Abstract
Mål
invasjon og metastasering er viktige årsaker til kreft i bukspyttkjertelen død og identifisering signalmolekyler som er spesifikt anvendt i tumorinvasjon er av stor betydning. Hensikten med denne studien var å belyse hvilken rolle GEP100 i bukspyttkjertelkreft celle invasjon og metastasering og tilsvarende molekylære mekanismen.
Metoder
stabile cellelinjer med GEP100 slått ned ble etablert ved trans GEP100 shRNA vektor inn PaTu8988 celler og valgt av puromycin. QRT-PCR og Western blot ble utført for å påvise genuttrykk. Matrigel-invasjonen assay ble brukt til å oppdage kreft celle invasjon
in vitro
. Levermetastaser
in vivo
ble bestemt av milt injeksjon av angitte cellelinjer fulgt av milt reseksjon. Immunfluorescens studien ble brukt til å oppdage den intracellulære lokalisering av E-cadherin.
Resultater
Vi fant at uttrykket nivået av GEP100 protein ble nært knyttet til invasiv evne til et panel av seks forskjellige menneske bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Nedregulering av GEP100 i PaTu8988 cellene betydelig redusert invasiv aktivitet av Matrigel invasjon analysen uten å påvirke migrasjon, invasjon og levedyktighet. Den hemmet invasive aktivitet ble reddet av over-uttrykk for GEP100 cDNA.
In vivo
studie viste at levermetastaser ble betydelig redusert i de PaTu8988 celler med GEP100 stabilt slått ned. I tillegg til et epitelial-lignende morfologiske forandring, etterligne en mesenchymale epitelial overgang (MET) ble indusert ved GEP100 nedregulering. Uttrykket av E-cadherin protein ble økt 2-3 folder ledsaget av sin omfordeling til de celle-celle kontakter, mens ble det ikke observert tydelige endringer for E-cadherin mRNA. Uventet, ble mRNA av Slug økt med GEP100 knock-down.
Konklusjon
Disse funnene gitt viktige bevis som GEP100 spiller en betydelig rolle i bukspyttkjertelkreft invasjon gjennom å regulere uttrykket av E-cadherin og prosessen med MET, noe som indikerer mulighet for at det blir en potensiell terapeutisk mål mot bukspyttkjertelkreft
Citation. Xie Cg, Wei Sm, Chen Jm, Xu Xf, Cai Jt, Chen Qy, et al. (2012) nedregulering av GEP100 Årsaker Økning i E-cadherin Levels og hemmer kreft i bukspyttkjertelen Cell invasjon. PLoS ONE 7 (5): e37854. doi: 10,1371 /journal.pone.0037854
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 23 januar 2012; Godkjent: 30 april 2012; Publisert: May 25, 2012 |
Copyright: © 2012 Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Zhejiang Provincial Science Foundation Natural of China (No. Y2080372; URL: https://www.zjnsf.gov.cn/1/xm/lx.aspx) National Natural Science Foundation of China (No. 81101839; URL: http: //159.226 .244.22 /portal /proj_search.asp) og Qianjiang talent Programe fra Science and Technology Department of Zhejiang-provinsen (No. 2009R10057; URL: https://www.zjsts.cn/index/index.jspx). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød i USA [1]. Nyere data anslått at 43,140 nye tilfeller ble diagnostisert, med ca 36 800 tilknyttede dødsfall i 2010 [2]. Kreft i bukspyttkjertelen er ofte diagnostisert på avanserte stadier med lokal invasjon og fjernmetastasering, noe som gjør kirurgisk fjerning vanskeligere og mindre effektivt [3]. Dermed har en enorm mengde arbeid er gjort for å prøve å hindre invasiv aktiviteter carcinoma celler. For utvikling av terapeutiske midler, er det av stor betydning for å identifisere de signaleringsmolekyler som er spesifikt anvendt i tumorinvasjon [4], [5], [6].
