Abstract
Kreftceller vedta glykolyse som den viktigste kilden til metabolsk energiproduksjon for rask cellevekst. Den HIF-1-indusert PFKFB3 spiller en nøkkelrolle i denne tilpasningen ved å heve konsentrasjonen av fru-2,6-BP, den mest potente glykolyse stimulator. Som denne metabolske konvertering er foreslått å være et kjennetegn på kreft, har PFKFB3 dukket opp som et nytt mål for kreft kjemoterapi. Her rapporterer vi at et lite molekyl hemmer, N4A, ble identifisert som en innledende lead compound for PFKFB3 inhibitor med terapeutisk potensial. I et forsøk på å forbedre sin styrke, bestemt vi krystallstrukturen av PFKFB3 • N4A kompleks til 2,4 Å oppløsning, og utnytte den resulterende molekylære informasjon, oppnådd mer potent YN1. Når testet på dyrkede kreftceller, både N4A og YN1 hemmet PFKFB3, undertrykke Fru-2,6-BP nivå, som i sin tur undertrykket glykolysen og til slutt førte til celledød. Denne studien bekrefter PFKFB3 som et mål for nye kreftbehandlinger og gir et rammeverk for fremtidige utviklingsarbeid
Citation. Seo M, Kim JD, Neau D, Sehgal jeg, Lee YH (2011) Struktur basert utvikling av små Molecule PFKFB3 hemmere: Et rammeverk for potensielle kreft Terapeutiske midler rettet mot de Warburg Effect. PLoS ONE 6 (9): e24179. doi: 10,1371 /journal.pone.0024179
Redaktør: Anil Kumar Tyagi, Universitetet i Delhi, India
mottatt: 02.05.2011; Godkjent: 02.08.2011; Publisert: 21.09.2011
Copyright: © 2011 Seo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en National Cancer Institute stipend 1R01 CA124758-01 til Y.-HL Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i motsetning til normale celler, kreftceller har vært registrert for å skifte sin energi metabolisme mot glykolyse [1]. Dette fenomenet, som opprinnelig betegnet Warburg effekt og denne overgang gjør det mulig kreftceller til å tilfredsstille økte biosyntetiske krav til biomasse og energi [2], [3]. Studier har konsekvent vist en unormalt høy glykolytisk hastighet i et bredt spekter av humane kreftformer, men utløsende mekanismer som er ansvarlig for denne metabolske tilpasningen fortsatt dårlig forstått [4], [5]. Blant de mulige mekanismer, er mitokondrielle respiratoriske defekter og hypoksi i tumoren mikromiljøet tilskrevet som to viktige faktorer for Warburg virkning [6], [7], [8]. Til tross for den kompleksiteten og mulm av underliggende mekanismene som er ansvarlig for den Warburg effekten, de metabolske konsekvensene er en konsekvent transformasjon mot glykolyse som den viktigste kilden til ATP produksjonen [4], [9]. Denne metabolske abnormitet av kreftceller gir abiochemical grunnlag for fortrinnsvis å undertrykke progresjonen av maligne celler ved selektiv inhibering av glykolyse [10], [11], [12].
I glykolyse vei, fosfofruktokinase-1 (PFK- 1) katalyserer den store hastighetsbegrensende trinn som omdanner fruktose-6-fosfat (Fru-6-P) til fruktose-1, 6-bisfosfat (Fru-1, 6-BP) og allosterisk regulert av fruktose-2,6 -bisphosphate (Fru-2,6-BP) [13], [14]. Under rikelig energiforsyning, høye nivåer av ATP sterkt hemme PFK-1 aktivitet; kan imidlertid Fru-2,6-BP styre dette hemmende effekt og forbedre glukoseopptak og glycolytic flux [15]. Ikke overraskende er Fru-2,6-BP syntese oppregulert i mange cancercellelinjer, noe som tyder på at selektiv utarming av intracellulære Fru-2,6-BP i kreftceller kan potensielt brukes til å hindre glykolytisk fluks og undertrykke ondartet celleoverlevelse og progresjon [16], [17], [18].
En familie bifunksjonelle enzymer, 6-phosphofructo-to-kinase /fruktose-2,6-bisphosphatases (PFKFB1-4), er ansvarlig for de intracellulære nivåene av Fru-2,6-BP [18], [19], [20]. Blant disse isoenzymene, er PFKFB3 dominant over-uttrykkes i skjoldbruskkjertel, bryst, tykktarm, prostata, ovarie og tumorcellelinjer [18], [21], [22]. Nyere studier har vist at induksjon av PFKFB3 ekspresjon av HIF-1 henhold hypoksisk tilstand følges av øket invasiv potensial og resistens mot kjemoterapi [21], [23]. Samlet utgjør disse studiene tyder PFKFB3 er et potensielt mål for en ny klasse av antineoplastiske midler som hindrer utbruddet av kreft-spesifikke glykolyse ved å hemme Fru-2,6-BP bølge og, til slutt, indusere død av kreft celler. Følgelig hemming av PFKFB3 som en terapeutisk strategi for kreft har blitt foreslått [22].
