Abstract
ERG genet rearrangements finnes i omtrent halvparten av all prostatakreft. Funksjonelle analyser ikke fullt ut forklare den selektive trykket forårsaker ERG omorganisering under utviklingen av prostatakreft. Å identifisere transkripsjons endringer i prostata kreft, inkludert tumorer med ERG genet rearrangements, utførte vi en meta-analyse på publiserte genekspresjonsdata fulgt av valideringer på mRNA og protein nivåer samt første funksjonelle undersøkelser. Åtte ekspresjonsstudier (n = 561) på humane prostata-vev ble inkludert i meta-analyse. Transkripsjonelle endringer mellom prostatakreft og ikke-kreft prostata, samt ERG omleiring-positive (ERG +) og ERG omleiring-negative (ERG-) prostatakreft, ble analysert. Detaljerte resultater kan nås gjennom en online database. Vi validert vår meta-analyse ved hjelp av data fra vår egen uavhengige mikromatrisestudie (n = 57). 84% og 49% (fold-endring 2 og 1.5, henholdsvis) av alle transkripsjons endringer mellom ERG + og ERG- prostatakreft bestemmes av meta-analyse ble bekreftet i valideringsstudien. Valgte målene ble bekreftet av immunhistokjemi: NPY og PLA2G7 (oppregulert i ERG + kreft), og AZGP1 og TFF3 (nedregulert i ERG + kreft). Første funksjonelle undersøkelser for en av de mest fremtredende ERG omorganisering assosierte gener – nevropeptid Y (NPY) – avslørte økt glukoseopptak
in vitro
indikerer potensielle rolle NPY i å regulere cellenes stoffskifte. I sammendraget, fant vi robuste befolknings uavhengig transkripsjons endringer i prostatakreft og første tegn på ERG rearrangements induserer metabolske endringer i kreftcellene ved å aktivere viktigste metabolismesignalmolekyler som NPY. Vår studie viser at metabolske forandringer muligens bidra til seleksjonspress favoriserer ERG rearrangements i prostatakreft
Citation. Massoner P, Kugler KG, Unterberger K, Kuner R, Mueller LAJ, Fälth M, et al. (2013) Karakterisering av Transkripsjon Endringer i ERG Omorganisering-positiv Prostate Cancer Identifiserer Regulering av metabolske Sensorer Slik som Neuropeptide Y. PLoS ONE 8 (2): e55207. doi: 10,1371 /journal.pone.0055207
Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA
mottatt: 28 august 2012; Godkjent: 27 desember 2012; Publisert: 04.02.2013
Copyright: © 2013 Massoner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne økonomisk støtte fra Comet senter Oncotyrol (Prosjekt 3.1), den autonome provinsen Bolzano, Syd-Tirol, (Grant 37 /40,3), den østerrikske Science Fund FWF (Grant J3201), og tyrolsk forskningsfond. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: etter å ha diskutert med Oncotyrol , Senter for personlig Cancer Medicine GmbH, vil forfatterne å opplyse om følgende: PM, KU og HK gjennomførte dette arbeidet som ansatte /medarbeidere av Oncotyrol GmbH. Arbeidet til dette prosjektet ble delfinansiert av Oncotyrol GmbH i sammenheng med den østerrikske COMET finansieringsprogram. Oncotyrol GmbH planlegger ikke å sende inn en patent eller kommersielt forfølge resultatene som finnes i dette manuskriptet. Følgelig ingen konkurrerende interesse kan identifiseres i sammenheng med den beskrevne arbeid. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Om halvparten av all prostatakreft havn en gen omorganisering [1]. Den sistnevnte er dannet ved sammensmelting av 5 «regulatoriske elementer i en androgen-regulert gen til den kodende regionen av et medlem av den E tjueseks (ETS) genet familie av transkripsjonsfaktorer.
