Abstract
Bakgrunn
Omeprazol har nylig blitt beskrevet som en modulator av svulst chemoresistance, selv om dens underliggende molekylære mekanismene er fortsatt kontroversielt. Siden pankreastumorer er svært kjemoresistent, ville et logisk skritt være å undersøke farmakodynamisk, morfologiske og biokjemiske effekter av omeprazol på bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
metodikk /hovedfunnene
Dose-effektkurver for omeprazol, pantoprazol, gemcitabin, 5-fluorouracil og kombinasjoner av omeprazol og 5-fluorouracil eller gemcitabin ble generert for bukspyttkjertelkreft cellelinjer MiaPaCa-2, ASPC-en, Colo357, PancTu-en, Panc1 og Panc89. De viste at omeprazol inhibert proliferasjon ved sannsynligvis ikke-toksiske konsentrasjoner og reverserte hormesis fenomener av 5-fluorouracil. Elektronmikroskopi viste at omeprazol førte til opphopning av phagophores og tidlig autophagosomes i ASPC-en og MiaPaCa-2 celler. Signalendringer som angir inhibert proliferasjon og programmert celledød ble funnet ved proton-NMR-spektroskopi av begge cellelinjene når de ble behandlet med omeprazol som ble identifisert intracellulært. Omeprazol modulerer det lysosomale transportveien, som vist ved Western blot-analyse av ekspresjon av LAMPER 1, Cathepsin-D og β-COP i lysosome- og Golgi-komplekset inneholdende cellefraksjoner. Akridin orange farging viste at pumpens funksjon av vATPase ikke ble spesifikt inhibert av omeprazol. Genekspresjon av autophagy relaterte LC3-genet, så vel som for Bad, MDR-1, ble Atg12 og vATPase analysert etter behandling av celler med 5-fluorouracil og omeprazol og bekreftet de ovennevnte resultater.
Konklusjoner
Vi hypoteser som omeprazol samhandler med de regulatoriske funksjoner av vATPase uten å hemme sin pumpefunksjon. En modulering av lysosomale transport sti og autofagi er forårsaket kreft i bukspyttkjertelen celler fører til programmert celledød. Dette kan omgå vanlige resistensmekanismer av kreft i bukspyttkjertelen. Siden omeprazol bruk er allerede etablert i klinisk praksis disse resultatene kan føre til nye kliniske applikasjoner
Citation. Udelnow A, Kreyes A, Ellinger S, Landfester K, Walther P, Klapperstueck T, et al. (2011) Omeprazol hemmer spredning og modulerer Autophagy i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 6 (5): e20143. doi: 10,1371 /journal.pone.0020143
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 24 november 2010; Godkjent: 26 april 2011; Publisert: May 24, 2011
Copyright: © 2011 Udelnow et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross relevant progresjon i diagnose, reseksjon og kjemoterapi, kreft i bukspyttkjertelen er forbundet med en kort overlevelse [1]. Konstituerende spredning og dyp motstand mot apoptose er karakteristiske trekk ved bukspyttkjertelkreftceller som gjør dem svært motstandsdyktig mot vanlige kjemoterapeutiske strategier. Flere mekanismer som er ansvarlige for apoptose motstand har vært rapportert blant nedregulering av proapoptotiske proteiner, oppregulering av antiapoptotic proteiner [2], [3], aktivering av forskjellige kinaser så som protein kinase C (PKC) /protein-kinase D1 (PKD1) og kasein kinase 1 (CK1) [4] – [6], forhøyet ekspresjon av forskjellige microRNAs [7], p53-mutasjoner og polymorfismer MDM2 [8]. Derfor identifisering av stoffer som er i stand til å omgå disse mekanismene vil være verdifull.
