Abstract
Mir-17-92 klynge av microRNAs er forhøyet i tykktarmskreft, og har en utløsende rolle i kreftutvikling. Av de seks MIR-17-92 klase medlemmer, MIR-19a og b spesielt er viktige arrangører av kreftutvikling og celleproliferasjon, mens foreløpige bevis tyder på at Mir-18a kan handle i opposisjon til andre klyngemedlemmer til å redusere celleproliferasjon. Det ble hypotese at MIR-18a kan ha en homeostatisk funksjon å bidra til å inneholde den oncogene effekt på hele MIR-17-92 klynge, og den forhøyede MIR-17-92 klynge aktivitet uten en tilsvarende økning i MIR-18a kan fremme kolorektal tumorprogresjon. I kolorektal kreft prøver og tilsvarende normal kolorektal slimhinne, vises MIR-18a lavere samlet uttrykk enn andre MIR-17-92 klase medlemmer. MIR-18a ble vist å ha en motsatt rolle til andre MIR-17-92 klyngemedlemmene, særlig de viktigste onkogene mirnas, MIR-19a og b. Transfeksjon av HCT116 og LIM1215 kolorektal kreft cellelinjer med MIR-18a ligner redusert spredning, mens en MIR-18a inhibitor økt spredning. MIR-18a var også ansvarlig for å redusere cellemigrasjon, endre celle morfologi, indusere G1 /S-fasen cellesyklus arrest, økt apoptose, og styrke virkningen av en pro-apoptotiske agent.
CDC42
, en formidler av PI3K veien, ble identifisert som en roman MIR-18a mål. Overekspresjon av MIR-18a redusert
CDC42
uttrykk, og et luciferase assay bekreftet at Mir-18a rettet mot 3’UTR av
CDC42
direkte. MIR-18a etterligner hadde en lignende virkning på proliferasjonen som et lite molekyl inhibitor av CDC42. Hemming av
CDC42
uttrykk er sannsynlig å være en viktig mekanisme som MIR-18a svekker veksten av kreft celler, med et mål beskytter eksperiment avslørende MIR-18a påvirkninger spredning via direkte hemming av
CDC42
. Hemming av
CCND1
av MIR-18a kan også bistå i denne veksten-undertrykkelse effekt. Den homeostatiske funksjon av MIR-18a i MIR-17-92 klyngen i kolorektal kreft celler kan oppnås gjennom undertrykkelse av
CDC42
og PI3K veien
Citation. Humphreys KJ, McKinnon RA Michael MZ (2014) MIR-18a hemmer
CDC42 Hotell og spiller en Tumor lyddemper rolle i kolorektal kreft celler. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10,1371 /journal.pone.0112288
Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA
mottatt: 29 juni 2014; Godkjent: 09.10.2014; Publisert: 07.11.2014
Copyright: © 2014 Humphreys et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Studien ble finansiert av en Flinders Senter for Innovasjon i Cancer Research Grant. Denne studien ble produsert med økonomisk og annen støtte av Kreftrådets SA Beat Cancer Project på vegne av sine givere og staten regjeringen i Sør-Australia gjennom Department of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Brudd normale miRNA uttrykk nivåer oppstår ofte i kolorektal kreft (CRC) utvikling [1]. mirnas, som er små ikke-kodende RNA-sekvenser, kan poste-transcriptionally regulere uttrykket av målgener ved å binde seg til komplementære mål mRNA. De kan holde seg utfyllende mRNA, eller der det er ufullkommen komplementaritet, kan fungere gjennom translasjonsforskning hemming og karakterutskrift destabilisering [2] – [4]. Mens humane svulster er ofte preget av en generell mangel på miRNA produksjon og global miRNA nedregulering [5], [6], en rekke studier har også vist konkrete mirnas å være forhøyet i CRC [1], [7]. Reduserte nivåer av tumor suppressor mirnas, eller over-ekspresjon av onkogene mirnas, bidra til tumorprogresjon ved å endre genekspresjon og å påvirke signalveier [8], [9]. Faktisk har enkelte mirnas vist seg å være driverne for onkogene prosessen, og essensielt for tumorprogresjon [10] – [13].