ETS
rearrangements resultere i androgen-drevet over-uttrykk for ETS transkripsjonsfaktorer [1]. Den vanligste ETS omorganisering er trans av androgen-regulerte trans protease serin 2 (
TMPRSS2
) genet, med v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog genet (
ERG
) transkripsjonsfaktor står for ca 85% av alle ETS omorganisering-positive prostatakreft [2] – [4]. ERG omorganisering er en tidlig hendelse i tilblivelsen av prostatakreft. Det er allerede til stede i lokal lav grad av prostatacancer [5], [6] og vedvarer i metastatiske og kastrerings-resistente typer (CRPC) [1], [4], [7]. Den tidlige utseende og den høye frekvensen av ERG rearrangementer indikere den selektive fordelen av omleirings-positive celler i prostata kreft.
Funksjonelle analyser utført hittil ikke har gitt en fullstendig forklaring for selektiv trykkforandrings ERG omleiring i tidlige stadier av prostatakreft. ERG omorganisering resultater i ERG overekspresjon [1]. Sistnevnte ble rapportert å fremme kreftcellemigrering og invasjon, så vel som cellulære dedifferentiation og transformasjon [8] – [11]. Rollen ETS omorganisering i utviklingen av prostatakreft har heller ikke avklart. Mens noen studier tyder på en sammenheng mellom omorganisering-positive kreftformer, mer aggressive svulster og en dårlig prognose (dvs. [12] – [14]), andre rapporterer ingen slik sammenheng (dvs. [15] – [17]); noen selv rapporterer en gunstig prognose (dvs. [18], [19]). Vi trenger åpenbart mer informasjon om ETS omorganisering-positive prostatakreft for å forstå biologien til prostatakreft.
En stor mengde av genuttrykk data har blitt publisert siden prosedyren uttrykk analyse ved hjelp av mikromatriser ble etablert for mer enn ti år siden [20]. Disse studiene har rapportert om en rekke endringer i genuttrykk forbundet med ulike sykdommer, inkludert prostatakreft. Validering av den store mengden av data innhentet fra genuttrykk eksperimenter er utfordrende. Bare et fåtall av de identifiserte kandidater har vært funksjonelt validert. Disse dataene er langt fra uttømmende og fortsatt inneholde mye informasjon avventer utnyttelse. Meta-analyser tillater kombinert analyser av individuelle studier, er mindre påvirket av lokale funn, og at reduksjon av data for å oppnå robuste resultater.
Vi presenterer en meta-analyse på publiserte genuttrykk data med sikte på å identifisere transkripsjonen endringer i prostatakreft. Vår tilnærming inkludert sammenligning av prostatakreft versus godartet prostatavevet, og ERG omorganisering-positive (ERG +) til ERG omorganisering-negative (ERG-) prostatakreft. Vi validert resultatene av vår meta-analyse ved hjelp av data fra en uavhengig mikromatrisestudie og bekreftet utvalgte mål ved immunhistokjemi. Vi utførte også foreløpige funksjonelle undersøkelser for en av de mest fremtredende regulerte gener, nemlig nevropeptid Y (NPY). Våre resultater indikerer at ERG-rearrangements muligens indusere metabolske endringer i kreftcellene ved å aktivere store metabolske signalmolekyler som NPY.
Materialer og metoder
Eksempel kohorter
Vevsprøver brukt for meta-analysen er beskrevet andre steder (studier og referanser i tabell 1). Vevsprøver for validering uttrykk studien og immunhistokjemiske studier ble valgt fra Innsbruck prostatakreft biobank. Dette biobank ble etablert i løpet av Tyrolean tidlig deteksjon program for prostatakreft ved Institutt for Urologi, Innsbruck Medical University [21]. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter og dokumenteres i databasen ved Universitetssykehuset Innsbruck i overensstemmelse med lov og kravene til etikk komité av Innsbruck Medical University. Studien ble godkjent av etisk komité i Innsbruck Medical University (studie no. AM 3174, endring 2). Kohorter analysert her var følgende: a) Expression analyse valideringsstudie; 57 prostata kreft vev; GSC 5 n = 1, GSC 6 n = 5, GSC 7 n = 36, GSC 8 n = 3, GSC 9 n = 11, GSC 10 n = 1; pasientenes alder, gjennomsnitt ± standardavvik (SD), 61,7 ± 6,9 år; pasientenes serum prostata spesifikt antigen (PSA) nivå, 7,4 ± 5,0 ng /ml. b) Immunhistokjemisk undersøkelse; 93 prostata kreft vev, GSC 5 n = 19, GSC 6 n = 22, GSC 7 n = 32, GSC 8 n = 10, GSC 9 n = 10; pasientenes alder, gjennomsnitt ± standardavvik (SD), 60,6 ± 6,4 år; PSA-nivå, 6,6 ± 5,4 ng /ml.
