Abstract
Bakgrunn
stromal celle avledet faktor (SDF) -1 /chemokin reseptor (CXCR) -4 signalveien spiller en nøkkelrolle i lungekreft metastaser og er molekylære mål for terapi. I denne studien undersøkte vi om interleukin (IL) -24 kan hemme SDF-1 /CXCR4 akse og undertrykke lungekreft celle migrasjon og invasjon
in vitro
. Videre ble effekten av IL-24 i kombinasjon med CXCR4 antagonister undersøkt.
Methods
Humant H1299, A549, H460 og HCC827 lungecancercellelinjer ble anvendt i denne studien. Den H1299 lungekreft cellelinjen ble stabilt transfektert med doksycyklin-induserbar plasmid ekspresjonsvektor som bærer den humane IL-24 cDNA og anvendt i foreliggende studie for å bestemme de inhiberende virkninger av IL-24 for SDF-1 /CXCR4 akse. H1299 og A549 cellelinjer ble anvendt i forbigående transfeksjon studier. De inhiberende virkninger av IL-24 på SDF1 /CXCR4 og nedstrøms mål ble analysert ved kvantitativ RT-PCR, western blot, luciferase reporter assay strømningscytometri og immunocytokjemi. Funksjonelle studier inkludert celle migrasjon og invasjon analyser.
hovedfunnene
Endogen CXCR4 protein uttrykk nivåer varierte mellom de fire menneskelige lunge kreft cellelinjer. Doxycycline-indusert IL-24 uttrykk i H1299-IL24 cellelinje førte til redusert CXCR4 mRNA og protein uttrykk. IL-24 post-transkripsjonelt regulert CXCR4-mRNA-ekspresjon ved å redusere halveringstiden til CXCR4 mRNA (mer enn 40%). Funksjonelle studier viste IL-24 hemmet svulst celle migrasjon og invasjon samtidig med reduksjon i CXCR4 og nedstrøms mål (Pakt
S473, pmTOR
S2448, pPRAS40
T246 og HIF-1a). I tillegg har IL-24 inhiberte tumorcellemigrering både i nærvær og fravær av CXCR4 agonist, SDF-1. Til slutt, IL-24 når den kombineres med CXCR4 hemmere (AMD3100, SJA5) eller med CXCR4 siRNA vist forbedret hemmende aktivitet på tumorcellevandring.
Konklusjoner
IL-24 forstyrrer SDF-1 /CXCR4 signalveien og hemmer lunge svulst celle migrasjon og invasjon. I tillegg, IL-24, når kombinert med CXCR4-hemmere utstilt forbedret anti-metastatisk aktivitet og er et attraktivt terapeutisk strategi for lungemetastaser
Citation. Panneerselvam J, Jin J, Shanker M, Lauderdale J, Bates J, Wang Q, et al. (2015) IL-24 hemmer Lung Cancer Cell migrasjon og invasjon ved å forstyrre SDF-1 /CXCR4 signale Axis. PLoS ONE 10 (3): e0122439. doi: 10,1371 /journal.pone.0122439
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 02.12.2014; Godkjent: 11 februar 2015; Publisert: 16 mars 2015
Copyright: © 2015 Panneerselvam et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir og tilhørende informasjon filer
Finansiering:. studien ble støttet delvis av midler mottatt fra Jim og Christy Everest Velsignet Chair in Cancer Utviklings Therapeutics (RR); frø stipend fra Experimental Therapeutics Program (TJH, RR). Forfatterne takker Stephenson Cancer Center ved University of Oklahoma, Oklahoma City, OK og en institusjonell utvikling Award (IDEA) fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health i henhold stipend nummer P20 GM103639 for bruk av Cancer Funksjonell genomisk Core, som ga real-time PCR service. Bistand mottatt fra molekylær avbildning kjernefasiliteten for å gjennomføre strømningscytometriske studier er verdsatt. RR er en Oklahoma tset Forskningsstipendiat og holder Jim og Christy Everest Velsignet Chair in Cancer Utviklings Therapeutics. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Effektiv behandling av lungekreft er fortsatt en utfordring med en samlet 5-års overlevelse for pasienter diagnostisert med lungekreft er mindre enn 16% [1, 2]. En viktig årsak til den dystre overlevelse av lungekreft pasienter er metastase [3]. Således vil effektiv kontroll av lunge cancer metastase redusere dødelighet og øke pasientens overlevelse.