Et eksempel på en miRNA med en utløsende rolle i kreftutvikling er Mir -17 til 92 klynge av mirnas, som er blitt utpekt oncomir -1 grunn av sin onkogene potensiell [14]. Mir-17-92 klynge, som består av MIR-17, MIR-18a, MIR-19a, MIR-20a, MIR-19b, og MIR-92a, er ofte forhøyet i lymfomer og i solide tumorer, inkludert tykktarmssvulster [1 ], [14] – [17]. Klyngen funksjoner under både normal utvikling og onkogene transformasjon for å fremme spredning og angiogenese, og hemme differensiering og apoptose [11], [12]. mirnas i MIR-17-92 klyngen har også vært forbundet med invasjon og metastasering av CRC celler [18], og med dårligere overlevelse [19]. Klynge har vist seg å koordinere flere onkogene reaksjonsveier, og hemming av disse banene har terapeutisk potensiale for behandling av kreft forårsaket av MIR-17-92 dysregulering [13].
Av de seks MIR-17-92 klynge medlemmer , MIR-19a og b spesielt er viktige arrangører av kreftutvikling og kreftcelle spredning [11], [12], [20]. I CRC celler, har vi tidligere vist at de klyngemedlemmene, MIR-19a og b er ansvarlig for å øke spredning [20]. Flere studier har også vist at MIR-19a og b er nødvendig og stort sett tilstrekkelig for å fremme onkogene egenskapene til klyngen i lymfom modeller [11], [12].
In vivo
, MIR-19 var nødvendig for å fremme lymphomagenesis i en Eμ-myc mus B-cellelymfom modell [11], [12]. MIR-19 over-uttrykk førte til svært ondartet tidlig debut av B-lymfomer, mens deaktivere MIR-19 biogenesis resulterte i forsinket svulst utbruddet, ufullstendig penetrans, og forlenget levetid [12]. Etter MIR-17-92 sletting i lymfom celler, gjeninnføring av MIR-19 alene restaurert vekst og undertrykte apoptose [11].
I motsetning til den pro-proliferativ virkning av MIR-19, tyder foreløpige bevis for at MIR -18a kan handle mot andre klyngemedlemmer til å redusere celleproliferasjon [20]. MIR-18a kan være mindre forhøyet enn andre medlemmer av MIR-17-92 klyngen i tykktarmssvulster [17], og denne relative økningen i andre medlemmer av MIR-17-92 klynge kan favorisere økt spredning. Det er kjent at ulike post-transkripsjonsregulerende mekanismer kan føre til ulike nivåer av enkelte klyngemedlemmer, med MIR-18a det eneste medlemmet av gruppen til å kreve hnRNPA1 for behandling [21]. Den tertiære strukturen til den brettede pri-MIR-17-92 transkriptet kan også bidra til mindre effektiv behandling av MIR-18a [22], [23]. Vi hypotese at MIR-18a kan ha en homeostatisk funksjon å bidra til å inneholde den oncogene effekt på hele MIR-17-92 klynge, og den forhøyede MIR-17-92 klynge aktivitet uten en tilsvarende økning i MIR-18a kan fremme kolorektal tumor progresjon. Denne studien forsøkte å bestemme tumor suppressor egenskapene til Mir-18a i CRC cellelinjer.
Materialer og metoder
Cell kultur
HCT116 tykktarmskreft celler (ATCC, Manassas, VA, USA) ble opprettholdt i McCoys 5A Medium (modifisert) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) inneholder 10% føtalt bovint serum (Bovogen Biologicals, Essendon, VIC, Australia). LIM1215 colorectal carcinoma celler (ECACC, Salisbury, Wiltshire, UK) ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. Cellene ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO
2, opprettholdes på 80% samløpet, og var mycoplasma gratis
prøver
menneske kolorektal vev
CRC prøver og tilsvarende normal. tykktarmsslimhinnen ble hentet fra Flinders Tissue Bank (n = 30). Disse prøvene ble samlet av stump disseksjon av ferske kirurgiske resections etter etikk godkjenning fra den sørlige Adelaide Clinical Menneskelig forskningsetiske komité og skriftlig informert samtykke fra pasientene. Spesifikk studie godkjenning til å undersøke miRNA endringer i denne kolorektal vev ble hentet fra den sørlige Adelaide Clinical Menneskelig forskningsetiske komité (godkjenningsnummer 204,13).