Til tross for de potensielle kvaliteter, har utnyttelse av PFKFB3 for kreftbehandling forble fattige. Clem et al (2008) rapporterte en pyridinyl-inneholdende forbindelse som en mulig PFKFB3 inhibitor, basert på den forutsagte struktur reseptoren fra den til PFKFB4 [24]. Selv lovende, kan hemmere basert på andre enn den sanne PFKFB3 enzymet strukturer mangler spesifisitet og begrense strategisk forbedring av inhibitor potens. Vi var i stand til å overvinne en slik medfødt defekt ved å delta i de strukturstudier av PFKFB3 og dets komplekser med ligander. I denne rapporten har vi identifisert N4A som en roman kompetitiv hemmer og testet sin hemmende effekt på PFKFB3 aktivitet. For å forstå den molekylære mekanisme av inhibitor-gjenkjennelse av PFKFB3, bestemt vi strukturen av PFKFB3 i kompleks med N4A.Guided av den strukturelle basis for inhibitor binding; vi var da i stand til å optimalisere N4A, bruker likheten søk og beregningsorientert evaluering, noe som resulterer i en oppfølgings lead compound med en 5-fold forbedring i styrke.
I tillegg til den molekylære mekanismen for PFKFB3 hemming og hemmer forbedring vi undersøkte også hemming av fru-2,6-BP produksjon og glykolyse i HeLa-celler ved PFKFB3 hemmer behandling. De nye inhibitorer PFKFB3, N4A og YN1 redusert Fru-2,6-BP nivåer og glykolytisk fluks, noe som resulterer i vekstinhibering av tumorceller og massiv celledød. Disse resultatene gir ikke bare bevis som validerer målretting av PFKFB3 men også den første direkte strukturelle innsikt i protein hemmer samhandling, etablere et grunnlag for struktur-assistert optimalisering og utvikling av nye PFKFB3 hemmere som kjemoterapeutika for kreft.
resultater
Samlet strategi for inhibitor screening og forbedring
et flytskjema som beskriver vår strategi vedtatt for oppdagelse og forbedring av PFKFB3 hemmere er vist i Figur 1. Kandidater til et føre forbindelse ble valgt fra beregnings screening ved hjelp av krystallstrukturen av PFKFB3 som vi tidligere har fastslått til 2,1 å-oppløsning [25] ble anvendt som molekylsikt for screening (a). De resulterende treff forbindelser fra denne molekylsikt ble evaluert ved enzymatisk inhibisjonsanalyse og forbindelser med den høyeste inhiberende aktivitet ble valgt som bly molekyler etter vurdering av medikament likeliness (b). Deretter ble detaljerte kinetiske egenskaper, karakterisert (c) og de biologiske virkninger på humane adenokarsinomceller ble undersøkt ved å måle glykolytisk fluks, veksthemming, og celledød (d). For å forstå den molekylære basis av hemmingen av PFKFB3, ble røntgen krystallografiske struktur analyse av PFKFB3 • inhibitor-kompleks har utført (e). Basert på molekyl informasjon oppnådd fra trinn (e), utførte vi et søk etter nye avledede forbindelser med forbedret potens, ved hjelp av blyforbindelse som en mal (f). De resulterende forbindelser fra denne likheten søket ble evaluert gjennom beregningsforankrings ved hjelp Flexx [26] (a) og den beste optimalisert forbindelsen ble ført gjennom denne utvelgelsesprosessen på nytt. Gjennom iterative sykluser av disse prosessene, var vi i stand til å oppnå en forbindelse med hemmende aktivitet størrelsesordener over den opprinnelige ledelsen og som viser potent PFKFB3 hemming in vitro.
Inhibitor Screening og bindende egenskaper
i løpet av våre tidligere studie, ble en rekke forbindelser som er istand til å binde til den fru-6-P lomme av PFKFB3 identifisert fra virtuell screening. For å bekrefte den inhiberende aktiviteter og til å eliminere falske positiver fra disse medikament-kandidater, ble PFKFB3 hemming testet ved 10 uM av hver av forbindelsene (figur 2A). For å forhindre ikke-spesifikk hemming forårsaket av tilfeldige hydrofobe interaksjoner mellom inhibitor og protein, ble en samme test utført i nærvær av 0,1% Tween-20. Blant de testede forbindelser, ZINC04887558 (N4A, 5, 6, 7, 8-tetrahydroksy-2- (4-hydroksyfenyl) kromen-4-on) inhiberte enzymaktivitet som er større enn 65% i henhold til substrat-metting av tilstander og dette inhibering ble ikke påvirket ved nærvær av Tween-20. Vi valgte N4A som en innledende «bly» (figur 2B). Den påfølgende kinetiske studien viste at N4A hemmer PFKFB3 med en IC
50 verdi of2.97 ± 0,16 mikrometer (tabell 1). En stabil tilstand hemming studie viste at N4A hemmer PFKFB3 som en konkurransedyktig inhibitor mot Fru-6-Pwith en K
i på 1,29 ± 0,26 mikrometer, som forventet fra virtuelle screening og som demonstrert i et Lineweaver-Burk plot (figur 2C) .
