Abstract
Identifisering av nye proteiner som potensielt kan bidra til kreftutvikling er en forutsetning venture. Heri, rapporterer vi først biokjemisk karakterisering av romanen F-boks og WD40 inneholder protein, FBXW4. Vi har identifisert samvirkende proteinpartnere og viste at FBXW4 er en del av et ubiquitin ligase kompleks. Videre er Fbxw4 locus et felles område av proviralt innsetting i en rekke av retrovirale insertional mutageneseteknikker murine cancermodeller og Fbxw4 mRNA uttrykkes sterkt i det involuting murine brystkjertelen. For å begynne å karakterisere biokjemiske funksjon av Fbxw4, brukte vi proteomikk analyse for å demonstrere at Fbxw4 samhandler med Skp1 (SKP1), Cullin1 (CUL1), Ring-box1 (RBX1) og alle komponenter i COP9 signalosome. Alle disse samhandling er avhengig av en intakt F-boks domenet Fbxw4. Videre er Fbxw4 stand til å kommunisere med ubiquitinmolekyler i cellene i en F-boks avhengig måte. Endelig, viser vi at FBXW4 er mutert, tapt og under-uttrykkes i en rekke humane kreftcellelinjer og kliniske pasientprøver. Viktigere, uttrykk for FBXW4 korrelerer med overlevelse av pasienter med ikke-småcellet lungekreft. Tatt sammen, foreslår vi at FBXW4 kan være en roman tumor suppressor som regulerer viktige cellulære prosesser
Citation. Lockwood WW, Chandel SK, Stewart GL, Erdjument-Bromage H, Beverly LJ (2013) The Novel Ubiquitin Ligase Complex, SCF
Fbxw4, samhandler med COP9 Signalosome i en F-Box avhengig måte, er mutert, Lost and Under Uttrykt i Human Kreft. PLoS ONE 8 (5): e63610. doi: 10,1371 /journal.pone.0063610
Redaktør: Deanna M. Koepp, University of Minnesota, USA
mottatt: 21 februar 2013; Godkjent: 05.04.2013; Publisert: 02.05.2013
Copyright: © 2013 Lockwood et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH), Targets Molecular Cobre, 8P20GM103482-10 (til LJB), Wendy Will sak Cancer Fund, GB220413 (til LJB), Kosair Pediatric Cancer Research Program award (til LJB). Dette arbeidet ble også støttet av NCI Cancer Center støtte stipend P30 CA08748 til Microchemistry og Proteomics Kjerne Laboratory (til HEB), Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Dette arbeidet ble også støttet, delvis ved NIH Grant P01 CA94060 og PA1 CA129243-01 (til Harold Varmus) og ved NIH utført NCI og NHGRI midler (til Harold Varmus). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ubiquitin ligase komplekser katalysere konjugering av ubiquitin på underlaget proteiner [1]. Ubiquitinering av proteiner kan ha en rekke virkninger på proteinfunksjon med den beste godt studert blir reguleringen av proteinstabilitet [2]. Ubiquitin ligase komplekser (også kalt E3 ubiquitin-ligaser) kommuniserer med en E1 (ubikvitin-aktiverende enzym), og en E2 (ubikvitin konjugere enzym) [1]. E1 og E2 enzymer er vanligvis delt mellom mange E3 ligaser og E3 komponenten er spesifisiteten faktor som samhandler direkte med underlaget proteiner. En type E3 ubiquitin ligase kompleks, SCF ubiquitin ligase komplekset, inneholder Skp1, Cullin1, ring BOX1 og et hvilket som helst av mer enn sytti F-boks inneholdende proteiner kodet i genomene til høyere eukaryoter [3], [4]. F-box domenet er ansvarlig for direkte å kommunisere med Skp1, mens de andre domener inneholdt i proteinet er ansvarlig for å kommunisere med og bringe substrat-proteiner inn i nærhet av ubiquitin ligase [5]. Viktigere er flere F-boks som inneholder proteiner godt karakterisert til å spille direkte rolle i dannelsen av kreft hos mennesker [6], [7], [8], [9], [10]. For eksempel, mutasjoner som fører til et tap av funksjon av FBXW7 eller BTRCP fører til stabiliseringen av deres beslektede substrat-proteiner, hakk, MYC og CyclinE eller beta catenin, henholdsvis, som alle er godt kjente onkogener [6], [9] [11], [12], [13], [14], [15].