Nylig, omeprazol (OMP), etablert som en verdensomspennende standard legemiddel for gastritt og magesår siden 1980-tallet, har blitt beskrevet som en potensiell antiproliferativt middel og en motstand modulator både in vitro og in xenograft tumorer i mus [9], [10]. Videre forskning har foreslått at inhibering av protonpumpe-vacuolar (vATPase), som regulerer den lysosomale pH eller opphopning i lysosomene kan være de ledende mekanismer for sensibiliserende celler mot cytostatisk behandling [9] – [12]. I tillegg er dannelsen av reaktive oksygenarter [9] og involvering av p38 MAPK [13] er blitt rapportert å være assosiert med OMP-induserte cellulære effekter. Videre P-glykoprotein (Pgp) [14] og cytokrom P450 2C19 isoform [15] Årsaken farmakokinetiske interaksjoner av OMP med andre legemidler (dvs. antibiotika, barbiturater, cytostatika) som er av klinisk betydning. Disse data så langt peker til komplekse mekanismer som omfatter, blant andre, de lysosomal transportsystemet. Debatten om hvorvidt og hvordan OMP kan hemme kreft celle vekst og forbedre cytostatisk effekt av cytostatika er pågående.
Til dags dato, verken stoffet selv eller noen av dets mål har vært direkte observert innen kreftceller. Det er også praktisk talt ingen data som beskriver den dose-virkningsforhold av OMP i tumorceller. Det ville være av betydelig interesse om dette stoffet er effektivt i klinisk relevante konsentrasjoner. Videre, så vidt vi vet, OMP har ennå ikke blitt brukt i bukspyttkjertelkreft behandling, selv om data fra pasienter med Zollinger-Ellisons syndrom viser at OMP har et bredt terapeutisk bredde og forårsaker bare sjelden og milde bivirkninger selv ved høyere doser [ ,,,0],16]. I motsetning til andre motstands modulatorer som verapamil [17] eller bafilomycin [18] er også giftige for klinisk bruk.
Med tanke på høy chemoresistance av bukspyttkjertelen kreftceller, en av de viktigste målene for vår studie var å bestemme om OMP vil være effektiv i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Derfor undersøkte vi de en- og to-dimensjonale dose-virkningsforhold av OMP alene eller i kombinasjon med 5-fluorouracile (5-FU) eller gemcitabin (GEM) i godt karakteriserte menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer MiaPaCa-2, ASPC-en , Colo357, Panc1, Panc89 og PancTu1 in vitro [19] – [21]. Våre resultater tyder på at de midlere inhiberende konsentrasjoner (IC
50) av OMP var i området fra kliniske anvendbarhet i disse cellelinjene.
For ytterligere undersøkelser vi brukte de to cellelinjene MiaPaCa-2 og ASPC -1, og, ved siden av OMP, den cytostatiske 5-FU for å evaluere spesifisiteten av virkningen OMP forårsaker innenfor disse cellelinjene.
Vi har undersøkt de subcellulære og molekylære forandringer i MiaPaCa-2 og ASPC- 1-celler behandlet med OMP. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og protonkjernemagnetisk resonansspektroskopi av levedyktige celler (H-NMRS) ble utført. Vi fant at modulering av autophagy er en tidlig virkning av OMP. Videre analyse av subcellulære fraksjoner som inneholder lysosomer og Golgi komplekser ved Western blot analyse og NMR-spektroskopi i ubehandlet og behandlet MiaPaCa-2 celler bekreftet at lysosomer er den viktigste intracellulære mål av OMP fører til effekter på protein resirkulering og transportveier, inkludert Golgi-komplekset .
Våre resultater viser at OMP hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler på en doseavhengig måte og sannsynligvis ved ikke-toksiske konsentrasjoner in vitro. OMP forsterker også effekten av 5-FU og GEM. Den lysosomal transport veien er endret på OMP behandling og autofagi er direkte eller indirekte, modulert. Således kan OMP tilveiebringe en ny terapeutisk tilnærming for behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Resultater
OMP hemmer kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon på en doseavhengig måte og forbedrer cytostatiske virkninger av GEM og 5- FU
de dose-effekt-kurver av OMP, pantoprazol (PZL), GEM og 5-FU ble generert ved hjelp av ATP-Bioluminescens analysen. Ett av målene med våre undersøkelser var å evaluere den kliniske anvendelsen av OMP. Derfor bestemte vi den IC
50-tallet ved å tilpasse kurvene til en tre parameter log-logistiske modellen. IC
50, oppført i tabell 1, varierte fra 9-42 mikrogram /ml for OMP, 22-99 mikrogram /ml for PZL, 0.004-0.24 mikrogram /ml for GEM og 0.20-0.57 mikrogram /ml for 5- FU avhengig av cellelinjen.