Guanin nukleotid-utveksling protein 100, GEP100 ( også kalt BRAG2) ble identifisert som en av de guanin nukleotid utvekslings faktorer (GEF) som fortrinnsvis akselerert guanosin-5- [γ-tio] trifosfat (GTPyS) binding for Arf6 og ansvarlig for etter aktivering [7]. Det har blitt rapportert at GEP100 var involvert i forskjellige biologiske prosesser, inkludert celleoverflate-reseptor ekspresjon, celle-celle-fusjon, adhesjon, fagocytose, apoptose og angiogenese [8] – [15]. Nyere studier har vist at GEP100 spilte en viktig rolle i tumorinvasjon. GEP100 forbinder epidermal vekstfaktor-reseptor-signalisering for å Arf6 aktivering for å indusere brystcancer og lungecancer invasjon [16], [17]. I dag er fortsatt ukjent funksjon GEP100 i andre kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen,.
En prosess som kalles epitelial til mesenchymale overgang (EMT) oppstår ofte under carcinoma progresjon. Under denne prosessen, epitelceller overvinne de fysiske begrensninger som er pålagt dem av intracellulære veikryss og oppnå mesenchymale fenotype og forbedret bevegelighet [18]. E-cadherin er et trans protein lokalisert på adherens veikryssene til basolateral overflaten og spiller en viktig rolle i epitelial morfologi vedlikehold. Tap av E-cadherin uttrykk og /eller funksjon er et velkjent markør for EMT og fremmer kreft i bukspyttkjertelen celle progresjon og invasjon, knyttet til dårlig prognose av kreft i bukspyttkjertelen [19] – [23]. Til dags dato, er effekten av GEP100 på EMT sjelden studert.
Derfor, i denne studien undersøkte vi funksjonen GEP100 i prosesser av kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon, metastase og EMT. Vi analyserte GEP100 ekspresjon i forskjellige cellelinjer, og fant at GEP100 ekspresjonsnivået var nært knyttet til celle invasive egenskaper. Matrigel invasjonen assay
in vitro Hotell og levermetastaser eksperiment
in vivo
både avslørte at nedregulering av GEP100 hemmet invasjon og metastase betydelig. Uttrykket av E-cadherin ble oppregulert ved GEP100 knock-down. Våre funn vil bidra til ytterligere å avsløre molekylære mekanismer som brukes i bukspyttkjertelen kreft invasjon og metastaseprosesser.
Materialer og metoder
Cell Kultur og antistoffer
Menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer BxPC- 3, CFPAC-en, SW1990, ASPC-en, Panc-1 og PaTu8988 ble alle hentet fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank (Shanghai, Kina) og dyrket i RPMI-1640 (Gibco) som inneholder 10% føtalt bovint serum uten antibiotika i 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Primære antistoffer for Arf6, vimentin, β-actin ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer for GEP100 og E-cadherin C36 var fra Sigma og BD Biosciences hhv. Alle sekundære antistoffer var fra BOOSTER Technology (Wuhan, Kina).
plasmider og Transfeksjon
pEGFP-GEP100 plasmid som koder for hele lengden av GEP100 cDNA og pSuper-retro-puro-GEP100 plasmid koding GEP100 shRNA var snill gaver fra professor Sabe Hisataka (Hokkaido University, Japan). For shRNA-mediert GEP100 undertrykkelse, ble 8 x 10
5 av PaTu8988-celler transfektert med 3 ug psuper-retro-puro-GEP100 eller et plasmid som koder for et irrelevant sekvens ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i 48 timer. De transfekterte celler ble selektert med 1 ug /ml puromycin (Invitrogen) og bassenger av utvalgte celler ble underkastet
i Virto
eksperimenter inkludert invasjon, sårheling, adhesjon og levedyktighet analyser. For generering av stabile cellelinjer, ble de transfekterte cellene velges med 1 ug /ml puromycin og bassenger av utvalgte celler ble serielt fortynnet i et seleksjonsmedium. Omtrent 20 kloner ble isolert og testet med Western blot. Klone viser den høyeste grad av undertrykkelse ble brukt til
in vivo
eksperimenter.
levedyktighet, vedheft, sårheling og Matrigel Invasion Analyser
Cell viabilities ble målt med en MTT kolorimetrisk analyse kit (Promega) ifølge produsentens instruksjoner.
for adhesjonsassayet, ble en 35 mm kulturskål belagt med 10 ug /ml kollagen (Sigma-Aldrich) og deretter 1 x 10
5 celler ble sådd. 1 time senere, ble fatet vasket med PBS forsiktig i 3 ganger. Antallet av cellene som festet seg til skålen ble tellet.