Meta-analyse
Vi valgte åtte uttrykk studier, som består av 561 menneskelige prostata vev, for meta-analyse (tabell 1, figur S1). Disse er listet opp i databaser Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [22], Array Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) [23] og Oncomine (https://www.oncomine.org) [24]. Alle studiene ble utført ved hjelp av Affymetrix microarray teknologi.
For integrerende analyse av microarray data, rådata, som er lagret i CEL filer, ble normalisert ved hjelp gcRMA algoritme [25], [26]. For detaljert informasjon om studiespesifikke data forbehandling, se utfyllende metoder. For å utføre en kryss-studie sammenligning av genekspresjon nivåene ble plattformspesifikke gen probe-sett identifikatorer tilordnet en felles navnerom, som tidligere beskrevet [27], [28]. Her plattformspesifikke identifikatorer ble kartlagt til Entrez genet identifikatorer med de aktuelle probeset /Entrez kartlegginger fra BioMart via biomaRt pakken [29]. Der det er mer enn en probe-sett ble kartlagt til et Entrez gen identifikator, ble sonden-sett med høyest varians ble brukt til analysen. For å identifisere differensielt regulerte gener vi brukte en to-trinns tilnærming. Først hentet vi kombinerte p-verdier på tvers av studier med Fisher inverse chi-kvadrat-metoden [30]. Vi beregner deretter kombinert (vektet) Brett endringer. I en tidligere studie, forfatterne brukt en permutasjon test for å vurdere betydning [27]. Vi, på den annen side, avledet informasjon fra en khikvadratfordeling som foreslått i [31]. Se utfyllende metoder for detaljer om p-verdier og brett-change beregninger. Funksjonell merknad clustering av resultatene av meta-analyse ble utført ved hjelp av DAVID database (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [32].
Validering Expression Analysis
En uavhengig microarray datasett (GSE32571) tidligere generert av medforfatterne ble brukt til validering av ERG-assosierte genet signatur. For de foreliggende analyser, ble prostata kreftvev (n = 57) som er tilordnet gruppene ERG + og ERG- ved hjelp av en pause fra hverandre fluorescerende in situ hybridisering (FISH) assay som tidligere beskrevet [33]. Vevsprøver ble isolert ved macrodissection fra 10-um frysesnitt. Total RNA ble isolert med EZ1 RNA Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner, sjekket for kvalitet ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), og kvantifisert. Total RNA ble dannet for hybridisering på Illumina Menneskelig Sentrix-12 BeadChip arrays (Illumina) i henhold til produsentens anbefalinger. Illumina microarray data ble behandlet ved hjelp av åpen kildekode-rørledningen «Lumi» [34]. Etter quantile normalisering, ble differensial uttrykket av gener bestemmes ved hjelp av R-pakken «LIMMA» [35]. Detaljerte metoder og kliniske data av uttrykket valideringsstudie er beskrevet andre steder [36]
Immunohistochemistry
