene
PRMT5 og P44 Co-lokalisert i cytoplasma av prostata kreft celler
subcellulære lokalisering av PRMT5 dynamisk regulert under musen utvikling [8]. Det lokaliserer til kjernen i løpet av tidlig utvikling og finnes i cytoplasma av pluripotente epiblast cellene i den indre cellemasse ved embryodag 6,5. PRMT5 lokaliserer primært til cytoplasma i somatiske celler som 293T, Cos-1, U2OS, og normale B-celler [35], [38], [39]. I denne studien, farging med anti-PRMT5 antistoff indikerte at PRMT5 er overveiende cytoplasmisk i prostata cancer PC3 og LNCaP-celler (fig. 1A, panelene A og D).
Western blot av cytoplasmiske og kjernefraksjoner bekreftet sin subcellulære lokalisering (fig. 1B, topp panel). PRMT5 ble også påvist i kjernen av PC3 og LNCaP celler som separate kjernefysiske organer (Fig. 1A, paneler c, f og g, som markeres med hvite piler).
Kjernen inneholder mange dynamiske atomstrukturer, herunder Cajal organer [40]. Selv om funksjonen av Cajal legemet forblir ukjent, er det betydelig bevis som tyder på at det kan være involvert i snRNA modning /biogenese, histon pre-mRNA prosessering, og sammenstillingen av de transcriptosomes [41], [42]. Den Cajal kroppen inneholder mange komponenter, inkludert coilin (markør av Cajal organer), snRNPer, og SMN. PRMT5, MEP50, pICln og SM proteiner danner methylosome kompleks som formidler montering av spliceosomal snRNP [18], [20]. SMN-kompleks, som inneholder proteiner og Sm PRMT5, er nødvendig og tilstrekkelig for montering av UsnRNA [21], [43]. Vi immunostained LNCaP-celler ved anvendelse av en kanin anti-coilin og et muse anti-PRMT5 antistoff. Den sammenslåtte bildet viste at PRMT5 ikke er samlokalisert med Cajal organer i kjernen (Fig. 1A, panel h).
Etter avtale med våre tidligere rapporterte data [25], P44 protein lokalisert hovedsakelig i cytoplasma av prostatakreft PC3 og LNCaP celler (fig 1A, paneler b og e;. fig. 1B, andre panel). Det fusjonerte bildene viste en god samlokalisering av PRMT5 med P44 i cytoplasma, mens dette samlokalisering ikke ble observert i kjernen av PC3 og LNCaP celler (fig. 1A, paneler c, f og g).
PRMT5 inneholder Tre Nuclear Eksklusjons Signaler
N-terminal forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged PRMT5 (GFP-PRMT5) ble forbigående uttrykt i PC3, LNCaP og Cos 7 celler, og den resulterende GFP-PRMT5 fusjonsproteinet hadde en dominerende cytoplasmatisk lokalisering (fig 2B, panelene a og e,. data som ikke er vist for PC3-celler) i disse cellene, lik den til den endogene PRMT5 proteinet (figur 1A, panel d.). GFP-proteinet lokaliseres i både cytoplasma og cellekjernen i disse cellene (fig. 2B, paneler i og j). Å identifisere molekylære determinant for subcellulære lokalisering av PRMT5, overlappende fragmenter som strekker seg over hele den åpne leserammen PRMT5 (Fig 2A.) Ble klonet i ramme for å generere pcDNA-f: GFP-PRMT5 fusjonskonstruksjonene. Disse konstruksjonene ble transfektert inn i Cos 7 celler for å bestemme de kritiske delene av PRMT5 nødvendig for kjernefysisk eksport eller import.
To proteinfragmenter, PRMT5 (1-324) og PRMT5 (325-637), ble funnet i cytoplasma i 100% av transfekterte celler (fig. 2A), noe som tyder på at disse fragmentene inneholder signaler som er nødvendige for cytoplasmisk lokalisering. Delesjon av 144 eller 234 aminosyrerester fra den C-terminale ende av PRMT5 (1-324) fragment påvirket ikke dets cytoplasmatiske lokalisering. Ytterligere delesjoner av seks eller syv aminosyrerester fra den N-terminale eller C-terminale førte til fullstendig tap av cytoplasmatisk lokalisering, noe som indikerer at disse aminosyrerester som er avgjørende for cytoplasmisk lokalisering av dette fragment. Regionen PRMT5 (1-90) ble funnet i cytoplasma i 100% av transfekterte celler (figur 2A. 2B, panel b), og er en ny NES, betegnet NES1. NES1 ligner ikke de konvensjonelle leucine-rik NES [44].
Videre sletting analyse identifisert de to andre NES sekvenser i den C-terminale delen av PRMT5. Den region som spenner over aminosyrerestene 500-560 lokalisert til cytoplasmaet i 100% av transfekterte celler (figur 2A. 2B, panel C). Dermed er PRMT5 (500-560) fragment også en funksjonell NES, utpekte NES2. Den region som spenner over aminosyrerestene 576-637 lokalisert til cytoplasmaet i 98% av transfekterte celler (figur 2A. 2B, panel d), og er en annen funksjonell NES, betegnet NES3. Sekvensanalyse indikerte at disse to NES sekvensene er romanen og også ikke ligne de klassiske leucine-rik NES [44]. Western blot analyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner av transfekterte celler bekreftet cytoplasma lokalisering av full-lengde PRMT5 proteiner og identifisert Ness (Fig. 3C, topp panel). Ingen atomlokaliseringssignaler (NLSs) ble påvist i PRMT5 protein ved denne analysen. Det identifiserte NESS fungert på samme måte i LNCaP celler (Fig. 2B, midtre paneler) og PC3 celler (data ikke vist).