For sårhelingsprosessen analysen, 1 x 10
6-celler ble sådd på en 35 mm kulturskål og tillatt å danne et monolag. Et sår ble gjort ved å skrape den monolayer med en 100 mL pipette tips. Cellene ble dyrket til såret var dekket.
Matrigel invasjonen analysen ble utført ved hjelp av en transwell belagt med 25 mikrogram Matrigel (Sigma). 1 x 10
5-celler i RPMI-1640 med 1% fosfatbuffer saltvann (PBS) ble sådd ut på den øvre brønnen. Som en kjemoattraktant, ble RPMI-1640 med 10% FBS tilsatt i det nedre kammeret. Etter inkubering i 24 timer ble cellene fiksert i methanol i 15 minutter og farget med 1% krystall fiolett (Sangon, Kina) i 10 minutter. Cellene på den øvre overflaten av filteret var tørket av med en bomullsdott, og antall celler som migrerte inn i den nedre overflate av membranene ble tellet i løpet av 10 tilfeldig utvalgte områder.
RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler ved Trizol (Invitrogen) og revers-transkribert av M-MLV revers transkriptase (Promega) ved anvendelse av oligo dT primere ved 42 ° C i 60 min. cDNA ble deretter underkastet 35 sykluser med PCR-amplifikasjon. Primerne som ble brukt var som er oppført nedenfor: GEP100, forover-primer (5′-GCCTTTAGCAACGATGTCATC-3 «) og revers primer (5′-CACATGGTCCTCATTGGTCTT-3′); Arf6, forover-primer (5»-ATGGGGAAGGTGCTATCCAAAATC-3 «) og revers primer (5′-GCAGTCCACTACGAAGATGAGACC-3′); E-cadherin, forover-primer (5»-TCCCATCAGCTGCCCAGAAA-3 «) og revers primer (5′-TGACTCCTGTGTTCCTGTTA-3′); Vimentin, forover-primer (5»-GACAATGCGTCTCTGGCACGTCTT-3 «) og revers primer (5′-TCTTCTGCCTCCTGCAGGTTCTT-3′); Slug, forover-primer (5»-AGATGCATATTCGGACCCAC-3 «) og revers primer (5′-CCTCATGTTTGTGCAGGAGA-3′); Twist, forover-primer (5»-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 «) og revers primer (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′); ZEB1, forover-primer (5»-AGCAGTGAAAGAGAAGGGAATGC-3 «) og revers primer (5′-GGTCCTCTTCAGGTGCCTCAG-3′); Snegl, forover-primer (5»-TTCTTCTGCGCTACTGCTGCG-3 «) og revers primer (5′-GGGCAGGTATGGAGAGGAAGA-3»). Primerne anvendt for β-actin ble innkjøpt fra Sangon, Kina.
Western Blot analyse
Cellene ble lysert i RIPA lysebuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1% Na-deoksycholat, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 20 ug /ml leupeptin, 20 ug /ml Aprotini, ble 3 pg /ml pepstatin A) og proteinkonsentrasjonen bestemt ved anvendelse av BCA kit (Keygen, Kina). Totale proteiner ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran. Membranene ble blokkert i 5% BSA i TBST-buffer inneholdende 0,1% Tween 20 og deretter inkubert med primære antistoffer angitte over natten ved 4 ° C. HRP-konjugerte sekundære antistoffer ble inkubert ved romtemperatur (RT) i 1 time og oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminesence deteksjonssystemet (Amersham Pharmacia Biotech).
immunfluorescens Study
De transfekterte PaTu8988 cellene ble vasket med varm PBS en gang og umiddelbart fiksert med kald metanol ved -20 ° C i 6 min. Prøven ble tillatt å tørke ved romtemperatur i 30 minutter og blokkert med 2% BSA i PBS i 30 min. Den endogene E-cadherin ble gjenkjent med et anti-E-cadherin monoklonalt antistoff i 1 time ved RT. Etter 5 vaskinger med 0,5% BSA-PBS, et FITC-merket anti-muse-sekundært antistoff (BOOSTER, Kina) ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket med PBS i 5 ganger igjen, så montert med 50% glycerol i PBS og observert under et fluorescens mikroskop.