COP9 signalosome er en mega-dalton store kompleks som består av minst åtte proteiner opprinnelig identifisert gjennom en genetisk skjermen i Arabidopsis [16], [17]. Den COP9 komplekset er kjent for å regulere et utvalg av ubiquitin ligase komplekser. Den nøyaktige mekanisme ved hvilken COP9 regulerer funksjonen av ubiquitin ligase komplekser er ikke helt forstått, men har blitt foreslått for å regulere interaksjonen mellom f-box proteiner og Skp1 ved å regulere konjugering av den lille proteinet nedd8 til Cullin1 [18], [19 ]. Syklusen av neddylation /de-neddylation letter ubiquitin ligase-substrat interaksjon og påfølgende omsetning på substratet. Dermed har aktiviteten til mange av disse ubiquitin ligase komplekser vist seg å kreve samspillet med COP9 signalosome fungerer. Interessant er flere komponenter av COP9 signalosome kjent for å ha COP9-uavhengige funksjoner, og har vist seg å bidra til kreft [20], [21], [22].
FBXW4 locus opprinnelig ble kartlagt som region på menneskelig kromosom 10 som var årsaks locus i lem misdannelse lidelse splittet hånd og fot 3 (SHFM3) [23], [24], [25], [26]. SHFM3 er en defekt i utviklingen av den apikale ectodermal ryggen under lem dannelse som forårsaker aplasi av de sentrale tallene fører til, i de mest alvorlige tilfellene, bare to tall per lem [27], [28]. Deretter ble det også funnet at Fbxw4 var også det geometriske sted er ansvarlig for en spontan mus utviklingsdefekt som lignet SHFM3 hos mennesker [29]. En rekke publikasjoner hevder at endring av FBXW4 er ansvarlig for mangler, etterfulgt av publikasjoner som tyder på oppstrøms locus koding Fgf8 kan være den skyldige [30], [31]. Til dags dato har ingen tilfredsstillende data unclouded problemet.
Uansett om FBXW4 bidrar årsaks til SHFM3, ble ingen molekylære eller biokjemiske funksjonen har blitt tilskrevet FBXW4. Ved å kombinere data mining, uttrykk studier, proteomikk og biokjemi har vi begynt å utvide vår kunnskap om FBXW4. Vi viser at Fbxw4 er en del av et ubiquitin ligase kompleks som inneholder Skp1, Cullin1, Rbx1 og COP9 signalosome. Montering av dette komplekset er avhengig av F-boks domene av Fbxw4. Viktigere, viser vi at FBXW4 locus er ofte slettet, under-uttrykt og somatisk mutert i kreft hos mennesker. Videre redusert FBXW4 uttrykk korrelerer med dårlig overlevelse av ikke-småcellet lungekreft pasienter. Tatt sammen, hypoteser om vi at FBXW4 kan være en verdsatt tumor suppressor i humane ondartede sykdommer i kraft av sin evne til å regulere funksjonen til signalbaner.
Materialer og metoder
RT-PCR-analyse av Fbxw4 uttrykk
QRT-PCR ble utført på «mus normalt vev qPCR panel jeg fra Origene katt. # MNRT101 (Rockville, MD, USA) ved hjelp av SYBR Grønn fra Applied Biosystmes (Foster City, CA, USA) med de angitte GAPDH oligos og «tre mus Fbxw4 rt «5»-GTCCTCATCATGCCCAGAGAAGAC-3′ med «5 mus Fbxw4 atg» 5 «-ATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATGC-3» eller «fem mus Fbxw4 rt» 5’GTCCTGTG GTTATGACACCTATG-3 «og» tre mus Fbxw4 ingen stopp «5′-TGGGTTCTGA AAGTCTAAGACGTG-3 «.