PRMT5 Fremmer Cytoplasmatiske Translokasjon av P44
PRMT5 fysisk samhandler og danner et kompleks med P44 /MEP40 /WD45 /WDR77 i forskjellige celler, inkludert prostata kreft celler [33], [34], [35], og samlokalisert med P44 i cytoplasma av prostatakreftceller (fig. 1a). Vi deretter undersøkt om PRMT5 uttrykk påvirker subcellulære lokalisering av P44. COS 7-celler ble transfektert med pcDNA-GFP-P44 alene eller sammen med pcDNA-PRMT5. I samsvar med tidligere publiserte resultater [28], sterke GFP-P44 signalene var tydelig i kjernen i transfekterte Cos 7-celler (fig. 3B, panel a). Men samtidig uttrykk for PRMT5 resulterte i eksklusive cytoplasma lokalisering av GFP-P44 i 100% av transfekterte celler (figur 3A,. 3B, panel b). Sletting analyse indikerte at den C-terminale del (aminosyrerestene 325-637) er vesentlig og tilstrekkelig til å fremme GFP-P44 cytoplasmatisk translokasjon (figur 3A;. 3B, panel d). Den PRMT5-drevet cytoplasma translokasjon av P44 ble bekreftet ved Western blot analyse av cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner av transfekterte celler (fig. 3C, topp panel). Lignende observasjoner ble oppnådd med LNCaP og PC3-celler (fig. 3B, to nederste paneler). Den konserverte argininrest (R368) er avgjørende for den metyltransferase aktiviteten av PRMT5 [45]. Mutasjon av R368A på PRMT5 opphevet sin metyltransferase-aktivitet [24], men påvirket ikke dens evne til å fremme P44 cytoplasmiske trans (fig. S1). Dermed er PRMT5 den viktigste kraften i å bestemme cytoplasma lokalisering av PRMT5-P44 proteinkompleks.
Den PRMT5-P44 er nødvendig for at den PRMT5 drevet Cytoplasmatiske Translokasjon av P44
Sletting analyse indikerte at aminosyrerestene 26 til 45 i den P44-proteinet var kritiske for den PRMT5-drevet cytoplasmisk translokasjon av P44 (fig. S2). Vi muterte aminosyrerester (
26CME
28
29RQL
31
35RYR
37, eller
42LLL
44) til alaniner i P44-proteinet og undersøkt konsekvensen av disse mutasjonene på PRMT5 drevet cytoplasmisk translokasjon av GFP-P44 (fig. 4A). Disse mutasjonene ikke endre GFP-P44 subcellulære lokalisering i COS 7-celler (Fig. 4A, paneler g, m, s, y versus a). Men mutasjoner (
35RYR
37 til
35AAA
37 og
42LLL
44 til
42AAA
44) avskaffet PRMT5 drevet cytoplasma translokasjon av GFP-P44 (fig. 4A, paneler v, b «versus d).
Disse mutasjonene ble uttrykt som FLAG epitop-merket proteiner i PC3 cellene. Mutasjonene redusert ekspresjonsnivåer av P44-proteinet (fig. 4B, toppanelet, baner 2-5 versus spor 1). Immunoutfelling med anti-FLAG antistoff immobilisert på agarose perler (M2-agarose) indikerte at mutasjoner (
35RYR
37 til
35AAA
37 og
42LLL
45 til
42AAA
44) i P44 avskaffet sin interaksjon med PRMT5 (fig. 4B, bunnpanelet, baner 4 og 5 versus baner 1-3). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at samspillet mellom P44 og PRMT5 er viktig for PRMT5 drevet cytoplasma lokalisering av P44.
Både PRMT5 og P44 er nødvendig for vekst av prostata kreft celler
Å bestemme hvorvidt PRMT5 spiller en rolle i prostata cancer, vi undersøkt hvorvidt tie PRMT5 ekspresjon i LNCaP-celler ville påvirke deres vekst. For å gjøre dette, har vi designet en kort hårnål-interfering RNA (shRNA) rettet mot PRMT5 sekvens. For å teste om shRNA kunne undertrykke PRMT5 uttrykk, infisert vi LNCaP celler med lentiviral vektor overføre et DNA-segment som spesifiserer slik shRNA sekvens. Som vist på fig. 5A, den shRNA dramatisk redusert ekspresjon av PRMT5 protein i LNCaP-celler 4 dager etter den lentivirusinfeksjon (kolonne 2, øvre panel), sammenlignet med det uttrykk ved en ikke-target (NT) shRNA (spor 1, toppfeltet), hvis sekvens hadde ikke med noen kjent menneskelig gen.