In vivo
Metastase-analysen
A levermetastaser assay ble utført som beskrevet tidligere [24], [25] med modifikasjoner. I korthet, ble Balb /c nakne mus (5-6 uker) delt inn i 3 grupper med 12 for hver: en kontrollgruppe som mottar PaTu8988-celler, en krafse gruppe mottar cellene slås ned med sramble shRNA og en eksperimentell gruppe mottok cellene med GEP100 stabilt slått ned. Musene ble bedøvet med kloralhydrat. Bukhulen ble eksponert og 5 x 10
6 angitte celler i 0,1 ml PBS ble injisert inn i milten vev gjennom en 27-gauge nål. Injeksjonsstedet ble presset svakt med saltvann bomull i 5 minutter etterfulgt av ligering av den venstre arterien gastrisk og miltarterien. Deretter ble milten ble tatt reseksjon. 4 uker senere, leveren ble kirurgisk fjernet og fiksert med 10% formalin over natten. Leveren ble skåret i 2 mm skiver og 5 seksjoner fra omtrent samme posisjon for hver lever ble bestemt under et mikroskop. Protokollene som brukes for alle dyreforsøk i denne studien ble godkjent av forsøksdyrutvalget Committee of Zhejiang University.
Statistical Analysis
Forsøkene og analysene ble utført minst tre ganger. Statistisk signifikans ble antatt hvis
P
≤0.05 av T-test.
Resultater
Sammenheng mellom GEP100 Expression og bukspyttkjertelkreft Cell Invasive Evne
invasive evnen til et panel på 6 forskjellige humane bukspyttkjertelcancercellelinjer ble undersøkt ved den Matrigel invasjon assay, som vist i fig. 1A. Cellelinjene i denne gruppen ble hentet fra både den primære (BxPC3, Panc-1, og SW1990) og metastatisk (ASPC-en, CFPAC-en, og Patu8988) sider [26], [27]. Disse cellelinjene viste et kontinuum av ulike invasive evner. Den ASPC-1 og PaTu8988 celler viste de høyeste invasive egenskaper, etterfulgt av SW1990, CFPAC-1 og Panc-1 celler. Den BxPC-3 cellers var den svakeste. Ekspresjonsnivået av GEP100 protein ble nært forbundet med invasiv evne til denne panel av cellelinjer, med den ASPC-1 og PaTu8988 celler som viser den sterkeste uttrykk, etterfulgt av SW1990, CFPAC-1 og PANC-1-celler, mens nesten ikke detektert i BxPC-3 cellelinje. Ingen åpenbare forhold mellom ekspresjon av Arf6 protein og invasive egenskaper ble påvist. Vi har også bestemt uttrykket nivåer for proteiner assosiert med epitel (E-cadherin) eller mesenchymale (vimentin) fenotype. E-cadherin ekspresjon kunne lett påvises i lav-invasiv cellelinjer, men bare en meget svak ekspresjon ble påvist i de høyt-invasive cellelinjer. Vimentin ble uttrykt i den høyt-invasiv cellelinje (Fig. 1B).
(A) invasive egenskaper av et panel på 6 bukspyttkjertelcancercellelinjer ble analysert ved hjelp av Matrigel invasjon assay i 24 timer. ASPC-en og PaTu8988 viste høye invasive evner. (B) Western blot analyse av ekspresjonen av GEP100, Arf6, E-cadherin og vimentin-protein i forskjellige cellelinjer. ASPC-en og PaTu8988 viste den sterkeste uttrykk for GEP100 protein, etterfulgt av SW1990, CFPAC-en, Panc-1 og BxPC-3, som viser en nær sammenheng mellom GEP100 uttrykk nivå og celle invasiv evne. Ingen åpenbare forhold mellom ekspresjonen av Arf6 protein og invasive egenskaper ble påvist. E-cadherin ekspresjon kunne lett påvises i lav-invasiv cellelinjer, men bare en meget svak ekspresjon ble påvist i de høyt-invasive cellelinjer. Vimentin ble uttrykt i svært invasive cellelinjer. (C) RT-PCR-analyse av ekspresjonen av GEP100, Arf6, E-cadherin og vimentin mRNA. Ekspresjonen av GEP100 mRNA kunne detekteres i alle seks cellelinjer og noen tydelig korrelasjon med invasive egenskaper ble funnet. Dette var det samme tilfelle for Arf6 og vimentin mRNA. E-cadherin mRNA viste en nær tilknytning til invasiv evne til forskjellige cellelinjer. β-aktin mRNA ble anvendt som en kontroll.