Plasmid konstruerer
Fbxw4 og Fbxo46 konstruksjonene ble kjøpt fra Origene (Rockville, MD, USA) og brukes som PCR maler. (. Fbxw4 katt # MMM1013-7512491; Fbxo46 katt # MMM98477851.). Fbxo46 ble forsterket med følgende oligos hjelp Vent DNA polymerase (NEBL, Ipswich, MA, USA): mus Fbxo46 ATG RI, 5’GCGCGAATTCACCATGGACAGGGGCAGCCTCCTGCCC-3 «; mus Fbxo46 ingen stoppe Sali, 5’GCGCGTCGACCCTCCCCTCTTCCCGGCCAGC-3 «. PCR forsterket fragmenter ble klonet inn TOPO sløv kloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The full-lengde Fbxo46 ble deretter fordøyd med EcoRI og Sali og klonet inn pBABE-FLAG vektor, fordøyd EcoRI og XhoI, som inneholder en 3 «FLAG epitop tag ned strømmen og i rammen fra XhoI nettstedet er FLAG epitop deretter fulgt av stoppkodoner og et Sall nettsted. Fbxo46 med en 3 «i-frame FLAG tag ble så fordøyd av pBABE med EcoRI og Sali og klonet inn i EcoRI og Xhol sete av retroviral vektor MIGRX.
Fbxw4 ble forsterket fra origene klone med Vent DNA polymerase med følgende oligonukleotidene: mus Fbxw4 ATG RI, 5′- GCGCGAATTCACCATGGCGGAGGACGCGGCGGAGGATG-3 «; mus Fbxw4 flagg stoppe XhoI, 5’GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG-3 «. PCR forsterket fragmenter ble klonet inn TOPO sløv. Full lengde Fbxw4 inneholder en in-frame 3 «FLAG tag ble deretter gjenopprettet ved å fordøye EcoRI og XhoI. Dette fragment ble deretter klonet inn i EcoRI- og Xhol områder av MIGRX
Fbxw4
-fbox ble amplifisert fra full-lengde Fbxw4 TOPO klon ved anvendelse av følgende oligonukleotider:. Fbxw4 flagg stoppe Xhol, 5′- GCGCCTCGAGTTACTTATCGTCGTCATCCTTATAATCCATTGGGTTCTGAAAGTCTAAG -3 «, mus Fbxw4 -fbox EcoRI, 5-GCGCGAATTCACCATGGCCCGGGCCTCGCTCAACACC-3». PCR forsterket fragment ble klonet i EcoRI og Xhol områder av MIGRX.
pRK5-HA-Ubiquitin Addgene # 17608 avsatt av Ted Dawson [32].
Cell kultur
293 T-celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og dyrket i DMEM supplert med 10% FBS. DNA-transfeksjoner i 293 T-celler ble utført ved bruk av PEI, i et forhold på 2,5 mikrogram av PEI /mikrogram DNA. Alle celleekstrakter ble fremstilt ved å følge skrape høsting av 293-T-celler ved hjelp av CHAPS lyseringsbuffer (1% CHAPS detergent, 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7, 5 mM EDTA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalyse-reagens fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) cat # 23225. 30 ug totalt protein ble anvendt for standard Western blot prosedyre. Kjemiluminescens deteksjon ble utført ved hjelp SuperSignal WestFemto fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) i henhold til produsentens protokoll.
immunoutfellinger
200 ug protein ble inkubert i 400 ul av totalt CHAPS buffer og inkuberes med 15 ul av indikert affinitetsmatriks i en time ved 4 grader Celsius. Etter inkubering, ble grunnmassen vasket tre ganger i CHAPS-buffer og deretter SDS applikasjonsbuffer ble tilsatt direkte i matrisen vasket, kokt, og lastet direkte inn i brønner på en PAGE-gel. Medikamentelle behandlinger ble utført som beskrevet i teksten ved hjelp av 25 um MG132.
Antistoffer
Tubulin # B512, FLAG M2 konjugert agarose perler, FLAG poly-klonal # F7425 (Sigma, St. Louis, MO, USA); HA affinitet matrise og HA # 3F10 (Roche, Indianapolis, IN); Ubiquitin # 3933 (cellesignalisering Technologies, Beverly, MA, USA); SKP1 katt. # Ab10546 og COPS2 /TRIP15 katt. # Ab4537 (Abcam, Cambridge, MA, USA); COPS5 /JAB1 katt. # Sc-9074 (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA).