Disse dose-effektkurver (figur 1) viste gradvise forskjeller i sigmoidicity og andre farmakodynamiske parametere. Det er åpenbart at i lavere konsentrasjoner av narkotika i celler kan være enda høyere enn i de respektive kontrollgruppen (verdier over 1 i figur 1) som indikerer en vekst stimulerende effekt. Dette fenomen, som kalles hormesis, som er definert som en overcompensatory respons av levende organismer til ulike stressfaktorer [22], kan det utgjøre resistensutvikling under kjemoterapi [23].
ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo -357, Panc-1, Panc-89 og PancTu-1-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av de angitte konsentrasjoner av omeprazol, 5-fluorouracile, pantoprazol eller gemcitabin, henholdsvis i 4 dager for å bestemme den IC
50 verdier. IC
50 tallet og sigmoidicities gradvis forskjellig mellom cellelinjene. I lavere konsentrasjoner ble observert en svak vekst-stimulerende effekt (hormesis).
Derfor undersøkte vi effekten av OMP når den kombineres med en cellegift i lavere konsentrasjoner for å vurdere sin rolle i chemoresistance og hormesis vinne . Additiv, synergis eller antagonistiske gjensidige interaksjoner av to medikamenter kan kvantifiseres i quasilinear regionen av doseeffektkurver med median effekt prinsippet om Chou [24] eller enhetlig svar arealet av Greco et al. [25]. Men interaksjoner av stoff kombinasjonen er vanskelig å kvantifisere for hormetic dose-respons-forholdet [26]. Det finnes ulike modeller for å vurdere hormesis for en enkelt behandling [27], [28].
Tabell 2 viser upåvirket fraksjon (f
u), som er celletallet relatert til kontroll, etter lave konsentrasjoner av 5-FU og GEM når det brukes som enkle midler. I ASPC-en, Panc-1 og PancTu-1 celler signifikante økninger av f
u over en ved 5-FU, noe som indikerer hormesis, ble observert. I motsetning var det ingen signifikant hormesis på GEM. Når OMP ble tilsatt til 5-FU i disse konsentrasjonene er hormesis reduseres i ASPC-1, Panc-1 og PancTu-1-cellelinjer (figur 2). I MiaPaCa-2-celler OMP og 5-FU kombinasjonen viste additive effekter, i det Panc-89 cellelinjen OMP førte til en antagonistisk interaksjon. I Colo357 celler ingen dose-effekt-kurve kan bli etablert på grunn av store standardfeil. GEM og OMP viste additiv eller antagonistiske interaksjoner (data ikke vist).
Cellelinjene ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo357, Panc-1, Panc89 og PancTu1 var ubehandlet eller behandlet med 5-FU alene eller i kombinasjon med de angitte konsentrasjoner av OMP i 4 dager. Ved lavere doser av 5-FU alene (svarte linjer, 0 ug /ml OMP) ble en vekst-stimulerende effekt (hormesis) observert i de cellelinjene ASPC-1, PANC-1 og PancTu-1. Datapunktene viser hjelp av 8 målinger. Kurvene er montert i disse cellelinjene ved hjelp av Brain-Cousens modell (se pkt 4.11). I MiaPaCa-2 og Panc-89 celler ingen hormesis oppstod, disse kurvene ble montert ved hjelp av en tre parameter logistisk modell. I Colo357 celler kurvene ikke kan monteres av noen farmakodynamiske modell på grunn av store standardfeil på disse lavere konsentrasjoner (datapunkter vist). De røde, grønne og blå linjer angir den dose-effektkurver for 5-FU når forskjellige konsentrasjoner av OMP ble tilsatt (10, 20 og 40 ug /ml, henholdsvis). I ASPC-1 og Panc-1 celler til hormesis av 5-FU ble reversert og i PancTu-1 celle ble det dempet av OMP avhengig av konsentrasjonen av 5-FU. I MiaPaCa-2 celler har vi funnet en additiv interaksjon av 5-FU med OMP. I Panc-89 celler samspillet var antagonistiske.