transfections
Cellelinjer ble omvendt transfektert med miRNA etterligner, miRNA hemmere, sirnas, plasmid contructs, og målet beskyttere bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll, i 24 og 96-brønners plate formater (100 000 og 20 000 celler per brønn, henholdsvis). For de etterligner eksperimenter, MIR-18a, MIR-19a og b, og negativ kontroll (NC) miRNA oligonukleotid tomannsboliger (GenePharma, Shanghai, Kina) ble brukt på 20 nM hver. MIR-18a og NC låst nukleinsyre hemmere syre (LNA) (Exiqon, Vedbæk, Danmark) (Idss: 18a: 410101-00, NC: 199004-00) ble brukt på 50 nM. Pre-designet Mission sirnas for
CDC42 plakater (celledeling syklus 42) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (IDS: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) eller en NC siRNA (ID: SIC001) ble omvendt transfektert ved en total konsentrasjon på 20 nM. Kotransfeksjonseksperimenter ble utført med 200 ng plasmid DNA (detaljer av konstruksjoner under) med 50 nm MIR-18a eller NC miRNA etterligner. Tilleggs kotransfeksjonseksperimenter ble utført med 20 nm Mir-18a eller NC miRNA etterligner og med miScript målet beskyttere (Qiagen, Valencia, CA) beregnet for MIR-18a spådd målet genet
CDC42
, eller en negativ kontroll miScript target protector (ID: MTP0000002). Target beskyttere ble laget for de to potensielle Mir-18a bindingssteder i
CDC42
3’UTR ved hjelp av en Qiagen algoritme, og ble omvendt transfektert ved anbefalt konsentrasjon på 500 nM for hvert mål beskytter. Målet protector sammenheng sekvens (området ved 3’UTR flankerer bindingssetet) for første målområde av
CDC42
3’UTR var 5’AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3 «, og for det andre målet stedet av
CDC42
3’UTR var 5’GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 «. Andre mål beskyttere ble utformet for enkelt potensielle Mir-18a bindingssete i
CCND1
3’UTR (kontekst sekvens: 5’TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 «), og eksperimenter ble gjennomført som for
CDC42
ovenfor . Celler ble dyrket i 24-48 timer etter transfeksjon.
Relativ kvantifisering sanntids RT-PCR
TRIzol reagens (Invitrogen) ble anvendt for å lysere dyrkede celler og prøver humane vev. Totalt RNA ble ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop-8000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). miRNA uttrykket analyse ble utført av relativ kvantifisering real-time RT-PCR bruker TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). cDNA ble syntetisert fra 20 ng total-RNA ved hjelp av miRNA-spesifikke primere ifølge fore TaqMan miRNA Assay-protokollen, ved bruk av 3,5 ul masterblanding og 1,5 pl RT primer i et 7,5 ul sluttvolum. Sanntids PCR ble utført i henhold til TaqMan-protokollen, ved hjelp av tre eksemplarer ble 10 ul reaksjoner for hvert biologisk gjengivelse inkludert 1 ul av revers transkripsjon produkt, 0,5 mL miRNA spesifikk primer og probe analyseblanding (assay-ID-er: MIR-17: 002308, MIR-18a: 002422, MIR-19a: 000395, MIR-20a: 000580, MIR-19b: 000396, MIR-92a: 000431), og 1 x TaqMan Universal PCR Master Mix Ingen AmpErase UNG (Applied Biosystems). Termisk sykling ble utført ved hjelp av en Rotor-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, USA). Resultatene ble normalisert i forhold til den endogene small nuclear RNA, RNU6B (analyse ID: 001093). Relative uttrykk nivåer ble beregnet ut fra Ct-verdier ved hjelp Qgene [24].