Immunpresipitasjon og Protein Identifikasjon av nano-væske Kromatografi par å Tandem massespektrometri (LC-MS /M)
10-150 mm plater av 293 t-celler ble transient transfektert bruker Fugene6, som per produsentens protokoll (Roche, Indianapolis, IN). 48 timer etter transfeksjon ble cellene høstet ved skraping i kulden. CHAPS lysater ble fremstilt og kvantifisert som beskrevet ovenfor. 50 mg av total lysat ble inkubert med FLAG konjugert agarose perler (Sigma, St. Louis, MO, USA) over natten ved 4 grader med milde rocking. Agarosekuler ble tilsatt til en kolonne og vasket med 10 ganger kolonnevolum ved tyngdekraftstrømning av. Kolonnen ble avkortet og en perlevolum på FLAG-peptid (oppløst i PBS ved en konsentrasjon på 5 mg /ml og deretter fortynnet 1:10 i CHAPS-buffer) ble tilsatt til kolonnen og inkuberes i 30 minutter ved 4 grader. Kapselen ble fjernet, og ~ 100 ul fraksjoner ble oppsamlet som elueringen strømmet gjennom ved hjelp av gravitasjon. 50% av hver fraksjon (~ 5 fraksjoner) var vestlige utslettet med anti-FLAG antistoff. Vanligvis er den første fraksjon var blottet for målproteinet og enten fraksjon 2 eller 3 hadde mesteparten av målproteinet. ~40% Av fraksjonen som inneholdt mesteparten av FLAG-merke rensede protein ble delvis løst ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese; blandingen ble konsentrert i en enkelt, 3 mm bred «stack» av electrophoresing gjennom en SDS «stable gel «til å skrive inn» separasjon gel «, etterfulgt av kort farging med Coomassie blå og fjerning av stablet proteinbåndet. Prøveopparbeidelse og massespektrometri ble utført nøyaktig som beskrevet tidligere [33].
Stillas (Proteome Software Inc., Portland, Oregon), versjon 3_6_1 ble brukt til å videre validere og krysstabulere MS /MS-baserte peptid og protein identifikasjoner. Protein og peptid sannsynlighet ble satt til 95% med et minimum peptid krav om en.
Resultater
Fbxw4 er et felles nettsted for førvirus innsetting og uttrykkes løst i normale murine vev
identifisering og karakterisering av nye gener og genprodukter har ført til en overveldende mengde offentlig tilgjengelige data og datasett. Vi lurte på om gruvedrift disse tilgjengelige datasettene kunne produsere hypotesegenererende observasjoner omkring potensielt interessante gener. En slik database er «retrovirale taggede kreft genet database», som er et oppbevaringssted for provirale Innleggelse kloner fra ulike etterforskere søker etter nye gener som kan bidra til leukemogenesis (og mer nylig transposon-mediert mutagenese studier i blodkreft og solide maligniteter). Vanlige områder av proviral integrasjon er loci som gir en selektiv fordel til celler ved disregulating ekspresjon av cellulære gener. Som støtte, de fleste av de vanligste stedene i førvirus innsetting er bona fide onkogener eller tumor dempere. Vi søkte denne database, og fant at Fbxw4 gen locus var den eneste locus i den 30 mest identifisert innsetting loci som ikke har blitt foreslått å spille en rolle i kreft eller biokjemisk blitt karakterisert. Det har vært til dags dato, 13 innstikk klonet fra i det kodede Fbxw4 genet og innsettinger har blitt klonet i både forover- og returretningen (figur 1A). Disse dataene kan tyde på at proviral innsetting i locus kan føre til tap av Fbxw4 funksjon.
A. Undersøkelse av UCSC genom nettleser (genome.ucsc.edu) og Retroviral Tagged Cancer Gene Database (https://variation.osu.edu/rtcgd/index.html) viser at flere retrovirale innsett har blitt klonet fra i transkribert Fbxw4 locus. Pilene viser retningen på de innsatte provirus. Eksonene er vist nederst og posisjonen og omfanget av murin kromosom 19 er vist på toppen. Navnene på klonede provirale innsett er angitt til venstre. Innleggelse begynner med «MMT» ble klonet fra mus brystsvulstvirusinduserte brystcarcinomer. Innleggelse begynner med «DKM», «248» og «B5» ble klonet fra leukemi fra murine leukemi virus akselerert blodkreft kreft. B. FBXW4 er variabelt uttrykt i normale murine vev. Oligoer som er spesifikke for muse-Fbxw4 ble brukt til å utføre kvantitativ RT-PCR på «normal mus cDNA TissueScan matrise «. Verdier ble normalisert til kvantitativ RT-PCR for GAPDH. C. Skjematisk av Fbxw4 protein. Tallene representerer aminosyrene i proteinet. Domener som finnes Fbxw4 indikeres.