signalering mellom kjemokinreseptoren CXCR4 og dens ligand SDF-1, også kjent som chemokin-ligand (CXCL) -12, bidrar til tumorvekst, angiogenese, invasjon og metastaser i flere solide tumorer, inkludert ikke-småcellet lungekreft [4]. Samspillet mellom SDF-1 og CXCR4 dirigerer kreftceller til fjerne organer nettsider gjennom chemotaxis og homing av metastatiske celler [5]. Høy celleoverflate-ekspresjon av CXCR4 har vært forbundet med metastatisk aktivitet av tumorceller [6, 7]. Hemme SDF-1 /CXCR4 akse med en nøytraliserende antistoff eller transfeksjon med et anti oligonukleotid mot CXCR4 betydelig redusert invasjon, migrasjon og vedheft av lungekreft cellelinjer
in vitro product: [7]. Videre blokkerer CXCR4 svekket aggressivitet av metastaser i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [4, 8]. I samsvar med den pre-klinisk studie resultater, har kliniske studier vist høy CXCR4 uttrykk hos NSCLC tumorer er forbundet med spredning og en økt risiko for tilbakefall av sykdommen [9-12]. Molekylære studier har vist at SDF-1 /CXCR4 akse fremmer tumorcelleoverlevelse, cellemigrering og metastase ved å modulere en rekke signalveier [13, 14]. Derfor rettet mot SDF-1 /CXCR4 akse har fått stor oppmerksomhet for å hemme tumormetastaser.
Foreløpig AMD3100 (plerixafor, Mozobil) er en FDA godkjent CXCR4 antagonister som blir testet som en kreft terapeutisk [13]. Selv AMD3100 har vist effekt mot solide tumorer i prekliniske studier, har resultatene fra kliniske studier ikke vært oppmuntrende [13, 15, 16]. Dermed er testing for ytterligere CXCR4-hemmere som effektivt kan forstyrre SDF-1 /CXCR4 signalveien garantert.
Den menneskelige melanom differensiering forbundet genet (
MDA
) -7 /
IL -24
er et unikt cytokin /tumorsuppressorgen som hører til IL-10-cytokinet familie [17]. Endogent IL-24-protein ekspresjon kan påvises i de perifere mononukleære blodceller (PBMC), T- og B-celler og i melanocytter [18-20]. Imidlertid er IL-24-protein ekspresjon tapt i et flertall av kreftceller av human opprinnelse [17]. Studier av Ellerhorst et al., [21] og Ishikawa et al., [22] har vist at tap av IL-24 ekspresjon korrelerte med sykdomsprogresjon i melanoma og lungekreft noe som tyder på en svulst undertrykkende rolle for IL-24. Prekliniske studier viste at eksogen ekspresjon av humant IL-24 i et bredt spekter av humane kreftcellelinjer førte til potent anti-tumor og anti-metastatisk aktivitet både
in vitro
og
in vivo
[23-25]. Videre ble nytten av IL-24 som en anti-kreft narkotika vist i en fase I klinisk studie ved hjelp adenovirus-
MDA-7 plakater (INGN-241) -baserte kreft genterapi tilnærming [26]. Mens MDA-7 /IL-24 er utviklet som en kreft terapeutisk, de molekylære mekanismer som det utøver det anti-tumor og anti-metastatiske aktiviteter er ikke helt forstått.