Tissue lysbilder (n = 10) og microarray (TMA;. N = 92; diameter 0,6 mm ) inneholdende kreft (n = 3) og godartet (n = 1) kjerner av prostatavev fra prostatakreftpasienter ble anvendt for immunhistokjemisk analyse. Alle vevsprøver ble farget for ERG. Ni prøver ble ekskludert på grunn av sin lille mengde svulstvev. 24 vev viste veldig svak eller heterogen ERG flekker, mens 69 vev med middels til sterk eller negativ ERG farging ble tildelt gruppene ERG + og ERG- hhv. 61 vevsprøver ble brukt til immunhistokjemisk sammenligning av ERG + og ERG-. Antigen henting og immunhistokjemi ble utført ved hjelp av en Discovery XT automatisert slide-farging system (Ventana Medical Systems). Alle mål antistoffer ble testet på en test vev microarray som inneholder forskjellige menneskelige vevsprøver. Immunhistokjemisk farging ble evaluert av en erfaren uropathologist (G.S.). Optimale antigen gjenfinning forholdene ble etablert for alle målgrupper antistoffer. Target antistoffer, leverandører, artikkelnumre, og konsentrasjoner som ble brukt var som følger: anti-AZGP1, Sigma, HPA-012582, 01:50; anti-ERG, Epitomics, EPR3864, 1:100; anti-GPR116, IMGENEX, IMG-71635, 1:100; anti-nevropeptid Y, Abcam, ab30914, 1:200; anti-PLA2g7, Sigma, HPA-0035915, 1:400; anti-HPGD, Atlas, HPA004919, 1:75; anti-TFF3, Strategiske Diagnostics, 29940002, 1:5000. Antigen gjenfinning for alle antistoffer ble utført ved varme-behandling ved 98 ° C i 1 time i CC1, en tris-basert buffer med en svakt basisk pH. Target antistoffer ble inkubert i 1 time ved 37 ° C, etterfulgt av iView DAB deteksjon (diaminobenzidine visualisering, Ventana Medical Systems) og hematoxylin kontra. Bilder ble ervervet ved hjelp av en Axio Imager M1 mikroskop (Zeiss) og TissueFAXS programvare (TissueGnostics). Kvantitativ immunhistokjemisk analyse ble utført ved hjelp av HistoQuest immunhistokjemi analyseprogramvare (TissueGnostics), som er en cellebasert fargeintensitet analyseverktøyet som anvender en kjernefysisk celleidentifikasjon markør (i dette tilfellet hematoksylin), etterfulgt av kvantitativ analyse av en gitt markør-merket i en annen farge (i dette tilfellet cytoplasmatic farging med diaminobenzidine, DAB, brunt).
Cell Kultur Eksperimenter
DU145, DUCaP, LNCaP, PC3 og Vcap er derivater av prostata kreft metastaser. Disse ble kjøpt fra ATCC og dyrket i henhold til ATCC anbefalinger. EP156T og RWPE-en er udødeliggjort godartede prostata epitelceller, mens CAF og PM151T er prostata stromale celler [37] – [39]. Benigne og stromale celler ble dyrket som beskrevet tidligere [37] – [39]. Identiteten av kreftcellelinjer ble bekreftet ved rettsmedisinske DNA fingerprinting fremgangsmåter som anvender den AmpFlSTR® SGM Plus® PCR-amplifikasjon kit (Applied Biosystems).
Cellene ble sådd ut i 24-brønners plater, serumsultede, og behandlet med 25 nM rekombinant NPY /24 timer (Sigma) for en total periode på 48 timer. Totalt celle tall ble bestemt ved hjelp av casy celleteller og analysesystem (Scharfe System). Blodsukkeret ble målt i cellekultursupernatanter bruker Gluc Cell glukose overvåking system (Thermo Fisher Scientific). qPCR og immunoblot ble utført som beskrevet tidligere [40]
statistikker og
Statistiske beregninger for meta-analyse og validering ekspresjon analyse ble utført ved bruk av R (http:. //www.r-project .org), pakker fra Bioconductor åpen kildekode bioinformatikk database [41] og funksjoner av fru [42].