(A) Inhibering potenser av søker forbindelser. Størrelsene av hemming av forbindelser ved 10 pM hver måles gjennom enzymanalyse og presentert som prosentiler mot kontrollen (□). En samme eksperiment ble også utført i nærvær av 0,1% Tween-20 (▪), for å eliminere falske positiver forårsaket av ikke-spesifikke hydrofobe interaksjoner. (B) strukturer i PFKFB3 inhibitorer. (C) Lineweaver-Burk plotter som viser kompetitiv hemming av N4A mot Fru-6-P. De inhibitorkonsentrasjoner som ble anvendt var: 0 um (▪), 1 uM (○), 2 pM (▴), og 3 um (□) av N4A. De er også merket ved siden av enkelte tomter. (D) Lineweaver-Burk plotter som viser kompetitiv hemming av YN1 mot Fru-6-P. De inhibitorkonsentrasjoner som ble anvendt var: 0 um (▪), 1 uM (○), 2 pM (▴), og 3 um (□) av N4A. (E) Selektivitet av N4A og YN1 på PFKFB isoformer. Resultatene uttrykkes som prosent inhibering ved to ganger IC
50 konsentrasjon mot PFKFB3 (N4A = 6 uM, YN1 = 1,3 uM).
Forbedring av inhiberingen effekten av blyforbindelse, N4A, ved struktur-guidet optimalisering er et viktig mål for denne studien. Som detaljer vil bli diskutert i de følgende avsnitt er bare en kort sluttresultatet introdusert her i begynnelsen av sammenligninger. To ytterligere N4A inhibitorer, YN1 (7, 8-dihydroksy-3- (4-hydroksyfenyl) kromen-4-on) og YZ9 (etyl-7-hydroksy-2-oxochromene-3-karboksylat) (figur 2B) er blitt oppnådd ved anvendelse av struktur styrt optimalisering. Som oppsummert i tabell 1, YN1 exhibitsIC
50 = 0,67 mikrometer og K
i = 0,24 ± 0,03 mikrometer, viser en fem-dobling i hemming. Forbindelse YZ9 viser enda større hemning-en størrelsesorden over utgangs bly, N4A. Alle de testede forbindelsene er oppløselige i forskjellige vandige oppløsninger opp til 50 uM områder i nærvær av. 1% dimetylsulfoksid (DMSO)
blyforbindelse, N4A, og et derivat, YN1, ble testet med hensyn deres hemmende effekter på andre humane PFKFB isoformer. De hemmere hadde en sterkere effekt på PFKFB3 enn på andre PFKFB isoformer. Ved to ganger IC
50 for PFKFB3 hvor PFKFB3 var over 80% inhibert, N4A oppviser mindre enn 50% inhibering og YN1 viser mindre enn 40% inhibering på PFKFB1, PFKFB2 og PFKFB4 (figur 2E). N4A og YN1 er relativt selektive hemmere av PFKFB3. Forbedre isoformen spesifisitet må være det viktigste målet for neste etappe optimalisering og slike forsøk blir gjort.
Effekter av N4A og YN1 på Fru-2,6-BP nivåer, glykolyse, og cellevekst
Vi neste undersøkt effekten av å benytte den N4A og YN1inhibitors å leve HeLa-celler. Inhibering av PFKFB3 er forventet å forårsake en reduksjon i nivåene av Fru-2,6-BP i HeLa-celler. Etter en 8 timers eksponering for N4A og YN1, ble Fru-2,6-BP redusert ca 20%; etter en 48-timers eksponering, ble Fru-2,6-BP redusert over 40% (figur 3A). Nedregulering av de Fru-2,6-BP nivåer ved N4A og YN1 ble ledsaget av redusert glykolysen, som forventet. Nedgangen i Fru-2,6-BP nivåer etter eksponering for N4A og YN1 ført til en nedgang i laktat produksjon, noe som ble reflektert av en nedgang i laktat sekreter større enn 30%. Samlet utgjør disse dataene antyder N4A og YN1 hemme PFKFB3 resulterer i undertrykkelse av glykolyse (figur 3B).