I denne studien undersøkte vi evnen til IL-24 for å inhibere SDF-1 /CXCR4 signalveien. Begrunnelsen for å teste IL-24 hemmende aktivitet på SDF-1 /CXCR4 aksen og dens konsekvens på celle migrasjon og invasjon stammer fra vår siste observasjon viser at IL-24 hemmet AKT /mTOR vei [27]. Siden AKT /mTOR er nedstrøms CXCR4 og er involvert i SDF-1 /CXCR4 signalveien, hypotese vi at IL-24 regulerer celle migrasjon og invasjon ved å forstyrre de SDF-1 /CXCR4 akse i NSCLC. I tillegg har vi antatt at IL-24 i kombinasjon med CXCR4 antagonister (AMD3100, SJA5) ville utviser forbedret antimetastatisk aktivitet.
Vi viser at (i) IL-24 inhiberer lungetumorcellemigrering og invasjon ved å forstyrre SDF-1 /CXCR4-signalreaksjonsveien og (ii) IL-24, når den kombineres med CXCR4-antagonister eller siRNA, utstillinger forbedrede anti-metastatisk aktivitet. Dermed kombinere IL-24 med CXCR4-hemmere er en attraktiv terapeutisk strategi for styring av lungekreft metastase.
Metoder
Cell kultur
Menneskelig ikke-småcellet lungekreft celle ( NSCLC) linjer ble opprettholdt som tidligere beskrevet [25, 28].
Stabil transfeksjon av induserbar IL-24 plasmid vektor i H1299 celler
Menneske IL-24 cDNA tidligere klonet i pLJ143 plasmid ryggrad var løslatt fra et pLJ143 plasmid ved restriksjonsenzymoppslutning og ble klonet inn i pTET-ON plasmid vektor (Clonetech, Mountain View, CA, USA). Kloning av IL-24-cDNA ved passende restriksjonsenzymsete av den pTET-ON-plasmidet ble bekreftet ved restriksjonsenzymkutting og DNA-sekvensering. Den resulterende plasmid merket som pTET-IL-24 ble deretter dyrket i E. coli (DH5a stamme) og renset ved hjelp av Qiagen Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens anbefalinger.
IL-24 protein ekspresjon ved tilsetning av doksycyklin (1 pg /ml) ble bestemt ved å gjennomføre en transient transfeksjon analyse i H1299 celler ved hjelp Fugene (Roche, Indianapolis, iN, USA). Etter å ha bekreftet at doksycyklin indusert IL-24 protein uttrykk, brukte vi pTET-IL-24 plasmid for å generere en Tet-induserbar stabil kreftcellelinje. I korthet ble H1299-celler sådd ut i seks-brønns plater ble transfektert med den pTET-IL24 plasmid-DNA (1 pg) blandet med Fugene i serumfritt RPMI-medium. På tjuefire timer etter transfeksjon, G418 (800 mikrogram /ml, Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) ble tilsatt til brønnene og cellene ble valgt for fjorten dager. De overlevende celler ble selektert, ekspandert og screenet for doksycyklin-indusert IL-24-ekspresjon ved Western blotting. Cellepopulasjon som viste at IL-24-protein ekspresjon ble deretter underkastet enkelt celle klonal ekspansjon og screenet for IL-24-protein ekspresjon. Den klone som viste den høyeste IL-24 protein uttrykk ved tilsetning av doksycyklin ble stemplet som H1299-IL24 og ble brukt i våre studier.
Cell migrasjon analysen
En celle migrasjon analysen bruker polykarbonat filtre med en porestørrelse på 8 um (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) ble utført som tidligere beskrevet [28]. I korthet ble H1299-IL24 (5 x 10
4) celler ble sådd ut i det øvre kammer av innsatsen og plassert i en seks-brønns plate som er fylt med serumfritt RPMI-1640 medium (nedre kammer). Etter 24 timer ble kulturmediet i den seks-brønns plate erstattet med friskt medium inneholdende 20% tetracyklin-frie FBS (Atlanta Biologicals, Inc., Alpha Branch, GA, USA) og det øvre kammer ble fylt med 2% FBS tetracyklin fri holdig medium, med eller uten doksycyklin (1 ug /ml; Sigma Chemicals). Etter inkubering i 6 timer, 24 timer og 48 timer ble innsatsene fjernet og behandlet som tidligere beskrevet. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig antall migrerte celler pr mikroskopiske felt.