Statistiske beregninger for immunhistokjemi og cellekultur eksperimenter ble utført ved hjelp av SPSS 18 for Windows. Den Kolmogorov-Smirnov test ble brukt for å undersøke normal distribusjon av datasett. Ikke-normalfordelt data og data med gauss (normal) fordeling ble analysert ved anvendelse av Mann-Whitney U-test og t-test, henholdsvis, for å beregne betydningen av forskjeller mellom gruppene. P-verdier under 0,05 ble betraktet som signifikant. Feil barer i histogrammet representerer standardavvik (SD) av minimum tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
Meta-analyse på Publisert Gene Expression Data for prostatakreft
for å undersøke endringer i genuttrykk i menneskelige prostata kreft, utførte vi en meta-analyse av publiserte genuttrykk data. Åtte uavhengige microarray studier ble inkludert i meta-analysen, som besto av 561 prostata vevsprøver (tabell 1). Følgende to spørsmål ble undersøkt: a) sammenligning av genuttrykk i prostata kreft vev og godartet prostata vev; og b) sammenligning av genuttrykk i ERG omorganisering-positive (ERG +) og ERG omorganisering-negative (ERG-) prostatakreft (studie plan i figur 1).
Meta-analyse ble utført på åtte uavhengige genekspresjon studier som fokuserer menneskelige prostata vev. ble brukt to typer komparative analyser. Gener som viser forskjellig regulert ERG + og ERG- prostata kreft vev ble validert ved hjelp av en uavhengig analyse av genuttrykk (første validering) og immunhistokjemisk farging (andre validering, bare for utvalgte gener).
Resultatene fra vår meta -analysemetoder er vist i figur 2A-B, og oppført i tabell S1 A-B. Resultater fra meta-analysen og de enkelte studier kan også sees online på https://prostatedb.eigenlab.net/. I tillegg til den mindre konservative Chi-kvadrat-metoden, som vi har anvendt for å utlede en oppsummering p-verdi [31], viser databasen også en mer konservativ Sammendrag p-verdi utledet ved en permutational tilnærming [27].
Genes differensielt regulert på prostatakreft og godartet prostatavevet (A, C), og ERG + og ERG- prostata kreftvev (B, D). A-B) vulkan plott. Differentially regulerte gener ble fremhevet når minst to ganger ned- (grønn) eller oppregulert (rød), og hadde en justert p-verdi mindre enn 0,1. C-D) Grafisk diagram av de åtte topprangerte funksjonelle grupper bestemt av funksjonell annotering clustering, ved hjelp av DAVID database. Størrelsen av klyngene korrelerer med antall identifiserte proteiner forbundet med funksjonell annotering (fold-endring 1,5). Når proteiner er til stede i mer enn en klynge, er klasene forbundet ved hjelp av linjer. Tykkelsen av forbindelseslinjene reflekterer antall proteiner som er tilstede i begge koblet klynger. Data om 561 vevsprøver ble brukt for meta-analyse.
Vi først sammenlignet prostata kreft vev med godartet prostata vev. Med hensyn til gener, som var minst 1,5 ganger regulert og avslørte en justert p-verdi under 0,1, fant vi at 280 gener ble oppregulert (46 av dem mer enn to ganger), mens 275 gener var nedregulert (36 mer enn to ganger) i prostata kreft vev sammenlignet med benign prostata vev (figur 2A, Tabell S1 A). Funksjonell merknad avslørte at differentially regulerte gener (fold-endring 1,5) kode for signalmolekyler (trans-membran og ekstracellulære signalproteiner), strukturelle proteiner (cytoskjelett og celleadhesjonsprosesser proteiner) og proteiner som er involvert i proteolyse og sårheling (figur 2C) . Proteiner som er kjent for å være forbundet med prostatakreft (f.eks AMACR [43], AGR2 [44], CRISP3 [45], HPN [46], HOXC6 [47], OR51E2 [48]), så vel som proteiner som ikke er forbundet med prostatakreft dermed langt (eksempler PPM1H, SLC4A4, CAMKK2) ble identifisert i meta-analysen.