For mRNA uttrykk analyse, RNA var DNase jeg behandlet, og cDNA ble syntetisert fra 1 mikrogram total RNA ved hjelp av M-MLV revers transkriptase, RNase H minus (Promega, Madison, WI, USA) og tilfeldige heksamerprimere i en 25 ul reaksjon. Real-time PCR ble utført i henhold til Power SYBR Grønn protokollen (Applied Biosystems) med følgende primere for
CDC42
: 5’ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 «(fremover) og 5’GGCACCCACTTTTCTTTCACG3» (bakover) og for
CCND1
: 5’GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 «(fremover) og 5’CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3» (bakover), ved hjelp av tre eksemplarer 20 mL reaksjoner inkludert 2 mL av revers transkripsjon produkt, 300 nM forover og bakover primere, og 1 x Strøm SYBR Grønn mester mix (Applied Biosystems). Resultatene var normalisert forhold til endogen kontroll
ACTB product: (p-aktin) nivåer, ved hjelp av følgende primere. 5’TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 «(fremover) og 5’GCCGATCCACACGGAGTACT3» (bakover), og uttrykk nivåer beregnet ved hjelp Qgene
Western blot analyse
RIPA buffer ble brukt for å få hele celleproteinekstrakter, som ble kvantifisert ved hjelp av en EZQ protein Kvantifisering sett (Invitrogen). Proteinekstrakter ble løst ved SDS-PAGE ved hjelp av pre-cast Mini-protean TGX Flekke-Free Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og elektro-blottet på polyvinylidendifluorid membraner ved hjelp av Trans-Blot Turbo overføringssystem og Mini PVDF Transfer Packs (Bio-Rad). Membranene ble blokkert med 5% bovint serumalbumin eller skummet melk pulver i TBS-T før inkubering over natten med kanin monoklonalt anti-CDC42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Kanin monoklonalt anti-GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase) (D16H11) (1:1000) (Cell Signal Technology) ble anvendt som en kontroll lasting. Sekundær pepperrot peroksidase-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) ble anvendt i forbindelse med den forbedrede kjemiluminescens (ECL) system (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, USA) for å visualisere båndene ved hjelp av ChemiDoc MP avbildningssystem (Bio-Rad). Densitometry resultater ble normalisert til GAPDH nivåer.
Sanntidscellevekst analyse
Celleproliferering ble målt ved hjelp av xCELLigence RTCA DP instrument (ACEA biovitenskap, San Diego, CA, USA). Celler ble sådd på 20 000 celler per brønn av en E-plate og dyrket med passende behandlinger. I tillegg til å transfeksjoner, behandlinger også omfattet bruk av et lite molekyl inhibitor for CDC42 aktivitet, ML141 (Sigma-Aldrich), i en dose på 20 pM, eller en DMSO-bærerkontroll [25], [26]. Veksten ble målt hvert 30. min i løpet av 48-72 timer. Den xCELLigence Systemet ble også brukt til å måle overføringen i overkant av 24 timer ved hjelp av CIM-plate 16 med celler utsådd i serumfritt medium i det øvre kammer ved 30 000 per brønn, og 10% føtalt bovint serum anvendes som lokkemiddel i den nederste kammer. Den Incucyte Kinetic Imaging System (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) ble anvendt som et ekstra tiltak proliferasjon. Celler ble sådd ut på 100 000 celler per brønn i en 24-brønners plate, og avbildes hver time i løpet av 48 timer, med 9-bilder per brønn. De levende celle fase kontrast ble brukt til å beregne samløpet med Incucyte programvare, og å gi morfologi informasjon. I tillegg til den levende celle avbildning, ble cellene også fiksert med formaldehyd ved 48 timer, og cytoskjelettet ble fluorescensmerket farget med Alexa Fluor 488 Phalloidin (Cell Signal Technology) gjennom bindingen av phalloidin til F-aktin, med celler som avbildes ved hjelp av en Olympus BX63 fluorescens mikroskop med 20 × objektiv (Olympus, Center Valley, PA, USA).
caspase apoptose analyser
Apoptose ble målt til 24 timer ved hjelp av en caspase-glo 3/7 assay ( Promega) i henhold til produsentens instruksjoner, med selvlysende signal proporsjonalt med caspase-3/7 aktivitet. Den Incucyte også gitt en ekstra sanntid mål; den CellPlayer Caspase 3/7 reagens (Essen BioScience) ble tilsatt til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 5 pM, og sanntids fluorescerende bilder ble tatt hver time over 24 timer. Disse bildene ble brukt til å beregne fluorescerende legemer, bruker IncuCyte Object Counting v2.0 Analysis programvare. Apoptose ble overvåket etter transfeksjon med miRNA etterligner, med eller uten tilleggsbehandling med den pro-apoptotiske middel natriumbutyrat (Sigma-Aldrich), på 2,5 mM i 24 timer.