For å bestemme den hemmende effekt av IL-24 mot eksogene SDF-1 indusert tumorcellemigrering, ble en cellemigrasjon analyse utført som beskrevet ovenfor, bortsett at det nedre kammer inneholdt SDF-1 (100 ng /ml) i stedet for 20% FBS.
for å bestemme den kombinerte hemmende effekt av IL-24 og AMD3100, celler suspendert i 2% FBS inneholdende tetracyklin-frie medium var sådd i det øvre kammer av innsatsene og ble behandlet med doksycyklin alene (1 pg /ml), AMD3100 (100 ng /ml) alene eller en kombinasjon av begge. Kulturmediet i det nedre kammer inneholdt SDF-1 (100 ng /ml). Celler som ikke har mottatt noen behandling tjente som en kontroll i disse forsøkene. Ved 24 timer etter behandling, ble antallet migrerte celler tellet som beskrevet ovenfor.
For studier testing av kombinatorisk hemmende aktiviteten av IL-24 med SJA5 på cellemigrering, i nærvær av SDF-1 (100 ng /ml),-celler (5 x 10
4) ble behandlet enten med doksycyklin (1 pg /ml) eller SJA5 (100 ng /ml) eller AMD3100 (100 ng /ml) som en monoterapi eller i kombinasjon av doksycyklin + SJA5 eller doksycyklin + AMD3100. Celler som ikke har mottatt noen behandling tjente som en kontroll. Antallet migrerte celler ble bestemt ved 24 timer med behandling som beskrevet ovenfor.
celle invasjon assay
A Matrigel celle invasjon analyse ble utført som tidligere beskrevet [29]. Matrigel pre-belagte filtre (8 um; BD Biosciences) ble rehydrert med 1 ml vevkulturmedium. H1299-IL24 (5 x 10
4) celler ble sådd ut i det øvre kammer, mens det nedre kammer av innsatsen var fylt med serumfritt vevkulturmedium. Etter 24 timer ble den nedre kammer erstattet med 20% tetracyklin-frie FBS inneholdende medium og det øvre kammer ble fylt med 2% tetracyklin fri FBS med eller uten doksycyklin (1 pg /ml). Etter inkubering i ytterligere 6 timer, 24 timer og 48 timer ble kamrene behandlet og tumorcellen invasivitet ble bestemt som tidligere beskrevet.
Strømningscytometrisk analyse
H1299-IL24-celler (1 x 10
6) ble enten ikke behandlet (kontroll) eller behandlet med SDF-1 (100 ng /ml). Ved 1 time, 4 timer og 24 timer etter SDF-1 behandling ble cellene høstet, dissosiert til enkeltceller, og ble vasket to ganger med PBS-BSA-buffer. Celler ble deretter fiksert i 20 minutter i 1 ml PBS inneholdende 1% paraformaldehyd ved romtemperatur. Etter skylling i PBS-BSA-buffer ble cellene inkubert med 10% humant AB-serum (Cat.No.110-HG-100; R 10 ul /10
6-celler; R Amersco LLC, Solon, OH, USA) og ble høstet ved 30 minutter, 1 time, 2 timer, 3 timer, 4 timer, 6 timer og 24 timer etter actinomycin D behandling. Totalt RNA fremstilles fra de høstede celler ble anvendt for å bestemme CXCR4 mRNA-nivåer ved hjelp av RT-PCR, som beskrevet ovenfor. CXCR4 mRNA halvt liv ble beregnet ut fra typiske forfall kurver ved lineær regresjon mellom 0 h og 24 timer [31]. Verdier ± SD er basert på i det minste to uavhengige eksperimenter
Transient transfeksjon assay
H1299 og A549-celler (1 x 10
5) ble sådd ut i seks-brønns vevskulturplater og transient transfektert med 1 ug av plasmid-ekspresjonsvektor som bærer den
IL-24
cDNA og innkapslet i kationisk DOTAP: kolesterol liposomer som tidligere beskrevet [30]. Etter 6 timer med transfeksjon, ble vevskultur-medium aspireres og etterfylt med frisk medium. Celler som ikke ble transfektert med
IL-24
plasmid vektor fungerte som kontroll. Cellene ble høstet ved 24 timer etter transfeksjon, celle lysat fremstilt og analysert for IL-24, CXCR4, og AKT ved western blotting.