Dermed har OMP en doseavhengig antiproliferativ effekt og in vitro IC
50 av OMP i disse støtter hypotesen om klinisk anvendbarhet (som er nærmere omtalt i diskusjonen delen). Imidlertid dose-virkningsforhold av stoffene varierte mellom cellelinjer. Den kombinerte behandlingen av OMP med enten 5-FU eller GEM avslørte doseavhengig additive interaksjoner og en reduksjon av den hormetic vekst stimulering av lavdose 5-FU i ASPC-en, Panc1 og Panc89 celler. .
-cellelinje spesifikke forandringer i intralysosomal pH-verdi etter behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med OMP og 5-FU, enten alene eller i kombinasjon
akridinorange (AO) fluorescens mikroskopi ble utført for å bestemme hvorvidt OMP øker intralysosomal pH-verdien som beskrevet i nylige rapporter, enten ved å inhibere vATPase [10] eller ved å akkumulere i lysosomene [11]. Sure cellekamre er farget rød og nøytrale avdelinger er farget grønn av AO. Spesifikk inhibering av vATPase av bafilomycin A1 har vist seg å føre til en rask hemming av den røde fluorescens [29], [30].
rød-til-grønn fluorescens forholdstall kvantifisert ved hjelp av kvantitativ bildeanalyse for MiaPaCa -2 og ASPC-1-celler er vist i figur 3. De tidlige forandringer (etter 30 minutter etter behandling) bestod av en litt høyere surhet ved 5-FU behandling i MiaPaCa-2-celler og i ASPC-1-celler behandlet med OMP eller OMP + 5-FU. Etter 24 timer ble lysosomal surhet av MiaPaCa-2-celler ble gradvis, men i betydelig grad undertrykkes av OMP, 5-FU og OMP + 5-FU. Men disse observasjoner ikke entydig svarer til de ovennevnte rapporter, da effekten ikke var spesifikk for OMP. I ASPC-1-celler, alle tre behandlingsregimer resulterte i et noe høyere surhet etter 24 timer.
akridinoransje ble tilsatt til levende ubehandlede ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler og celler behandlet med 5-FU, OMP eller en kombinasjon av begge i 30 minutter eller 24 timer. Mikroskopiske livs bildene ble tatt på 525 nm (grønn) og 650 nm (rød) for å oppdage endringer i lysosomal pH-verdi (tre bilder per plate, tre plater per gruppe). Den rød til grønn fluorescens-forholdet av lysosomene i behandlede celler ble sammenlignet med kontrollgruppene ved hjelp av Mann-Whitney-U-test. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollen er merket med *. I ASPC-1-celler, etter 30 minutter av behandlingen, øket intralysosomal surhet ved behandling med OMP (p: 0,0051) og 5-FU + OMP (p 0,0001). Etter 24 timer er surhet økt ved alle behandlingsregimer (5-FU – p: 0,0002; OMP – p 0,00001; OMP + 5-FU – p: 0,037). I MiaPaCa-2-celler surheten er hevet etter 30 min ved 5-FU (p: 0,005) og ble redusert etter behandling med OMP (p: 0,037), 5-FU (p: 0,00026) og 5-FU + OMP (p: 0,011) etter 24 timer.
Dermed konkluderer vi med at OMP ikke føre en konsekvent endring i intralysosomal pH-verdi på kreft i bukspyttkjertelen celler. Likevel en svak hemming skjedde i MiaPaCa-2 celler på alle behandlingsregimer etter 24 timer. I motsetning til dette, ASPC-1 celler viste en høyere lysosomal surhet når de ble behandlet med OMP, 5-FU eller en kombinasjon av begge deler.
Phagophores og autophagosomes akkumuleres i ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler etter behandling OMP
Så langt våre resultater tyder på at vATPase hemming og lysosomal pH høyde var ikke de viktigste effektene forårsaket av OMP i MiaPaCa-2 og ASPC-1 cellelinjer. AO fluorescensmikropskopi imidlertid avdekket at lysosomer var involvert i begge OMP- og 5-FU-mediert hemming av spredning. Derfor undersøkte vi de subcellulære morfologiske endringer etter behandling med OMP, 5-FU og den kombinasjon av begge ved TEM.