ekspresjon av GEP100 mRNA kunne detekteres i alle cellelinjene 6 og ingen åpenbar korrelasjon med invasive egenskaper ble funnet. Dette var den samme for Arf6 og vimentin mRNA. E-cadherin mRNA nivå viste et nært samarbeid med invasiv evne annen cellelinje (Fig. 1C).
nedregulering av GEP100 redusert Invasive Mulighet for kreft i bukspyttkjertelen celler
For å vurdere om GEP100 bidrar til celle invasjon, valgte vi den svært invasive PaTu8988 celler og nedregulert i GEP100 uttrykk med shRNA. Mer enn 80% inhibering av proteinsyntese GEP100 ble bekreftet ved Western blot i to kloner (fig. 2A). Klon # 1 ble valgt for invasjonen analysen. Matrigel invasjonen analysen viste at GEP100 knock-down redusert antall celler som trenger gjennom Matrigel til ca. 35% sammenlignet med (fig. 2B) kontrollgruppen. Re-ekspresjon av GEP100 gjen evne invasjon til omtrent 60%. Vandrende aktivitet ble evaluert ved den til sårheling analysen og sårtilheling tidsperioder på tre grupper ble vist. GEP100 knock-down bare litt hemmet migrasjon (Fig. 2C) uten statistisk signifikans. På den annen side, GEP100 knock-down ikke hemmer celleadhesjon til kollagen (fig. 2D). Under de ovennevnte betingelser, ble cellenes levedyktighet ikke påvirkes (fig. 2E).
(A) En stabil cellelinje med GEP100 slått ned ble oppnådd ved å transfektere psuper-retro-puro-GEP100 inn i PaTu8988-celler og utvalgt med 1,5 ug /ml puromycin. Nedregulering av GEP100 ble bekreftet ved Western blot. β-aktin ble benyttet som en kontroll. (B) Invasion analyse viste at GEP100 nedregule redusert antall celler som gjennomtrenges gjennom Matrigel-belagte membran. Dataene ble presentert og fremstilles grafisk som prosent beregnet ved normalisering av verdiene oppnådd for de ubehandlede celler som 100%. GEP100 knock-down redusert antall celler som gjennomtrenges gjennom Matrigel til ca. 35% sammenlignet med kontrollgruppen. Re-ekspresjon av GEP100 i shRNA behandlede celler gjen evne invasjon til omtrent 60%. (C, D, E) viste GEP100 nedregule ingen signifikante effekter på cellemigrasjon, invasjon og levedyktighet. Ctrl, kontroll.
nedregulering av GEP100 Redusert levermetastaser av kreft i bukspyttkjertelen celler i Balb /c nakne mus
Neste, vi undersøkt om knock-down av GEP100 blokker levermetastaser av tumorceller i mus. Vi injisert PaTu8988 eller PaTu8988 /rykke shRNA eller PaTu8988 /GEP100 shRNA celler i milten av Balb /c nakne mus. Tolv mus fra hver gruppe ble avlivet etter 4 uker etter injeksjon. For kontroll og krafse shRNA-injiserte grupper, leveren ble små og grov, med hvitnet områder sees på overflaten. For GEP100 shRNA-injisert gruppe, ble små flekker også funnet på leveren overflaten. Hepatiske metastaser som viser dårlig differensierte reder av celler ble bekreftet mikroskopisk i 9 av 10 mus (90%) i kontrollgruppen og 10 av 12 mus (83%) i sramble gruppe, mens bare 4 av 11 mus (36%) ble funnet i eksperimentgruppen (fig. 3). En signifikant hemmende effekt på levermetastaser ble observert (
P
≤0.05). Antallet metastatiske knuter ble beregnet og gjennomsnitt. Sammenligning med kontroll og krafse grupper, GEP100 nedregule redusert de metastatiske knuter signifikant (
P
≤0.05).