At Fbxw4 aldri har vært preget bedt oss om å undersøke uttrykket av dette locus i mer detalj. Først fant vi ut hva uttrykket mønster av Fbxw4 mRNA er over normale murine vev. Ved å bruke cDNA fremstilt fra forskjellige musevev vi har observert en slående grad av ekspresjon spesielt i involuting brystkjertel (figur 1B). Dette antyder muligheten for at Fbxw4 uttrykk er økt, og kan bidra i en apoptotisk prosess.
Fbxw4 samhandler med komponenter av en E3 ubiquitin ligase og COP9 signalosome
Et protein motiv algoritme viser at Fbxw4 protein inneholder en F-boks domene, et motiv som vanligvis innblandet i interaksjoner med E3 ubiquitin ligase kompleks og fem WD-40 motiver, som er kjent med protein-protein interaksjon moduler (figur 1C). Til tross for den genetiske arbeid på Fbxw4 locus, har det ikke vært noen studier som undersøker den biokjemiske funksjon av Fbxw4. Som et første forsøk på å forstå den mulige funksjon Fbxw4 vi utført immunoprecipitation på FLAG-merket Fbxw4 fulgt av massespektrometri for å identifisere, på en objektiv måte, Fbxw4 samspill proteiner (Figur 2A). To kontroller ble utført for å hjelpe til med tolkning av dataene; immunoprecipitation av cellelysatene uttrykker bare FLAG epitop tag (forts.) eller immunoprecipitation av cellelysatene uttrykker et FLAG-merket F-box «bare» inneholder protein (Fbxo46) ble utført. Data fra disse forsøkene viste at Fbxw4, og ikke kontroll, immunoutfelt komponentene i en E3 ubiquitin ligase (SKP1 og CUL1) og komponentene i COP9 signalosome, mens både F-boks som inneholder proteiner interaksjon med SKP1. Interessant, en peptid som tilsvarer RBX1 ble også identifisert i FLAG-immunoprecipitation fra Fbxw4 uttrykker lysatene og ikke fra de andre lysatene (ikke vist)
A. Tabell representerer antall unike peptider identifisert fra en representant massespektrometri eksperiment følgende FLAG immunoprecipitation fra lysater av kontrollceller bare uttrykker FLAG «kontr.», Eller celler som uttrykker FLAG-Fbxw4 eller FLAG-Fbxo46. Kolonne på venstre angir størrelsen på samspill protein, i kilo-dalton (kDa). Genet navn av proteiner som inneholder de identifiserte peptider er vist i den høyre kolonne. Komponenter i en E3 ubiquitin ligase kompleks er skyggelagt i lys grå; komponenter i COP9 signalosome er skyggelagt mørk grå. B. Validering av data massespektrometri data ved immunoprecipitation fulgt av western blot. 293 T-celler ble transfektert med plasmider inneholdende FLAG- Fbxw4, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 48 timer etter transfeksjon cellelysater ble utarbeidet og immunoutfellinger ble utført med mono-klonale anti-FLAG antistoffer (M2) (til immunpresipitere Fbxw4- eller Fbxo46-samspill komplekser). Western blot ble utført for å påvise Fbxw4 eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistoff, topp panel), SKP1, COPS5, eller COPS2. C. Ekspresjon av Fbxw4 endrer migrering av endogen SKP1 ved gelfiltreringskromatografi. 293 T-celler ble transfektert med en tom vektor (venstre panel) eller en cplasmid inneholder FLAG-Fbxw4 (høyre panel). 48 timer etter transfeksjon cellelysater ble fremstilt og separert på en superpose6 gelfiltreringskolonne. Western blot ble utført på hver fraksjon å oppdage Fbxw4 (toppfeltene) eller SKP1 (bunnpaneler). I fravær av Fbxw4 SKP1 eluerer med en topp ved fraksjon 23, mens når Fbxw4 blir uttrykt er det co-eluering av Fbxw4 med topper ved fraksjon 15 og i tomvolumet. Størrelse standarder som elueres fra gitte brøker vises.