Figur 4 sammenligner en ubehandlet ASPC-en celle (figur 4 A) med celler behandlet med 160 ug /ml (figur 4B) og med 80 ug /ml OMP (figur 4C) i 24 timer. Behandling med 80 ug /ml OMP resulterte i autofagi som indikert ved tilsynekomst av tidlige kopplignende phagophores inneholdende cytoplasmisk materiale og autophagosomes fylt med belagte vesikler (figur 4C). Etter behandling med 160 ug /ml OMP, de ASPC-1-celler gjennomgikk apoptose etter 24-48 timer (figur 4b). ble observert Tilsvarende endringer i MiaPaCa-2 celler behandlet med 80 mg /ml OMP inkludert blæredannelse som en samtidig tegn på apoptose (figur 4D).
(A) ASPC-en celle uten behandling (800 ganger). (B) ASPC-en celle gjennomgår apoptose på 160 mikrogram /ml OMP etter 24 timer (800 ganger). Blæredannelse i cytoplasma og kondensering av kjernen er synlig. (C) Phagophores og autophagosomes i et segment av en ASPC-1 celle behandlet med omeprazol 80 ug /ml i 24 timer (2800fold utvidelse). De phagophores er karakterisert ved en kopplignende form (hvite piler). Autophagosomes er lukkede partikler, hvor mange som er økt i behandlede celler (sorte piler). (D) Tidlige phagophores og autophagosomes er også funnet i MiaPaCa-2-celler som ble behandlet med OMP 80 mikrogram /ml etter 24 timer i et perinukleært region innehold lysosomer og Golgi-komplekset. I motsetning til ASPC-1-celler, tidlige tegn på apoptose slik som vacuolization, er også til stede. (E) Søylediagram av antallet autophagosomes og lysosomene per celle i MiaPaCa-2 og ASPC-1-celler ubehandlet eller behandlet med 5-FU, OMP eller en kombinasjon av begge i 24 timer med standardfeil. Signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollen er merket med *. I ASPC-1-celler var det signifikante forskjeller sammenlignet med kontrollen i OMP-gruppen (p: 0,03) og 5-FU + OMP (p 0,03). I MiaPaCa-2 celler 5-FU + OMP gruppe signifikant forskjellig fra kontrollen (p 0,001).
Selv om phagophores ble lett identifiseres av unike morfologiske egenskaper, autophagosomes, lysosomer, endosomer og autolysosomes kunne ikke være preget av TEM. Betydelig større mengder av alle disse lysosomet lignende organells ble observert i ASPC-1-celler behandlet med OMP eller OMP + 5-FU og i MiaPaCa-2-celler som ble behandlet med OMP + 5-FU (figur 4E).
i sammendraget, OMP førte til opphopning av markører for tidlige stadier av autofagi (autophagophores) i begge cellelinjene. Selv om markører for senere trinn, slik som autolysosomes, kunne ikke skilles morfologisk fra andre lysosomale transportveier, det samlede antall lysosom-lignende organeller økte i ASPC-1-celler ved behandling med OMP eller 5-FU + OMP og i MiaPaCa-2- cellene ble behandlet med 5-FU + OMP. Disse funnene tyder på at enten aktivering av protein omsetning eller svekkelse av lysosomal transportveien skjedde.
Identifikasjon av metabolske endringer i levedyktige celler etter behandling med OMP, 5-FU eller en kombinasjon av begge
Proton-NMR-spektroskopi av levedyktige celler ble utført i MiaPaCa-2 og ASPC-1-cellelinjer for å analysere de biokjemiske prosessene i forbindelse med de morfologiske endringer som er beskrevet ovenfor. Forskjellige karakteristiske lavmolekylære intracellulære metabolitter som fettsyrer, aminosyrer, membran assosiert fosfolipid mebolites og middels citrat syklus og glykolyse metabolitter ble identifisert (figur 5).