Western blotting-analyser
Celler mottar forskjellige behandlinger og oppsamlet ved forskjellige tidspunkter ble underkastet Western blot-analyse som tidligere beskrevet [32]. Primære antistoffer mot IL-24 (1: 2000; Introgen Therapeutics, Houston, TX, USA), GRK6 (SC-100380, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, CA, USA), fosfor-CXCR4
S339 (ab74012) og CXCR4 (ab2074) (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), fosfor-CXCR4
S324 /325 (CP 4251, 1: 1000; ECM biovitenskap LLC, Versailles, KY, USA ), fosfor-AKT
S473 (kat. nr 4060), total AKT (kat. nr 9272), fosfor-PRAS40
T246 (kat. nr 2997), total PRAS40 (Cat. No. 2691 ), fosfor-mTOR
S2448 (Cat No. 2971) og total mTOR (Cat No. 2983) (1:.. 1000; Cell Signaling Technology Inc, Beverly, MA, USA), CXCR7 (PA5-28739; en : 1000; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA); HIF-1α (ABE 279, 1: 1000, Millipore), Beta aktin (1: 2000, Sigma Chemicals) ble kjøpt og brukt som anbefalt av produsentene. Proteiner ble påvist ved hjelp av egnede sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc., og Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) og en forbedret chemiluminescence kit (Thermo Scientific). Protein nivåer ble oppdaget ved hjelp chemiluminescence bildesystem (Syngene, Frederick, MD) og kvantifisert ved hjelp av Image Quant (Syngene) programvare.
Immunocytochemistry
Cells (1,0 x 10
4) ble sådd på Lab-Tek 2-brønners kammerobjektglass (Nalge Nunc International-, Rochester, NY, USA) og ble enten ikke behandlet (kontroll) eller behandlet med doksycyklin (1 pg /ml). Ved 24 timer etter behandling, ble cellene behandlet og farget som tidligere beskrevet [25, 28, 30]. Primære antistoffer ble brukt var mus anti-humant IL-24-antistoff (1: 1000) og kanin-anti-humant CXCR4 antistoff (1: 2000). Glassene ble cover-sklei, observert, og bilder tatt med Nikon Tiu mikroskop (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, USA).
Kalsium mobilisering analysen
Celler dyrket på poly-D- lysin-belagte plater ble behandlet med doksycyklin (1 pg /ml) i 24 timer. Celler som ikke var behandlet med doksycyklin tjente som kontroll. Den følgende dag ble cellene merket med Fluo-4 Direkte kalsium-reagens (Molecular probes, Eugene, Oregon, USA) ved tilsetning av reagenset til vevet kulturmedium som anbefalt av produsentens protokoll, og inkubering i 1 time ved 37 ° C . SDF-1 (100 ng /ml) ble deretter tilsatt i alle brønnene, og det cytosolisk fri kalsium-konsentrasjonen ble bestemt ved forskjellige tidspunkter ved måling av fluorescens (eksitasjon ved 495 nm og emisjon ved 516 nm) ved bruk av Perkin Eimer EnVision Multilabel Reader (Waltham, MA, USA). Resultatene ble plottet mot tid og uttrykt som relative fluorescensenheter (RFU).