For å validere data fra massespektrometri vi utført immunoutfellinger fulgt av vestlige blotter med antistoffer som er spesifikke for de identifiserte proteiner. Nye lysatene ble forberedt på at uttrykt enten FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxo46, eller FLAG eneste kontrollen (figur 2B). Data innhentet viser at både Fbxw4 og Fbxo46 samhandle med SKP1, men bare Fbxw4 samhandler med komponenter av COP9 signalosome.
For å styrke funn som Fbxw4 kan samhandle med endogen SKP1 vi utført gelfiltreringskromatografi på cellelysater tilført ytterligere med en tom vecotor eller en vektor uttrykk FLAG-Fbxw4 (figur 2C). Fraksjoner erholdt fra kromatografien, ble western blottet med anti-SKP1 antistoff. Celler som ikke uttrykker eksogent Fbxw4 inneholde SKP1 som eluerer i en fraksjon som tilsvarer mindre enn 67 kDa, mens ekspresjon av Fbxw4 fører til co-eluering av SKP1 med Fbxw4 i to nye komplekser av over 200 kDa og et kompleks som eluerer i tomrommet . Den endret migrering av SKP1 i to nye fraksjoner som co-eluer med Fbxw4 støtter finne Fbxw4 samhandler med komponenter av en E3 ligase kompleks.
Fbxw4 samhandler med SKP1 og COP9 signalosome i en F-box avhengig måte
for å begynne å fastslå den nøyaktige biokjemiske funksjon av Fbxw4, ønsket vi å vite hvilke interaksjoner avhengig av F-box domene. For dette formål konstruerte vi et FBXW4 konstruksjon som mangler de første 71 aminosyrer, betegnet Fbxw4
-fbox (figur 3A). Igjen, immunoprecipitation fulgt av massespektrometri ble utført fra cellelysater uttrykker FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4
-fbox, eller FLAG bare for å finne ut hva proteiner samhandle med de respektive proteiner. Ingen peptider tilsvarende komponenter i E3 ubiquitin ligase eller komponenter av COP9 signalosome ble identifisert med Fbxw4
-fbox, mens disse proteinene ble nok en gang funnet å samhandle med Fbxw4 (figur 3B). For å validere data fra massespektrometri vi utført immunoutfellinger fulgt av vestlige blotter med antistoffer som er spesifikke for de identifiserte Fbxw4 samspill proteiner. Lysates var forberedt på at uttrykt enten FLAG-FBXW4, FLAG- Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46, eller FLAG bare kontroll. Data viser at Fbxw4 og Fbxo46, men ikke Fbxw4
-fbox samhandle med SKP1 (figur 3C).
A. Skjematisk av Fbxw4
-fbox protein. Tallene representerer aminosyrene i proteinet. Domener som finnes Fbxw4
-fbox indikeres. B. Tabell representerer antall unike peptider identifisert fra en representant massespektrometri eksperiment følgende FLAG immunoprecipitation fra lysater av kontrollceller uttrykker FLAG bare «kontr.», Eller celler uttrykker FLAG- Fbxw4 eller FLAG- Fbxw4
-fbox. Kolonne på venstre angir størrelsen på samspill protein, i kilo-dalton (kDa). Genet navn av proteiner som inneholder de identifiserte peptider er vist i den høyre kolonne. Komponenter i en E3 ubiquitin ligase kompleks er skyggelagt i lys grå; komponenter i COP9 signalosome er skyggelagt mørk grå. C. Validering av data massespektrometri data ved immunoprecipitation fulgt av western blot. 293 T-celler ble transfektert med plasmider som inneholder FLAG-Fbxw4, FLAG-Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 48 timer etter transfeksjon cellelysater ble utarbeidet og immunoutfellinger ble utført med mono-klonale anti-FLAG antistoffer (M2) (til immunpresipitere Fbxw4-, Fbxw4
-fbox-, eller Fbxo46-samspill komplekser). Western blot ble utført for å påvise Fbxw4, Fbxw4
-fbox eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistoff, topp panel). Eller SKP1
FBXW4 samhandler med ubiquitinmolekyler cellulære proteiner