Cellene ble høstet fra monolagskultur, holdt og målt ved 20 ° C. Måling ble utført ved et 600 MHz Bruker-spektrometer. For bedre synlighet den del av spekteret som viser protonene i alifatiske grupper er delt i 2 deler – A og B. (A). alifatiske del I. metyl og p- og -y- metylengrupper av forskjellige fettsyrer og aminosyrer er synlige. I tillegg, isopropanol og tetrachlorethan (ekstern standard konsentrasjon) oppsto som forurensinger. (B) Alifatisk del II. Fosfolipid metabolitter og a-metylen-grupper av aminosyrer og laktat er synlige. (C) Formel av OMP med nummerering av de respektive protoner. Metylgruppene (1-3, 9), og metylgruppen (4) er dekket av andre metabolitter i de alifatiske delene av spekteret. I motsetning til dette aromatiske protoner er synlige (H5, H8, H10). (D) Overlegg av de aromatiske deler av forskjellige spektra for intracellulær identifisering av OMP. Den sing av H5 proton og dublets til H8 og H10 protoner kan identifiseres når mediet og celle spektra sammenlignes med de uten OMP behandling. Forkortelser: Hans – histidin, Tyr – tyrosin, Phe – fenylalanin, Leu, Ile, Val – leucin, isoleucin, valin. Ala – alanin. Glu – Glutamat, Gin – Glutamin, PC – phosphatidylcholine, Cho – kolin, GPC – glycerophosphocholine, Tau – taurin, Scyllo -. Scylloinositole
OMP selv ble oppdaget intracellulært i begge cellelinjene etter behandling med 80 ug /ml i 24 timer. Signalene i de aromatiske H8 og H10 protoner av OMP (figur 5C) ble lett identifisert (figur 5D) i MiaPaCa-2-celler. OMP ble også identifisert innen ASPC-1-celler ved H5 proton (data ikke vist). Så vidt vi vet er dette første gang at OMP har blitt observert i cellene.
Selv om fastsettelse av absolutte intracellulære konsentrasjoner av NMR-spektroskopi er generelt utsatt for systematiske feil, kan beregning av integrerte prosenter av ulike signaler inneholde nyttig kvantitativ informasjon om stoffskifte. Disse metabolske veier er vist som en sterkt forenklet nettverk for ASPC-1 celler i Figur 6 og MiaPaCa-2 celler i Figur 7. En linje mellom to signaler symboliserer en metabolismevei. Linjen er oransje når signalintensiteten forholdet mellom de tilkoblede stoffer er forskjellig fra kontrollen med p. 0,05 og rødt når p er under 0,01
ASPC-en cellelinje vises uten og ved ulike behandlingsregimer ( OMP, 5-FU eller 5-FU + OMP kombinasjon). Nodene i dette nettverket symboliserer metabolitt signaler, deres farger svarer til relative signalintensitet (når sammenlignet med en ytre standard) som angitt i heatmap målestokk nedenfor. Signalintensiteten er lineært relatert til den intracellulære konsentrasjon. Bakgrunnen for nodene er tomt når signalintensiteten er ute av området som er angitt av heatmap skala. Linjene mellom boksene symboliserer sterkt forenklet stoffskifte. Fargene på disse linjer indikerer signifikante forskjeller i signalintensitetsforhold til de tilkoblede metabolittene i forhold til kontrollgruppen når orange (p 0,05), røde linjer angir p 0,01. Den mest åpenbare endringer er at PC /Cho-forholdet er betydelig lavere i OMP-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Ved 5-FU, er Cho /Acetat forholdet nedgang den eneste vesentlige endringen. I 5-FU + OMP-gruppe, er det flere betydelige endringer, er i.e.the FACH2 /CH = CH-forholdet betydelig høyere. Videre endret Cho /acetat-forhold på 5-FU + OMP som i 5-FU gruppe, men også den sitrat /GSH-forhold. De cellulære biokjemiske effekter involverer hovedsakelig fettsyren og fosfolipid metabolisme peker til membran anabolisme. Forkortelser: Gin – glutamin, Ala – alanin, PC – fosfatidylcholin, Cho – kolin, Lac1 + FACH2 – metylgruppe signal av laktat og metylengrupper av fettsyrene, Lac2 – metylengruppe av laktat, CH = CH – protoner methin-grupper av umettede fettsyrer.