CXCR4 RNA interferens studier
celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6 godt tallerkener og transfektert med 100 nM av CXCR4 siRNA (Santa Cruz Biotechnology) ved hjelp av DOTAP: kolesterol liposomer [30]. Seks timer etter transfeksjon i serumfritt medium, ble vevet kulturmediet erstattet med 2% tetracyklin fri serum-inneholdende RPMI-1460 og SDF-1 (100 ng /ml). Cellene ble deretter enten ikke behandlet eller behandlet med doksycyklin (1 pg /ml). Celler som ikke var transfektert med siRNA tjente som en kontroll. Etter 24 timer inkubering ble cellene høstet og totalt cellelysat fremstilt og analysert for CXCR4, AKT, og PRAS40 ved Western blotting.
For den cellemigrering assay-celler (5 x 10
4) ble sådd ut i det øvre kammer av migrerings innsatsene og ble transfektert med CXCR4 siRNA (100 nM) og ble enten ikke behandlet eller behandlet med doksycyklin (1 pg /ml). Det nedre kammer ble fylt med SDF-1 (100 ng /ml) inneholdende vevskulturmedium. Antallet migrerte celler ved 24 timer etter behandling doksycyklin ble tellet som beskrevet ovenfor.
Statistisk analyse
Dersom ikke annet er angitt, ble alle data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SD) . Univariate statistisk signifikans ble bestemt ved en-veis analyse av varians (ANOVA) med Tukey tilpasning for parvise sammenligninger. Forskjellen mellom gruppene på hvert tidspunkt ble oppnådd ved anvendelse av lineær blandede effekter modell med Tukey tilpasning. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. SAS 9.2 ble brukt for de statistiske analysene.
Resultater
NSCLC celler uttrykker CXCR4 og AKT
Expression nivåer av endogenousCXCR4 og AKT (fosforylert AKT
S473 og total AKT ) proteiner varierte blant de fire humane lungekreft (H1299, HCC827, H460, A549) og cellelinjene som ble testet med H1299 cellelinjen som viser det høyeste ekspresjonsnivået av de to proteiner (fig. 1A). Basert på våre funn, valgte vi å bruke H1299 cellelinje for alle våre studier beskrevet nedenfor.
En
, Endogene CXCR4 og AKT protein uttrykk i menneskelig lunge kreft cellelinjer.
B
, IL-24 redusert CXCR4 uttrykk på 24 timer og 48 timer i doxycycline behandlet H1299-IL24 celler, men ikke i doxycycline ubehandlede kontrollceller.
C
, IL-24 redusert GRK6, fosforylert (p) CXCR4 og total CXCR4 uttrykk i doxycycline behandlet H1299-IL24 celler sammenlignet med uttrykk av disse proteinene i doxycycline ubehandlede H1299-IL24 celler.
D
, Immunocytochemistry viser doksycyklin-indusert IL-24 uttrykk i H1299-IL24 cellelinje redusert CXCR4 uttrykk. Celler som ikke var behandlet med doksycyklin tjente som kontroll.
Forstørrelse
IL-24-X 30; CXCR4- X 40.
E
, tidsforløpet studie viste CXCR4-ekspresjon ble redusert så tidlig som 4 timer etter IL-24 ekspresjon, og den inhiberende aktivitet ble opprettholdt opp til 24 timer i doxycycline-behandlede H1299-celler IL24 . Beta aktin ble brukt som protein lasting kontroll i Western blotting analyser.