(A) Makroskopiske funn av resected leveren. Stabile PaTu8988 celler som indikert ble splenicly injisert etterfulgt av milt reseksjon. 4 uker senere, lever var fjernet for observasjon. De fleste av leveren fra kontrollpanelet og krafse shRNA grupper ble små og grov, med store hvitnet områder sees på overflaten. For GEP100 shRNA-injisert gruppe, ble bare små flekker funnet på noen av leveren overflaten. Metastase ble bekreftet under et mikroskop og nettstedene til metastasering ble indikert med piler (hematoxylin og eosin, x100). (B) Prosenter av levermetastaser i Balb /c nakne mus ble oppført. En statistisk signifikant forskjell ble oppnådd mellom kontroll og forsøksgruppen (
P
≤0.05). (C) Gjennomsnittlig antall metastatiske knuter i leveren ble beregnet og grafisk. I korthet, etter en fiksering med 10% formalin over natten ble leveren skåret i 2 mm skiver og 5 seksjoner fra omtrent de samme posisjoner for hver lever ble beregnet i henhold til mikroskop. En statistisk signifikant forskjell ble oppnådd mellom kontroll og forsøksgruppen (
P
≤0.05). Ctrl, kontroll.
E-cadherin Expression ble oppregulert og distribuert til Cell-celle Kontakt via GEP100 Nedregule
Til slutt undersøkte vi de mulige mekanismene som er involvert i invasjon hemming av kreft i bukspyttkjertelen celler ved GEP100 nedregulering. Vi fant at nedregulering av GEP100 forårsaket en morfologisk endring av PaTu8988 celler fra mesenchymale typen til epitel-lignende (figur 4A.). Og tilsvarende, ekspresjon av E-cadherin protein, som er en epitelial markør, ble økt ca. 3 ganger sammenlignet med (fig. 4B) kontrollgruppen. Den ekspresjon av E-cadherin-mRNA ble også undersøkt, men ingen vesentlige endringer kunne påvises (Fig. 4C). Neste, vi videre bestemmes den intracellulære lokalisering av E-cadherin protein. Immunfluorescens Studien viste at i GEP100 banket ned-celler, ble E-cadherin konsentrert ved celle-celle-kontakt (fig. 4D). Selv om ingen signifikant endring ble funnet på mRNA-nivå av E-cadherin, vi fortsatt undersøkt uttrykket av flere hovedtranskripsjonsfaktorer for E-cadherin. Interessant nok var en økning på Slug funnet i GEP100 slått ned celler, mens det var ingen endring for Twist, ZEB1, Snail (fig. 4C).
(A) En mesenchymale til epitelial endring ble observert i cellene stabilt slått ned for GEP100. De øvre og nedre paneler viste de morfologiske skinn ved en lav celletetthet, og når cellene nådde konfluens, respektivt. Sammenligning med kontrollgruppene og krafse, cellen i forsøksgruppen ble epitel-lignende og klebemiddel. (B) Western blot viste at ekspresjonsnivået av E-cadherin-protein ble øket ca. 3-fold i den eksperimentelle gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. (C) RT-PCR-analyse av E-cadherin mRNA og dets transkripsjons regulatorer. Den ekspresjon av E-cadherin mRNA ble ikke påvirket av GEP100 nedregulering. En økning av Slug mRNA ble funnet i GEP100 slått ned celler, mens det var ingen endring for Twist, ZEB1 og Snail. (D) Immunofluorescens farging av E-cadherin. Sammenligning med krafse gruppe, GEP100 nedregule omfordeling av E-cadherin inn i celle-celle kontakter.