flowcytometri
Celler ble høstet med trypsin 48 timer etter transfeksjon, ble vasket med PBS og fiksert med 4% formaldehyd med 20 minutters inkubering på is. Cellene ble vasket med PBS og deretter resuspendert i 0,2% triton X i 1% BSA i PBS-løsning, og inkubert ved romtemperatur i 15 min. Celler ble vasket i 1% saponin vaskeoppløsning med PBS, deretter resuspendert i PBS /propidiumjodid /RNase A og inkubert i 30 minutter, etterfulgt av FACS-analyse ved bruk av en BD FACSCanto II Flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med PI 680/40 filter.
miRNA mål prediksjon
Forut MIR-18a målgener ble oppnådd ved hjelp miRwalk, som sammenstiller data fra flere prediksjon programmer (DIANAmT, Miranda, miRDB, miRWalk, PICTAR5 , pita, RNA22, og Targetscan) [27]. Gener som er felles for tre eller flere prediksjon programmer ble analysert ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, California) for å identifisere gener som er involvert i spredning og cellesykluskontroll, og uttrykkes i kolorektal celler.
Plasmid konstruerer
CDC42
3’UTR (NM_001791.3) ble forsterket ved hjelp av følgende primere: 5’CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 «(fremover) og 5’CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3» (bakover), ved hjelp av
PFU
DNA polymerase (Promega) og oligo dT primet cDNA. Den 3’UTR ble klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega), deretter subklonet inn i psiCHECK-2 vektor (Promega) ved hjelp
NotI
restriksjonsseter, og sekvensert. psiCHECK-2 inneholder Renilla luciferase som en primær reportergen, og ildflueluciferase som en intra-plasmid transfeksjon normalisering reporter.
CDC42
3’UTR ble klonet inn i det multiple klonings region plassert nedstrøms for den Renilla translasjons-stoppkodonet, med binding av miRNA til 3’UTR forutsagt å resultere i spaltning og etterfølgende nedbrytning av mRNA-transkriptet fusjon. Redusert Renilla luciferase aktivitet ble brukt som en indikator på miRNA aktivitet.
Mutagenese
Nettstedet dirigert mutagenese ble utført ved hjelp av QuikChange Lightning seterettet mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ), i henhold til produsentens instruksjoner, slette MIR-18a frø sekvensbindingsseter i
CDC42
3’UTR. Primere for første målområde av
CDC42
3’UTR (posisjon 822-844 av NM_001791.3) var: 5’CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 «(fremover) og 5’AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3» (revers). Primere for andre mål området av
CDC42
3’UTR (posisjon 1295-1317 av NM_001791.3) var: 5’AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 «(fremover) og 5’CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3» (revers). Plasmider ble forberedt med bare det første området mutert, bare det andre området mutert, eller begge steder mutert.
Luciferase assay
Etter kotransfeksjonen med psiCHECK-2 plasmid konstruerer og miRNA etterligner, luciferase -aktiviteten ble målt etter 24 timer, ved bruk av dual-luciferase-assay kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Renilla luciferase-aktiviteten ble normalisert til ildflueluciferase aktivitet for det samme plasmid.