Vi deretter sammenlignet ERG + og ERG- prostata kreft vev. Ingen informasjon var tilgjengelig om ERG omorganisering status for prostatakreft prøvene som brukes i studier av meta-analyse. ERG omorganisering fører til ERG over-ekspresjon og er observert i omtrent 50% av alle prostata kreftvev [1], [3]. Vi delte alle prostata kreft prøver av studiene som inngår i meta-analysen inn i tre grupper, basert på deres ERG uttrykk nivå: ERG overekspresjon-positive prøver, ERG mellomprøver og ERG overekspresjon-negative prøver (Figur S2). Hver gruppe besto av en tredjedel av alle prøver av en undersøkelse. ERG overekspresjon-positive prøver ble antatt å være ERG omordning-positive og overdratt til ERG + kategori, mens overekspresjon ERG-negative prøver ble antatt å være ERG omordning-negative og tildelt ERG- kategorien. Prøver tilordnet ERG mellom gruppen ble ekskludert fra analysen for å sikre nøyaktig sammenligning av ERG + og ERG- prostatakreft prøver. Bruken av ERG ekspresjon som et surrogat for gen-omleiring-status er blitt beskrevet tidligere [49] og ble bekreftet i vår egen mikromatrise undersøkelse som beskrevet nedenfor. Den komparative meta-analyse viste 109 oppregulert og 58 nedregulert gener (fold-endring 1,5; justert p-verdi 0,1; 36 gener var mer enn 2 ganger regulert) i ERG + i forhold til ERG- prostata kreft (figur 2B, tabell S1B). Differentially regulerte gener ble knyttet til de funksjonelle klynger signal (ekstracellulære signal peptider og hormoner signalisering), adhesjon (celle adhesjon og ekstracellulære matrix proteiner), og forsvars respons (sårheling og betennelsesreaksjon, figur 2D).
meta-analyse viste endringer i genuttrykk i ulike undergrupper under utviklingen av prostatakreft. En rekke studier som omfatter uavhengige pasient kohorter ble inkludert i analysen. Derfor de identifiserte endringer i genuttrykk betegne generelle befolkningsuavhengig effekter knyttet til prostatakreft.
Meta-analyse validering av Independent Expression Analysis
Vi deretter validert resultatene av vår meta-analyse. Vi fokuserte på en sammenligning av ERG + og ERG- prostatakreft fordi disse subtypene ble beskrevet nylig og har ikke blitt grundig undersøkt så langt. For validering av meta-analysen vi brukte data fra en uavhengig uttrykk undersøkelse utført på et alternativ uttrykk plattform (Illumina). Valideringsstudien skiller seg fra de meta-analyse studier i følgende aspekter: a) uavhengig pasient kohort (n = 57) er valgt fra Innsbruck prostatakreft biobank; b) alternativ genekspresjonsteknologi (valideringsstudie, Illumina BeadChip arrays, meta-analyse studier, Affymetrix Genechip mikromatriser); og c) ERG + og ERG- gruppeoppgave (figur 3A). I meta-analysen ble ERG + og ERG- vev tildelt i henhold til ERG uttrykk nivåer. I valideringsstudie ERG omorganisering-status ble bestemt ved fluorescens in situ hybridisering ved hjelp av en pause fra hverandre analyse som beskrevet tidligere [33] (figur S3A).
84% av alle gener funnet å være forskjellig regulert i ERG + og ERG- vev (fold-endring 2) ble verifisert av en uavhengig uttrykk studie. A) Undersøk egenskaper. B) ERG uttrykk nivåer i ERG omorganisering-positive og -negative vev av valideringsstudien. ERG rearrangements ble bestemt av fluorescerende in situ hybridisering. C) Gener forskjellig regulert i ERG + og ERG- vev. D) Validert regulert gener i meta-analyse og valideringsstudien. P-verdien korrigert BH; Fisher samlede p-verdi, Benjamini-Hochberg korrigert.