Vi har entydig vist at Fbxw4 samhandler med en E3 ubiquitin ligase komplekse og COP9 signalosome. Vi hevdet at Fbxw4 ville samhandle med ubqiuitinated proteiner i cellen. Det er kjent at for mange substrater av E3 ubiquitin-ligaser, ubiquitinering av substratet protein fører til rask frigjøring fra komplekset. Vi antok derfor at inhibering av proteasomet ville føre til en opphopning av de cellulære proteiner ubiquitinmolekyler ved Fbxw4 ligase komplekset. Således akkumulering av ubiquitinmolekyler vil i sin tur føre til anrikning av interaksjoner mellom Fbxw4 og ubiquitinmolekyler substrater. Cellene ble transfektert med en tom vektor (v), HA-Ubiquitin, eller HA-Ubiquitin og FLAG-Fbxw4. 36 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med den proteasominhibitor, MG132, i seks timer. Celleekstrakter ble utarbeidet og immunopresipitert med anti-HA antistoff fulgt av western blot for Fbxw4 (figur 4A, topp panel). En økt mengde av Fbxw4 ble funnet å samvirke med ubiquitinmolekyler følgende MG132 behandling. Dette Fbxw4 syntes å være normal molekylvekt som tyder på en økt sammenslutning av FBXW4 med ubiquitinmolekyler og ikke en økning i ubiquitated Fbxw4. Videre den økte mengden av Fbxw4 som immunopresipitert med anti-HA antiobody var ikke på grunn av en økning i den totale mengden av Fbxw4 siden det var en liten nedgang i den totale mengden av Fbxw4 følgende MG132 behandling (figur 4A, nedre panel). Som ytterligere støtte for denne tanken, var det en økning i den totale nivåer av ubiquitinmolekyler og en økning i mengden av ubiquitinmolekyler som immunopresipitert med Fbxw4 etter immunoutfelling av Fbxw4 fra de samme lysatene følgende MG132 behandling (figur 4A, midtre panel).
A. Fbxw4 kan immunopresipitert ved ubiquitinmolekyler og Fbxw4 kan immunpresipitere ubiquitinmolekyler. 293 T-celler ble transfektert med tom vektor (v), HA-Ubiquitin, eller HA-Ubiquitin og FLAG-Fbxw4. 36 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med MG132 (+) eller ubehandlet (-) i seks timer. Cellelysater ble utarbeidet og immunoutfellinger ble utført med enten anti-HA-antistoffer (topp to paneler) eller mono-klonale anti-FLAG antistoffer (M2) (to nederste paneler). Western blots ble utført på begge sett av immunoutfellinger med anti-FLAG og anti-HA-antistoffer. B. FBXW4 forbinder med cellulære proteiner som er endogent ubiquitinmolekyler. 293 T-celler ble transfektert med plasmider som inneholder FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46 eller en tom vektor (v). 36 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med MG132 (+) eller ubehandlet (-) i seks timer. Cellelysater ble utarbeidet og immunoutfellinger ble utført med mono-klonale anti-FLAG antistoffer (M2) (til immunpresipitere Fbxw4-, Fbxw4
-fbox-, eller FBXO46-samspill komplekser). Western blot ble utført for å påvise Fbxw4, Fbxw4
-fbox eller Fbxo46 (FLAG rb; polyklonale FLAG antistoff, topp panel). Eller Ubiquitin
Vi ønsket å vite om lignende resultater ville bli oppnådd ute ved endogene ubiquitin, i motsetning til over-uttrykte HA-ubiquitin. I tillegg ønsket vi å finne ut om de tidligere observerte resultatene var avhengig av en intakt F-box domene. For å oppnå dette, ble cellene transfektert med FLAG-Fbxw4, FLAG- Fbxw4
-fbox, FLAG-Fbxo46, eller FLAG bare kontrollere vektor (v). Celler ble enten behandlet med bærer eller MG132 i seks timer og cellelysatene ble fremstilt. Immunoutfelling med anti-FLAG antistoffer ble utført og vestlige blotter ble utført for å påvise endogene ubiquitin eller flagg-merkede proteiner. Vi har observert en dramatisk økning i mengden av ubiquitin som er knyttet til Fbxw4. Dette resultatet var ikke bare på grunn av over-uttrykk for Fbxw4 siden verken Fbxw4
-fbox eller Fbxo46, som ble uttrykt til høyere nivåer, viste en økt interaksjon med ubiquitinmolekyler følgende MG132-indusert hemming av proteasome. Disse data indikerer at et intakt, F-boks domene er nødvendig for tilknytning av Fbxw4 med ubiquitinmolekyler og ikke alt, F-boks inneholdende proteiner er i stand til slike dramatiske økning interaksjoner med ubiquitinmolekyler cellulære proteiner etter hemming av proteasomet. Selv om samspillet mellom Fbxw4 og cellulære ubiquitinmolekyler er avhengig av en intakt f-box domene mer arbeid er nødvendig for å fastslå om disse proteinene er bona fide underlag av SCFFbxw4 ubiquitin ligase kompleks eller bare proteiner som samhandler med den komplekse gjennom alternative mekanismer.