Statistisk analyse
Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM) av minst tre biologiske replikater, med grafer utarbeidet etter GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). Statistiske analyser ble utført ved hjelp av t-test, med en P-verdi. 0,05 ansett som signifikant
Resultater
MIR-18a har lavere samlet uttrykk sammenlignet med andre MIR-17-92 klase medlemmer i kolorektal celler
Menneskelige vev bank prøver ble brukt for å undersøke MIR-18a nivåer i CRC og normal kolorektal slimhinne, i forhold til nivåer av andre MIR-17-92 klase miRNAs. MIR-17-92 klase mirnas nivåer ble kvantifisert i tidlig (Dukes A) og avansert (Dukes C) CRC prøver, og tilsvarende normal kolorektal slimhinne. MIR-17-92 mirnas ble forhøyet i CRC prøver (Dukes A: Mir-17 P = 0,01, MIR-18a P = 0,01, MIR-19a P = 0,005, MIR-20a P = 0,002, Mir-19b P = 0,009, MIR-92a P = 0,07; Dukes C: Mir-17 P = 0,0003, MIR-18a P = 0,0005, MIR-19a P = 0,0009, MIR-20a P 0,0001, Mir-19b P = 0,001, MIR-92A P = 0,0007) sammenlignet med matchet normalt vev, og hadde høyere uttrykk i Dukes C prøvene (figur 1A og 1B). MIR-18a hadde lavere samlet uttrykk sammenlignet med andre MIR-17-92 klase medlemmer, både i Dukes A og C prøver, og i den matchende normalt vev (figur 1A og 1B).
(A) MIR -17 til 92 klase miRNA nivåer i Dukes A og tilstøtende prøver normalt vev (B) MIR-17-92 klynge miRNA nivåer i Dukes C og tilstøtende prøver normalt vev. Gjennomsnitt ± SEM av 30 pasienter er vist og uttrykk er normalisert til RNU6B. * P. 0,05
MIR-18a modulerer kolorektal kreft celle vekst og død
Transfeksjon av HCT116 CRC celler med MIR-18a ligner ført til redusert spredning over en 48 timers periode , sammenlignet med de NC ligne transfekterte celler (P 0,0001) (figur 2A). En tilsvarende anti-proliferativ effekt for MIR-18a ble observert i ytterligere CRC-cellelinje, LIM1215 (P = 0,0009) (figur 2B). Transfeksjon av HCT116-celler med en MIR-18a LNA miRNA inhibitor hadde motstander effekt, med økt spredning over en 48 timers periode sammenlignet med NC-hemmer transfekterte celler (P = 0,03) (Figur 2C). HCT116-celler transfektert med MIR-18a etterligner viste en redusert evne til å migrere over en 24 timers periode, sammenlignet med de NC ligne transfekterte celler (P = 0,004) (figur 2D).
Cell indeksmålinger ved hjelp av xCELLigence RTCA DP instrument. (A) spredning av NC og MIR-18a ligne transfektert HCT116-celler i løpet av 48 timer. (B) Spredning av NC og MIR-18a ligne transfektert LIM1215 celler i løpet av 48 timer. (C) Spredning av NC og MIR-18a hemmer transfektert HCT116-celler i løpet av 48 timer. (D) Migrasjon av NC og MIR-18a ligne transfektert HCT116 cellene over 24 t. Gjennomsnitt ± SEM for 6 cellekultur replikater er vist for hver. * P. 0,05
Transfeksjon med MIR-18a ligner også ut til å endre celle morfologi. Real-time bilder tatt i løpet av 48 timer avslørte at HCT116-celler transfektert med MIR-18a ligner var mer avrundet og mindre tilhenger, med et redusert nivå av samløpet (P 0,001) (figur 3A og 3B). Tilsetting av MIR-19a og b ligner stor grad reversert denne effekten. Celler transfektert med MIR-19a og b i tillegg til MIR-18a var nærmere i utseende til NC ligne transfekterte celler, med en mer utvidet morfologi, i tillegg til lignende confluence nivåer i løpet av 48 timer (p = 0,20); Confluence nivåer betydelig økt i disse cellene sammenlignet med cellene transfektert med MIR-18a ligne alene (P 0,001) (figur 3A og 3B). Immunofluorescent analyse av aktin del av cytoskjelettet bruker Alexa Fluor 488 Phalloidin understreket også endret cellemorfologi i Mir-18a ligne transfekterte HCT116-celler, inkludert en mer avrundet utseende med redusert intercellulær adhesjon (Figur 3C).
sanntids~~POS=TRUNC bilder ved hjelp av Incucyte instrument. (A) Representative bilder av NC, MIR-18a etterligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfekterte celler i 48 timer etter transfeksjon. (B) Confluence kvantifisert fra sanntidsbilder av NC, MIR-18a etterligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfekterte celler på 48 timer. Gjennomsnitt ± SEM for 6 cellekultur replikater er vist. * P 0,05. (C) Representative bilder (20 ×) av Alexa Fluor 488 Phalloidin fluorescerende farging av aktin cytoskjelettet av NC og MIR-18a ligne transfekterte celler i 48 timer etter transfeksjon.