Vi først bekreftet at ERG omorganisering resulterte i ERG overuttrykk (figur 3B, Figur S3A-C), noe som indikerer at ERG + og ERG- gruppene ble riktig tilordnet i meta-analyse, så vel som validerings studien. Vi deretter analysert uttrykket av de 155 genene (12 gener ble ekskludert på grunn av manglende eller overflødige probe sett) identifisert som differensielt regulert i ERG + og ERG- vev i meta-analyse (FC 1,5; p 0,1). 49% (76/155) av alle gener funnet å være forskjellig regulert i ERG + og ERG- prostatakreft i meta-analysen ble bekreftet i valideringsstudien. Når valideringen analysen ble begrenset til gener som ble regulert minst to ganger i meta-analysen, disse utgjorde 84% (27/32) (figur 3C-D, tabell S2). Når vi analyserte validerings uttrykk studien som en uavhengig studie og undersøkt alle genene i matriser, disse fortsatt utgjorde 20% og 41% for FC 1,5 og FC 2, henholdsvis (tabell S2). Den samsvar mellom meta-analyse og den uavhengige valideringsstudie viste at vår meta-analyse generert robuste resultater som var uavhengig av prøven kohorten, sample oppdrag, og ansatt av genuttrykk.
Protein analyse ved hjelp Immunohistochemistry
Vår studie hadde vært fokusert på mRNA uttrykk nivåer før dette tidspunktet. Vi deretter undersøkt om proteiner kodet av forskjellig regulerte gener finnes i ulike mengder i ERG + og ERG- prostata kreft vev. Vi valgte uavhengige vev (ikke brukt for uttrykk analyse) fra Innsbruck prostatakreft biobank for å ytterligere sikre at etterforskningen vil avdekke generelle ERG + prostata kreft-relaterte endringer i stedet for pasientspesifikke forskjeller.
For å tilordne vev til gruppene ERG + og ERG-, vi fast bestemt på ERG protein nivåer ved immunhistokjemi hjelp av et antistoff som tidligere angitt for dette programmet [50]. ERG immunhistokjemi tillatt et klart skille mellom ERG + og ERG- vev. Etter avtale med publiserte data om ERG + vev, fargeintensitet av ERG varierte fra sterk til svak (figur S4A) [50]. Noen vev dukket heterogen for ERG. Begge ERG-positive og ERG-negative kreftceller var tilstede i disse vev (Figur S4B). Farging kontroller ble utført på a) godartet prostataceller, som er negative for ERG (figur S4C, venstre bildet); b) endotel-celler og lymfocytter, som beis positive for ERG [50] og utgjør en innvendig farving kontroll (eksempel i fig S4C, høyre bilde); og c) cellelinjer som representerer ERG + (VCAP) eller ERG- (Du145) prostatakreft (figur S4D). I tråd med tidligere rapporter, om lag halvparten (her 60%) av alle undersøkte prostata vev dukket ERG-positive (sammendrag av 93 prostatakreft tilfeller i figur S4E) [1], [3]. For å gjenspeile den meta-analysen ble vev med høy til middels ERG flekker i forhold til vev med negativ ERG flekker; vev med heterogen og lav ERG farging ble ekskludert
Seks målgener ble utsatt for protein validering.
GPR116
,
NPY Hotell og
PLA2G7
, tre gener over-uttrykt i ERG + vev og
AZGP1, HPGD Hotell og
TFF3
, tre genene nedregulert i ERG + prostata kreft vev. I fire av de testede genene, proteinnivå reflekteres regulering av mRNA: NPY og PLA2G7 var oppregulert i ERG + vev mens AZGP1 og TFF3 dukket nedregulert (figur 4). TFF3 har blitt rapportert å være differensielt regulert i ERG + vev [51]; derfor bare 11 prøver ble brukt for sammenligning. I tråd med våre data, ble PLA2G7 nylig rapportert å være relatert til ERG + svulster [52]. Protein nivåer av målgener
GPR116 Hotell og
HPGD
ikke ble endret på sammenligning av ERG + og ERG- prostatakreft (data ikke vist). Det er fortsatt uklart om avvik observert mellom mRNA og proteinnivåene for disse to genene reflektere biologisk (forskjellig regulering på mRNA og protein nivå) eller teknisk (antistoff ytelse) varianter.