FBXW4 er mutert, fortapt og under uttrykt i humane kreft
for å begynne å ta opp muligheten for at FBXW4 er viktig i menneskelig kreft vi undersøkt om genet er mutert i kreft hos mennesker. Ved å spørre tilgjengelige offentlige databaser (The Cancer Genome Atlas (TCGA) prosjekt og Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) fra Sanger Institute) fant vi at FBXW4 er somatisk mutert i sju av ~470 svulster som har vært sekvens, så langt (figur 5A). To av mutasjonene er stille og ikke fører til endringer i aminosyresekvensen til proteinet, men interessant nok, blir de fire missense mutasjoner (R96, G106, R145 og R367) evolusjonært konservert hele veien ned til noen arter av Drosophila. Faktisk ble R96L, G106W og R367C spådd å forstyrre proteinfunksjon med en meget høy signifikans (p = 0,0003) ved anvendelse av ProPhylER algoritme. I tillegg til disse forutsagte skadelige mutasjoner, en rammeskift-mutasjon, E245fs *, ble observert i en brystkreft pasient som ville føre til produksjon av en FBXW4 protein som mangler de siste tre WD-40 motiver (figur 5A). Oppdagelsen av at somatiske mutasjoner funnet i humane kreftformer er spådd til å forstyrre kritiske aspekter av FBXW4 funksjon styrker muligheten for at FBXW4 regulerer viktige homeostatiske prosesser.
A. FBXW4 er somatisk mutert i kreft hos mennesker. Kreft Genome Atlas (TCGA) prosjektet og Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) fra Sanger Institute ble spørres for somatiske mutasjoner i FBXW4. Av ~470 svulster som ble analysert for mutasjon i FBXW4, ble fem somatiske mutasjoner observert ved aminosyrene er indikert på den skjematiske. Interessant, er de fire enkle aminosyrer som er mål for mutasjoner (R96, G106, R145 og R367) evolusjonært konservert i Drosophila. R96L, G106W og R367C er spådd til å forstyrre protein funksjon (betydning p = 0,0003, bruker ProPhylER algoritme) og E245fs * mutasjon produserer et protein som mangler de siste to og et halvt WD-49 motiver. B. FBXW4 er ofte tapt i kreft hos mennesker. Hyppigheten av DNA kopiantall tap /sletting over 719 humane kreftcellelinjer som representerer ulike vev av opprinnelse fra Sanger Institutes Cancer Genome Project blir presentert sammen med frekvensen i de enkelte krefttyper med n ≥ 5. C. FBXW4 er underexpressed i kreft cellelinjer med kopi nummer tap. Boksplott illustrerer mRNA uttrykk nivåer for cellelinjer med tap /sletting og de uten tap /sletting for alle kreftcellelinjer fra B. med tilsvarende genuttrykk microarray profiler blir presentert sammen med uttrykk i de fire individuelle krefttyper med den høyeste frekvensen av tap /sletting (hud, bryst, sentralnervesystemet (CNS) og lungekreft). Expression nivåer ble sammenlignet mellom de to gruppene med Mann-Whitney U-test og en p 0,01 ble betraktet som signifikant. Whiskers representerer 10-90 prosentilene med prikker som viser de uteliggere. D. FBXW4 er tapt og under uttrykt i kliniske lunge adenokarsinom svulster fra TCGA prosjekt.