For å måle apoptose, en caspase 3/7 endepunkt analysen ble utført 24 timer etter transfeksjon av HCT116-celler. Transfeksjon med MIR-18a ligner økt apoptose sammenlignet med NC ligne transfekterte celler (P = 0,04), mens kotransfeksjonen med MIR-19a og b ligner redusert apoptose sammenlignet med MIR-18a ligner alene, til et nivå som ligner på NC ligne transfektert celler (P = 0,16) (figur 4A). Transfeksjon med MIR-19a og b ligner alene hadde ingen virkning på apoptose. Tilsetting av MIR-18a ligner også forbedret handling av en kjent pro-apoptotiske agent. HDAC-inhibitorer, så som vinylbutyrat, har tidligere blitt vist å indusere apoptose i CRC-celler [28] – [30]. Celler transfektert med MIR-18a etterligner sammen med 2,5 mM butyrat behandling hadde høyere nivåer av apoptose etter 24 timer sammenlignet med de NC ligne transfekterte celler også behandlet med butyrat (P = 0,001) (figur 4A). Igjen, transfeksjon av MIR-19a og b ligner med Mir-18a ligner redusert denne effekten, sammenlignet med de MIR-18a ligner alene (p = 0,03), selv om apoptose var fortsatt høyere enn med NC ligner (P = 0,03) ( Figur 4A). Effekten av MIR-18a på apoptose ble videre undersøkt i sanntid, ved hjelp av Incucyte system og en fluorescerende caspase 3/7 assay for å oppnå bilder av celler som gjennomgår apoptose. Når HCT116-celle bildene tatt 24 timer etter butyrat behandling ble kvantifisert, var det signifikant flere fluorescerende celler med MIR-18a mimic transfeksjon sammenlignet med NC etterligner transfeksjon i celler uten behandling (P 0,001), og i celler behandlet med 2,5 mM smørsyre (P 0,001) (Tall 4B og 4D). En lignende effekt ble observert i LIM 1215 celler, med forskjeller i fluoriserende celletall mellom MIR-18a ligne og NC ligne transfeksjon rekkende betydning 48 timer etter smørsyre behandling (P = 0,03 i celler uten behandling; P = 0,02 i celler behandlet med 2,5 mM smørsyre) (Figur 4C).
(A) caspase 3/7 lysende analysen i NC, MIR-18a etterligne, MIR-19a og b ligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfektert HCT116 cellene ved 24 timer etter butyrate tillegg. Gjennomsnitt ± SEM av tre cellekultur replikater er vist. * P 0,05. (B og D) Kvantifisering og representative sanntid fluorescerende celle bilder ved hjelp av Incucyte instrument som viser apoptose i NC og MIR-18a ligne transfektert HCT116 cellene 24 timer etter smørsyre tillegg. Gjennomsnitt ± SEM av tre cellekultur replikerer er vist i B. (C) Kvantifisering av sanntids fluorescerende celle bilder ved hjelp av Incucyte instrument som viser apoptose i NC og MIR-18a ligne transfekterte LIM1215 celler på 48 timer etter smørsyre tillegg. Gjennomsnitt ± SEM av tre cellekultur replikater er vist. (E) Flowcytometri analyse av NC, MIR-18a etterligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfekterte HCT116 cellene ved 48 timer etter transfeksjon; hver graf representant for tre cellekultur replikerer.
Flowcytometri ble utført 48 timer etter transfeksjon av HCT116 cellene, og viste også en opphopning av celler gjennomgår celledød eller apoptose i Mir-18a ligne transfekterte celler (Figur 4E). Mir-18a ligner ble vist å indusere G1 /S-fasen cellesyklus arrest. Tilsetting av MIR-19a og b ligner resulterte i redusert celledød og cellesyklus arrest enn med MIR-18a ligne alene (Figur 4E).