Diskusjoner
Den nåværende Resultatene viste for første gang at GEP100 spiller en sentral rolle i bukspyttkjertelkreft celle invasjon. Nedregulering av GEP100 inhiberte signifikant invasiv evnene til kreft i bukspyttkjertelen celler eventuelt gjennom den oppregulering av ekspresjon av E-cadherin og restaurering av epiteliale fenotype. GEP100 kan være en potensiell molekylære mål i bukspyttkjertelkreft genterapi.
I denne studien ble først, vi demonstrert at GEP100 ble uttrykt i de pankreatiske kreftceller. GEP100 tilhører SKRYT familien av Arf GEF, som består av tre isoformer, BRAG1 /IQsec2, BRAG2 /IQsec1 /GEP100, og BRAG2 /IQsec3 /synArfGEF [28]. Ekspresjonen av BARG2 /GEP100 er allestedsnærværende [7]. Innenfor panel av 6 bukspyttkjertelcancercellelinjer vi brukte, BxPC-3, SW1990 ble avledet fra primære tumorer og Panc-1 ble avledet fra invasiv intraductal forlengelse av primærtumor, mens de andre tre ble alle avledet fra metastaser [26], [27]. ASPC-1 og PaTu8988 viste den sterkeste ekspresjon av GEP100, etterfulgt av SW1990, CFPAC-1 og Panc-1, mens den primære svulst BxPC-3-celler viste den svakeste. Ekspresjonen av GEP100 protein er nært knyttet til den invasive evne til hver cellelinje, noe som antyder at GEP100 kan være involvert i kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon.
vi videre funnet at GEP100 nedregulering med shRNA vesentlig hemmet Matrigel invasjon evnen til PaTu8988 celler, men hadde ingen effekt på cellelevedyktigheten, migrering og adhesjon, noe som indikerer at GEP100 er spesielt ansvarlig for invasiv evnen til cellene.
In vivo
forsøket viste også at GEP100 knock-down betydelig hemmet levermetastaser av kreft i bukspyttkjertelen celler i Balb /c nakne mus. Dette resultatet er i tråd med tidligere data som viser at i brystkreftceller GEP100 ble sterkt uttrykt i invasive og at GEP100 nedregulering hemmet celle invasjon og lungemetastase [16], [17]. Disse resultatene indikerte at GEP100 er ikke bare et mål for brystkreft, kan det være en generell mekanisme som brukes av andre krefttyper.
Flere andre biologiske funksjoner for GEP100 har blitt rapportert. I HeLa-celler, GEP100 regulert celleadhesjon gjennom å kontrollere endocytose og resirkulering av integrin β [9]. I en leverkreft cellelinje HepG2, GEP100 direkte interaksjon med α-catenin og spilte en rolle i aktin cytoskjelettet ombygging [10]. I myoblaster og makrofager, ble GEP100 involvert i celle-cellefusjon [11]. Det har også blitt rapportert til å delta i reguleringen av nukleolært arkitektur og fagocytose [12], [13]. I denne studien har vi ikke observere noen signifikant effekt av GEP100 på celle adhesjon til kollagen matrise eller migrasjon aktivitet. Siden det ikke er noen rapport om hvilken rolle GEP100 i bukspyttkjertelen kreftceller, kan dette være på grunn av forskjellen i celletype.
I motsetning til forrige rapport om en nær sammenheng mellom Arf6 uttrykk og brystkreft celle invasiv evne [29], vi ikke klarte å oppdage at i panelet av bukspyttkjertelkreft cellelinjer vi brukte. De ovennevnte biologiske funksjoner av GEP100 er blitt funnet å være avhengig av aktivering av Arf6, men det antas at GEP100 er et multifunksjonelt protein som regulerer cellefunksjoner i både en Arf-avhengig og-uavhengig måte. For eksempel, ble GEP100 involvert i celledød ved apoptose uavhengig av Arf6 aktivitet [12]. Videre studier, inkludert bestemmelse av aktiveringsstatusen til Arf6 vil være nødvendig å avsløre rolle Arf6 i ferd med kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon.