cellelinjen vises uten og ved ulike behandlingsregimer (OMP, 5-FU eller 5-FU + OMP kombinasjon). Nodene i dette nettverket symboliserer metabolitt signaler, deres farger svarer til relative signalintensitet (når sammenlignet med en ytre standard) som angitt i heatmap målestokk nedenfor. Signalintensiteten er lineært relatert til den intracellulære konsentrasjon. Bakgrunnen for nodene er tomt når signalintensiteten er ute av området som er angitt av heatmap skala. Linjene mellom boksene symboliserer sterkt forenklet stoffskifte. Fargene på disse linjer indikerer signifikante forskjeller i signalintensitetsforhold til de tilkoblede metabolittene i forhold til kontrollgruppen når orange (p 0,05), røde linjer angir p 0,01. Ved OMP, PC /Cho prosenter er betydelig lavere sammenlignet med kontroll. Videre acetat /FACH2 forholdet er betydelig redusert i OMP-gruppen. Sistnevnte viste også en høyere CH = CH-nivå, idet forholdet til FACH2 er imidlertid redusert. Ved 5-FU og 5-FU + OMP, kan lignende forandringer observeres. Videre, i motsetning til ASPC-1-celler, Ala /Gln /AMP reaksjonsveien er også involvert. Forkortelser: Gin – glutamin, Ala – alanine, PC – phosphatidylcholine, Cho – Kolin. Lac1 + FACH2 – metylgruppe signal av laktat og metylengrupper av fettsyrene, Lac2 – metylengruppe av laktat, CH = CH -. Protonene i methin grupper av umettede fettsyrer
Membran-bundet fett syrer er vanligvis NMR-synlig bare når du bruker Magic-Angle-Spinning (MAS) teknikk [31]. I motsetning til dette mobil flerumettede fettsyrer (PUFA) grupper (nemlig. CH = CH ved 5,3 ppm eller CH = CHCH2CH = CH ved 2,8 ppm), som er assosiert med dannelsen av lipid faller i autophagosomes under autofagi og programmert celledød (PCD) [32], ble fremtredende i proton-NMR-spektra av MiaPaCa-2-celler som ble behandlet med OMP eller 5-FU + OMP. Dessuten en økning i fettsyre metylen (FACH2) grupper i forhold til acetat ble observert ved OMP og 5-FU + OMP behandling i MiaPaCa-2, men ikke i ASPC-1-celler. Dette korrelerer med elektronmikroskopi av data som viser at de morfologiske forandringer assosiert med autofagi er ledsaget av blæredannelse som peker til starten av apoptose i MiaPaCa-2, men ikke ASPC-1-celler, ved 80 ug /ml OMP.
Cho og phosphocholine (PC) signaler er indikatorer for vekst i menneskelige celler, der forhøyet PC er assosiert med rask spredning og ondartet oppførsel [33] – [35]. Undertrykkelse av PC-en kan være forårsaket av cholin kinase og fosfolipase C nedregulering og fosfolipase A2 induksjon fører til proliferasjon hemming [36]. I vår studie, ble PC undertrykte betydelig i forhold til Cho i MiaPaCa-2 celler behandlet med OMP, 5-FU og 5-FU + OMP og ASPC-1 celler behandlet med OMP alene.
Til sammen disse data viser at fettsyre og fosfolipid-metabolitt signaler skiftes på OMP behandling. Selv om det ble observert tilsvarende endringer i både ASPC-1 og MiaPaCa-2-celler, var disse endringene mer forbedret i MiaPaCa-2-celler, spesielt med hensyn til disse signalendringer som indikerer inhibert proliferasjon (PC) og PCD (PUFA). Dette svarer til de ovenfor beskrevne farmakodynamiske og morfologiske forandringer. Men i MiaPaCa-2-celler de biokjemiske virkningene ikke var begrenset til OMP-behandling, men også oppstått ved 5-FU og 5-FU + OMP og kan derfor ikke anses å være spesifikke for OMP.