Uttrykk av cellesykluskontroll genet CDC42 er redusert med MIR-18a og økte med MIR-19a og b
Gitt de funn som MIR-18a reduserer spredning og migrasjon, endrer celle morfologi, øker apoptose, og induserer cellesyklus arrest, spådde MIR-18a målene ble identifisert som er involvert i disse cellulære prosesser. Blant MIR-18a spådd mål var celledeling syklus 42 (
CDC42
), som ble spådd av flere mål prediksjon programmer. CDC42 er medlem av Rho familien av GTPases, en familien av Ras super små GTPases [31]. Ved aktivering, er CDC42 stand til å binde en rekke forskjellige effektor proteiner og sette i gang en rekke nedstrøms signalveier, inkludert de som er involvert i cytoskeletal remodellering, cellesyklusprogresjon, celleproliferasjon, overlevelse og migrasjon [32] – [37]. Det er flere varianter av transkript
CDC42
, som koder for et kanonisk isoform til stede i de fleste vev (isoform 1), og en hjerne-spesifikk isoform (isoform 2). Den 3’UTR av transkripsjoner for den kanoniske isoform inneholder to spådd MIR-18a bindingsseter, mens den alternative 3’UTR av transkripsjon for hjernen isoform inneholder to forskjellige spådd MIR-18a bindingssteder. For hensikten med denne studien i kolorektal celler,
CDC42
isoform 1 ble undersøkt.
Transfeksjon av HCT116 CRC celler med MIR-18a ligner reduserte transkripsjonsnivåer av
CDC42
sammen med NC ligne transfekterte celler i 48 timer, da oppdaget av real-time RT-PCR (P 0,0001) (figur 5A). Overraskende, co-transfeksjon av MIR-19a og b ligner sammen med MIR-18a ligner produsert motsatt effekt, med økt
CDC42
mRNA nivåer som var betydelig høyere enn både NC ligne celler (P = 0,0006) og Mir-18a ligne transfektert celler (P 0,0001) (figur 5A). Transfeksjon med en MIR-18a inhibitor økt transkripsjonsnivåer av
CDC42
sammenlignet med NC ligne transfekterte celler i 48 timer, da oppdaget av real-time RT-PCR (P 0,005). (Figur 5B)
(A)
CDC42
mRNA nivåer i NC, MIR-18a etterligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfekterte celler i 48 timer etter transfeksjon (B)
CDC42
mRNA nivåer i NC og MIR-18a hemmer transfekterte celler på 48 timer etter transfeksjon. Gjennomsnitt ± SEM for 6 cellekultur replikater er vist for hver og uttrykk er normalisert til ACTB. * P 0,05. (C og D) Western blot av CDC42 protein nivåer i NC, MIR-18a etterligne, og MIR-18a, 19a og b ligne transfekterte celler i 48 timer etter transfeksjon. Densitometry grafen viser gjennomsnitt ± SEM av tre cellekultur gjentak for hver og uttrykk er normalisert til GAPDH * P. 0,05
Western blot analyse viste CDC42 protein nivåer ble også betydelig redusert i MIR-18a ligne transfekterte celler sammenliknet med de NC ligne transfekterte celler, etter 48 timer (p = 0,02) (Figur 5C og 5D). Co-transfeksjon av MIR-19a og b ligner med Mir-18a ligner økt proteinnivå sammenlignet med MIR-18a ligner alene (p = 0,008), med nivåer nærmere at av NC ligne transfekterte celler (P 0,05) (figur 5C og 5D).
MIR-18a rettet mot 3’UTR av direkte CDC42
En luciferase assay system ble brukt til å bestemme at MIR-18a retter seg direkte på
CDC42
3 «UTR. Dual-luciferase reporter plasmider ble konstruert med en intakt
CDC42
3’UTR, eller med
CDC42
3’UTRs mutert på første, andre eller begge spådd MIR-18a bindingsseter (figur 6A). HCT116-celler ble transfektert med hvert plasmid, i forbindelse med MIR-18a eller NC etterligner, og Firefly og Renilla luciferaseaktivitet ble målt ved 24 timer. En reduksjon i normalisert Renilla luciferaseaktivitet ble brukt som en indikator på MIR-18a-binding og undertrykkelse.