IL-24 nedregulerer CXCR4, men ikke CXCR7 uttrykk
For å bestemme den hemmende aktivitet av IL-24 på CXCR4, vi først genererte en IL-24 induserbar cellelinje H1299 som ble tilført med en doksycyklin induserbar plasmid vektor (pTET-
IL-24
) og valgt å uttrykke IL-24 på tillegg av doksycyklin. Cellelinjen dermed skapt ble merket «H1299-IL24», og som brukes i den foreliggende undersøkelse. Merk: H1299 celler ikke uttrykker endogen IL-24-protein og følgelig en hvilken som helst IL-24-protein detektert ved tilsetning av doksycyklin er knyttet til induksjonen av IL-24
Behandling av H1299-IL24 celler med doksycyklin (. 1 pg /ml) resulterte i IL-24 ekspresjon ved 24 timer og 48 timer (fig. 1B). Forbundet med IL-24 ekspresjon var en markert reduksjon i CXCR4 ekspresjon ved begge tidspunkter som ble testet (Fig. 1B). Siden aktivering av CXCR4 veien innebærer CXCR4-fosforylering (p) ved 324/325 serin og serin 339 av den G-protein koblede reseptorer (GPCR) kinase (GRK) -6 [33-35], undersøkte vi den hemmende effekt av IL-24 på GRK6, pCXCR4
S324 /325 og pCXCR4
S339. IL-24 redusert uttrykk for GRK6, pCXCR4
S324 /325, pCXCR4
S339 og total CXCR4 uttrykk (Fig. 1C). Immunocytokjemisk farging viste doxycycline-behandlede H1299-IL24-celler uttrykte IL-24 og hadde redusert CXCR4 (Fig. 1D) sammenlignet med celler som ikke ble behandlet med doksycyklin (kontroll). Denne observasjonen enig med vår vestlige blotting resultat. Vi neste gjennomførte en gang-kurs studie for å finne ut hvor tidlig IL-24 uttrykk kan redusere CXCR4 uttrykk. IL-24-protein ekspresjon var påviselig så tidlig som 2 timer etter behandling doksycyklin, og dets ekspresjon økt over tid (fig. 1E). Parallelt ble inhibering av CXCR4 observert å forekomme starter på 4 timer, og den inhiberende aktivitet ble opprettholdt i 24 timer for testing (fig. 1E). Resultatene viste at IL-24 effektivt hemmet CXCR4 uttrykk i en tidsavhengig måte.
For å finne ut om den observerte IL-24-mediert hemming på CXCR4 var unik for H1299 celler, gjennomførte vi eksperimenter i en ekstra lunge cancercellelinje, A549. H1299 og A549 celler ble transient transfektert med en IL-24 uttrykkende plasmid-DNA-vektoren og cellelysatene som er samlet ved 24 timer etter transfeksjon ble analysert ved Western blotting. Celler som ikke var transfektert med plasmid vektor tjente som kontroll. IL-24 ekspresjon var detekterbar i begge cellelinjene som ble transfektert med IL-24 plasmid DNA mens ingen IL-24-protein-ekspresjon ble påvist i kontrollcellene (S1 fig.). Forbundet med IL-24 ekspresjon var en markert reduksjon i CXCR4 protein ekspresjon i begge cellelinjene. I tillegg reduksjon i fosforylert AKT
S473, en nedstrøms mål av CXCR4 ble også observert i celler som uttrykker IL-24, men ikke i kontrollceller. Våre studie viser at IL-24-formidlet hemmende aktivitet på CXCR4 ikke er begrenset til en cellelinje, og at den hemmende aktiviteten på CXCR4 kan oppnås via induserbar eller forbigående IL-24 ekspresjon.
Siden SDF-1 kan binde seg til både CXCR4 og CXCR7, bestemt vi CXCR7 uttrykk i lungekreftcellelinjer og om IL-24 hemmet CXCR7 i H1299-IL24 cellelinje. Endogene CXCR7 protein uttrykk nivåer varierte mellom lungekreft cellelinjene som ble testet (S2 fig.). Imidlertid induksjon av IL-24-ekspresjon i H1299-IL24 cellelinje hemmet ikke CXCR7 (S2 Fig.) Sammenlignet med kontrollceller. Vår studie resulterer dermed vise at IL-24 hemmer selektivt CXCR4 og ikke CXCR7 i H1299 celler.