Involvering av lysosomer og Golgi-komplekset i den cellulære responsen til OMP
Potensielle subcellulære mål for OMP ble identifisert ved å isolere organeller fra MiaPaCa-2-celler ved tetthetssentrifugering. Som vist i figur 8, første og andre fraksjoner inneholdt tetthets tidlige og sene endosomer og lysosomer som ble identifisert med lampe-1 og Cathepsin D-antistoffer (figur 8B) i kontrollgruppen. I OMP behandlede gruppe, var disse proteiner funnet bare i den første fraksjon. Den tredje fraksjon av kontrollgruppen inne Golgi-komplekset som antydet med β-COP antistoff. Imidlertid, ekspresjon av dette protein ved redusert OMP behandling. Proton-NMR-spektra av disse fraksjonene er vist i figurene 8A og 8C. Figur 8A viser signal oppgavene sammenligne spektrene av disse fraksjoner (kalt F1-F3) til de av iodixanol (Optiprep), og en lysosomal cellefraksjon av ubehandlede celler (F1 *), som ble vasket med PBS en gang etter ultrasentrifugering (i motsetning til fraksjoner F1-F3, som ble vasket to ganger). Iodixanol skjedde i alle fraksjoner, men sank etter vask ultracentrifugates to ganger. Dette peker på delvis inkorporering av iodixanol i membraner eller lumen av organeller. De fleste av de vannoppløselige lavere-molekylære substanser redusert også i F1-F3, slik som laktat og citrat, sammenlignet med F1 *, som peker til en utvasking. Integriteten til organeller ble veryfied ved hjelp av en ekstern standard (tetrachlorethan) for kjemisk skift kalibrering. Det var en pH-avhengig forskyvning av citrate signaler mot forsuring i de lysosomale fraksjoner i forhold til hele cellesuspensjoner.
(A) Overlegg av proton NMR spektrum fragmenter av følgende suspensjoner (fra topp til ned) : ubehandlet først (lysosomal) cellefraksjon etter ultracentrifgation og en vask (F1 *), iodixanole (Optiprep) suspensjon, lavere (F3), i midten (F2) og øvre fraksjon (F1) av ultracentrifugates etter to vasker. De kjemiske skift av spektrene ble kalibrert mot kolin /fosfatidylkolin (Cho /PC) signal. Bortsett fra iodixanol, kunne vi identifisere de PUFA grupper (metylengrupper ligger mellom to CH = CH-grupper), Cho /PC og glycerophosphocholine (GPC) i F1 * og F1-3. Videre kan vi observerte laktat og de metylengrupper av fettsyrer (ved 1,3 ppm), citrat (ved 2,55 og 2,7 ppm) og phosphoethanolamine (ved 3,1 ppm) i F1 *, men ikke i F1-F3-grupper .. (B) Western blot analyse av LAMPE-1, en sen endosom markør, som var nesten identisk fordelt over de to første fraksjoner sammenlignet med Cathepsin-D, i controle gruppe, men oppstod bare i den første fraksjonen i OMP-behandlede gruppe. β-COP som en indikator for Golgi-komplekset, er sterkt funnet i den nedre fraksjon i kontrollgruppen, men meget svakt i OMP-behandlede gruppe. Cathepsin – D, en tidlig endosom markør, som kan finnes i den øvre og midtre del av kontrollgruppen, men angående OMP-gruppen, det ble bare funnet i den første. (E) Overlegg av NMR spektra av alle fraksjoner av kontroll og OMP. Den mest relevante forskjellen er avvenning av GPC-signalet etter OMP behandling i den første fraksjon etter bare 6 timer.
I motsetning til hele cellen spektra (se figur 5B), glycerophosphocholine (GPC) var som finnes i den første (lysosomal) fraksjonen. Når man sammenligner kontrollen til OMP-behandlede gruppe (figur 8C), GPC-signal tydelig svekket ved OMP behandling. Videre ble en økning av flerumettede fettsyrer i OMP-behandlede gruppe bekreftet (figur 8C) analogt med helcelle-spektra. OMP kan ikke bli identifisert i noen av disse fraksjonene og derfor sannsynligvis ikke akkumulere i lysosomer eller i Golgi-komplekset. Dette understreker funn at endosomet og lysosome fraksjoner gikk anabole endringer under OMP behandling (tilsvarende TEM data). Imidlertid Golgi-komplekset som en vesentlig del av lysosomale transportsystemet, er også involvert.
Bestemmelse av autophagic aktivitet
Vi utførte LC3-Western blot-analyse for å påvise endringer i ekspresjonen av LC3 . Den LC3-genekspresjon korrelerer godt med antallet autophagosomes [37], [38]. Videre er to fraksjoner kan vanligvis bli differensiert – LC3-I og LC3-II. De første occures i autophagophores og er ansett som et autofagi induksjon indikator, sistnevnte er inneholdt i autophagosomes og brytes ned, etter deres fusjon med lysosomer, i autolysosomes. [10].