De Fru-2,6-BP nivåer (A) og nivåene av utskilt laktat (B) ble bestemt enzymatisk ved tidspunktene 0, 4, 8, 12, 24, eller 48 timer etter at de hemmer behandlinger av HeLa-celler. Resultatene ble normalisert til prøvens proteinkonsentrasjoner og uttrykt som et forhold til verdien av bærer-behandlede. Dataene er midler ± SEM fra minst tre forsøk. Tidsavhengige effekter av 25 mikrometer hver av N4A (linje med diamant) og YN1 (stiplet linje med hul firkant) på de cellulære Fru-2,6-BP nivåer (A) og laktat sekreter (B) vises. (C) Vekst hemming av N4A, YN1, og YZ9 på HeLa og T47D celler. Celleantall ble analysert over 36 timer ved trypan blå telling eller XTT-assay. Datapunkter er uttrykt som% cellevekst av kontroll inneholdende kjøretøy mot logaritmisk skala av inhibitorkonsentrasjoner. Feil stolpene står for intraexperimental replikerer standardavvik.
Økt Fru-2,6-BP nivåer innledes med økt glykolyse ofte følger spredning av transformerte celler, inkludert kreftceller [3]. Vi undersøkt effekten av de PFKFB3 inhibitorer, N4A og YN1, på formeringshastigheten av humane adenokarsinomceller. Behandlinger med 25 pM av hver av N4A og YN1 forårsaket 70% og mer enn 90% reduksjon, respektivt, i celleproliferasjon sammenlignet med ueksponerte celler (figur 3C). Resultatene av hemming av cellevekst analyser gående bekreftet at inhibering av PFKFB3 ved N4A og YN1 undertrykker celleenergimetabolisme og, til slutt, cellevekst og som YN1 er en mer potent inhibitor med en GI
50 8,2 ± 0,8 uM sammenlignet med N4A (GI
50 = 14,2 ± 1,5 pM) (tabell 1). N4A og YN1 var også i stand til å inhibere bløt agar-kolonidannelse i HeLa-celler (figur 4). HeLa-celler ble platet i bløt agar med forskjellige konsentrasjoner av N4A eller YN1 og dyrket i 3 uker for å tillate kolonidannelse. Begge forbindelser inhiberte signifikant kolonidannelsen ved 25, 50 og 100 uM. Kolonidannelse ble inhibert med 64% og 79% i nærvær av 25 uM N4A og YN1, respektivt.
(A) Anchorage uavhengig cellevekst i bløt agar. HeLa-celler ble dyrket i bløt agar i 21 dager i nærvær av de angitte konsentrasjoner av N4A og YN1 henholdsvis (20 x). (B) Statistisk analyse av forsøket. Kolonner, mener (n = 5); barer, SD.
For ytterligere å undersøke mekanismen ansvarlig for anti-proliferativ effekt av PFKFB3 hemmere, ble utført flow-cytometri analyse av celledød. Resultatene indikerer at N4A og YN1 indusert både apoptotiske og nekrotiske celledød. Dette blandede mønster er relatert til naturen av apoptose, som, i motsetning til nekrose, er en ATP-avhengig prosess [27], [28]. Celledød indusert av PFKFB3 inhibitorene bør korrelere med deres evne til å utarme cellulære ATP og uttømming av ATP favoriserer død ved nekrose som tidligere spekulert [11], [27], [28]. Våre data støtter dette argument: ved en relativt lav konsentrasjon (25 pM) av N4A eller YN1, et miljø der uttømming av cellulært energitap er moderat, cellene ble funnet å være tilbøyelig til apoptose, mens ved høyere konsentrasjoner (50 uM) av inhibitorer, død av nekrose ble signifikant økt på grunn av utilstrekkelig cellulær energi for å understøtte den apoptotiske prosess (figur 5).
cellene ble behandlet med to forskjellige konsentrasjoner av inhibitorer, 25 uM og 50 uM. (A) indusert celledød ved to forskjellige konsentrasjoner av N4A ble målt ved flow-cytometri etter dobbel farging med Annexin V og PI. (B) Kvantitering av strømnings-cytometrisk data (gjennomsnitt ± SD) som viser en dose-relatert effekt av N4A. (C) cytogrammene av YN- indusert celledød og (D) kvantifisering av strømnings cytometri data.
Oppbygging av PFKFB3 • N4A kompleks
Vi ønsket å bruke N4A inhibitor som en leder for struktur styrt optimalisering av ytterligere hemmere. For å lette dette arbeidet, var det nødvendig å bestemme de molekylære egenskaper av N4A binding til PFKFB3 ved krystallisering av human PFKFB3 i nærvær av N4A. Vi bestemte strukturen i dette komplekset til 2,4 vedtak av en metode for molekylær erstatning ved å bruke den første PFKFB3 struktur (PDB kode: 2AXN) som et søk modell [29]. En