Vi fant GEP100 knock-down forårsaket en morfologisk endring av celler fra mesenchymale til epitelial fenotype. I kreft i bukspyttkjertelen, forskyvning av de epiteliale egenskaper mot en mesenchymale fenotype forbedrer cellemotilitet og er ansett for å være en forutsetning for tumorinvasjon. E-cadherin er best karakterisert molekylær markør i epitelceller og lokalisert på adherens veikryss. Tap av E-cadherin uttrykk og /eller funksjon er et velkjent markør for EMT og fremmer invasjon [18]. Derfor undersøkte vi uttrykket av E-cadherin protein. GEP100 shRNAs behandling økte E-cadherin uttrykk nivå 2-3 fold. Dette er konsistent med Hiroi rapport som viser at i HepG2 celle, nedregulering av GEP100 øket ekspresjon av E-cadherin [10]. I tillegg har de også vist at GEP100 samhandlet med α-catenin.
E-cadherin uttrykk kan være regulert av flere mekanismer, inkludert promoter metylering, transkripsjonsregulering av transkripsjonsfaktorer inkludert Snail, Slug, Twist, Zeb-en , Sip1, og riktig intracellulær lokalisering [30], [31]. Blant de transkripsjonsfaktorer vi undersøkt, var ekspresjonen av den grove øket ved nedregulering av GEP100, som var uventet. Slug er medlem av sneglen super og først identifisert som en utvikling protein avgjørende for neural crest formasjonen i kyllingfoster [32]. Slug er inverst korrelert med E-cadherin og uttrykk er en kritisk EMT-fremmende faktor i mange tumortyper, [33], [34]. Fersk studie viste at Slug uttrykk ikke var alltid forbundet med E-cadherin nedregulering [35]. Det ble tydelig vist at Slug uttrykk ble økt i bukspyttkjertelkreft sammenlignet med de omkringliggende parenchyma. Men i 36 tilfeller av duktalt adenokarsinom analysert, ble ingen åpenbar sammenheng finnes mellom E-cadherin og Slug uttrykk [36]. I denne studien fant vi at GEP100 nedregule indusert en økt E-cadherin uttrykk samt økt Slug uttrykk. En tolkning er at E-cadherin proteinekspresjon er ikke avhengig av Slug i denne celletype og faktisk mRNA av E-cadherin ble ikke endret. Selv om uttrykket av Slug er forbundet med mange svulst prognose, er det ikke klart ennå hvordan Slug selv er regulert. Våre data indikerer at GEP100 kan være involvert i reguleringen av Slug uttrykk.
En riktig lokalisering av E-cadherin er også avgjørende for dets riktige funksjon. Celleoverflate E-cadherin i epitelceller er delvis internalisert og resirkuleres tilbake til plasmamembranen av flere mekanismer, inkludert clathrin avhengig, caveolae-avhengig, lipid-flåten medierte baner eller macropinocytosis [31]. I epiteliale veikryss, ble dynamikken i E-cadherin også nært regulert av ARF proteiner [37], [38]. Arf6 GTPase er avgjørende for E-cadherin endocytose og gjenvinning. Det er blitt vist at ekspresjonen av et inaktivt protein Arf6T27N blokker HGF-induserte internalisering av E-cadherin, mens ekspresjon av en konstitutiv aktiv form av Arf6Q67L medfører demontering av adherens knutepunkter [39]. I HepG2 celler, GEP100 laget forårsaket inaktivering av Arf6 fulgt av svekket internalisering av E-cadherin og dens oppsamling på plasmam membran [10]. Med immunfluorescens studie fant vi at GEP100 knock-down økt akkumulering av E-cadherin til adherens veikryss. Vi spekulerer i at GEP100 oppregulert uttrykk for E-cadherin gjennom å hemme endocytose og følgende degradering. Videre undersøkelser vil være nødvendig å avklare dette spørsmålet.
I sammendraget, våre resultater presenteres eksperimentelle bevis for at GEP100 uttrykk korrelert med invasiv evne til kreft i bukspyttkjertelen celler og kan anses som et nytt mål for utvikling av legemiddelselskap for å hindre bukspyttkjertelen kreftcelle invasjon.
takk
Vi takker professor Sabe Hisataka for velvillig deling shRNA og cDNA-konstruksjoner som brukes i disse studiene.