IL-24-mediert CXCR4 hemming resulterer i redusert svulst celle migrasjon og invasjon
Siden CXCR4 har vært vist seg å spille en rolle i tumormetastase ved å fremme cellemigrering og invasjon vi undersøkt hvorvidt dempningen av CXCR4-ekspresjon av IL-24 hadde en følge biologisk virkning. IL-24-induksjon in H1299-IL24 cellene betydelig redusert cellemigrering så tidlig som 6 timer og ble opprettholdt inntil 48 timer når sammenlignet med kontrollen (Fig 2A;.
P
0,05). Muligheten for at den inhiberende aktivitet skyldtes celledreping ble eliminert som ingen cytotoksisitet ble observert ved 6 timer, en observasjon som sluttet med våre tidligere studier ved bruk av adenovirus (Ad) -il-24 [25].
H1299 -IL24-celler ble enten ikke behandlet eller behandlet med doksycyklin og observert for cellemigrering og invasjon. IL-24 inhiberte tumorcellemigrering (A) og invasjon (B) ved å starte fra 6 timer og vedvarende dets hemmende aktivitet til 48 timer ved hvilket tidspunkt forsøket ble avsluttet (
P
0,05). Barer betegne standardavvik (SD).
Muligheten for at doksycyklin behandling alene kunne produsere en direkte hemmende effekt på cellemigrasjon [36] ble også ekskludert ved å behandle naive H1299 celler med doksycyklin (1 mikrogram /ml ). Doxycycline behandlede naive H1299-celler viste ingen hemmende virkning på cellemigrering når sammenlignet med kontrollceller (S3 fig.).
A tumorcelle-invasjon analysen viste også at IL-24 signifikant reduksjon i antallet celler som invaderer gjennom Matrigel sammen å kontrollere cellene til alle-tidspunkter testet (fig 2B;.
P
0,05). Våre resultater indikerer at forstyrrelse av CXCR4 signalering av IL-24 resultater i hemming av både svulst celle migrasjon og invasjon.
Hemming av CXCR4 av IL-24 påvirker AKT-mTOR signale
Expression og aktivisering av CXCR4 har vist seg å positivt regulere flere utviklings og onkogene signaliseringsreaksjonsveier i mange krefttyper [13, 37, 38]. Nyere bevis viser at SDF-1 /CXCR4 aksen og PI3K /AKT akse funksjonelt samhandle og spille en betydelig rolle i tumorvekst, metastase og terapi motstand [39]. I tillegg er det AKT /mTOR-reaksjonsvei nedstrøms for CXCR4 og har vist seg å være regulert av CXCR4-aktivering [40]. Siden IL-24 inhiberte CXCR4 og dermed hemmet cellemigrering og invasjon, vi neste studerte de inhiberende virkninger av IL-24 på AKT /mTOR pathway. Uttrykk av IL-24 i H1299-IL24 celler resulterte i en markert reduksjon i Pakt
S473 protein uttrykk sammenlignet med kontrollceller ved begge 24 timer og 48 timer (fig 3;.
P
0,05) . Samtidig med reduksjon i pakt
S473 ekspresjon ble redusert ekspresjon av pPRAS40
T246, som er et direkte substrat av AKT. Videre uttrykk for pmTOR
S2448 og HIF-1α ble også betydelig redusert med IL-24 induksjon (fig 3;.
P
0,05). Disse data viser at IL-24-formidlet inhibering CXCR4 effektivt reduserer ekspresjon av signalmolekyler som er nedstrøms av CXCR4 og er involvert i tumorcellemigrering og invasjon.
Western blotting viste induksjon av IL-24-protein ekspresjon i H1299 -IL24 celler resulterte i markert reduksjon i uttrykket av fosforylert (p) AKT
S473, pmTOR
S2448 og pPRAS40
T246 og HIF-1α på 24 timer og 48 timer etter doksycyklin behandling.