A) Fortløpende lysbilder av prostata vev av to representative pasienter. B) Kvantifisering av vevsprøver hentet fra 61 ulike prostatakreftpasienter ved hjelp av immunhistokjemi kvantifisering programvare HistoQuest. HistoQuest skiller ikke mellom epitel og stromale celler. Forskjeller i fargeintensitet i epitelceller stige forskjellene vises i boksen-blotter. Bar, 100 mikrometer. Statistikk, Mann Whitney U-test; *, P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
ERG-forbundet Uttrykk av NPY induserer økt glukoseopptak i prostata kreft celler
For å få ny innsikt om rollen til ERG-rearrangements i prostatakreft undersøkte vi de funksjonene forskjellig regulert gener i ERG + prostata kreft celler. NPY ble valgt for funksjonell analyse. NPY er en liten nevropeptid med ble beskrevet som en sentral regulator av energibalansen i kroppen (oversikt i [53]). Vi målte glukoseopptak
in vitro
å avgjøre om NPY induserer metabolske forandringer i prostata kreft celler.
Vi har bekreftet NPY overekspresjon i ERG + prostatakreft cellelinjer som bruker qPCR og immunoblotting. qPCR ekspresjonsnivåene av NPY viste høyeste ekspresjon av NPY mRNA i ERG + cellelinjer DUCaP og VCap sammenlignet med andre prostata cellelinjer (figur 5A). NPY protein påvises ved immunoblotting utelukkende i DUCaP og Vcap (figur 5B). Når vi behandlet prostatakreftceller som ikke uttrykker endogent NPY (DU145, LNCaP og PC3) med rekombinant NPY (48 h, 25 nM), ble det observert økt glukoseopptak i NPY-behandlede celler enn i ubehandlede celler (figur 5C). Denne effekten ble ikke observert i celler som uttrykker endogen NPY (Vcap, figur 5C). For å undersøke om menneskelige prostata vev er potensielt NPY responsive, vi endelig sammenlignet uttrykket av NPY og NPY-responsive reseptorer NPY1R, NPY5R og NPY2R (NPY affinitet rangert, [54]) i prostata med de i andre menneskelige organer, ved hjelp av Oncomine database (https://www.oncomine.org) [24]. Vi har funnet NPY til å være rikere på godartet og kreftprostatavevet sammenlignet med benigne og cancervev avledet fra andre organer mens NPYRs ble uttrykt i en tilsvarende grad i prostata og andre vev (representative studier er vist i figur S5). Dermed kan flere vev være NPY responsive. Prostata, produserer imidlertid betydelige nivåer av endogent NPY. Tatt sammen våre data viser at ERG-rearrangementer i prostata cancer er forbundet med en rekke av transkripsjonelle endringer hos kreftceller, inkludert ekspresjon av metabolske sensorer som NPY.
NPY ble målt ved qPCR (A) og immunoblot (B ) i prostatacellelinjer. NPY uttrykk var høyest i ERG + DuCAP og Vcap prostata kreft celler. C) NPY stimulering (48 t, 25 nM) økt glukoseopptak i prostatakreftceller som ikke uttrykker endogene NPY (DU145, LNCaP, PC3). PC, prostata kreft cellelinjer; BP, godartet prostatacellelinjer; PS, prostata stromal cellelinjer.
Diskusjoner
Denne undersøkelsen ble utført for å bestemme endringer i genuttrykk i prostatakreft, som skyldes generelle endringer knyttet til prostata og uavhengig av pasient kohorter, tekniske variasjoner, og den anvendte metodikk. Vi fokuserte på transkripsjons endringer i ERG omorganisering-positive (ERG +) prostatakreft, fordi disse svulstene utgjorde en mindre preget undergruppe av prostatakreft. Vi forventet resultatene av denne undersøkelsen for å gi en offentlig tilgjengelig database for genuttrykk endringer i prostata kreft og gi ny innsikt i biologien til ERG + prostatakreft. Vi observerte for første gang, at ERG rearrangements er muligens assosiert med metabolske forandringer i prostata kreft celler.
Vår meta-analyse besto av 561 vev avledet fra åtte uavhengige studier.
