Abstract
Bakgrunn
The Hippo pathway regulerer organ størrelse ved å hemme celleproliferasjon og fremme celle apoptose på sin aktivering. The Yes Associated Protein 1 (YAP1) er en kjernefysisk effektor av Hippo veien som fremmer cellevekst som en transkripsjon co-aktivator. I human kreft, ble det YAP1 genet rapportert som forsterkes og overuttrykt i mange tumortyper.
Methods
Immunohistokjemisk farging av YAP1 protein ble anvendt for å vurdere ekspresjonen av YAP1 i pankreas tumorvev . siRNA oligonukleotider ble brukt for å knockdown ekspresjon av YAP1 og deres effekt på kreft i bukspyttkjertelen celler ble undersøkt ved anvendelse av celle proliferasjon, apoptose, og forankringsuavhengige vekstmålinger. Den Wilcoxon signed-rank, Pearson korrelasjonskoeffisient, Kendall Tau, Spearmans Rho, og en uavhengig to-utvalg
t plakater (tosidige) test ble benyttet for å bestemme den statistiske betydningen av dataene.
Resultater
immunhistokjemi studier i bukspyttkjertelen tumorvev avslørt YAP1 fargingsintensitet var moderat til sterk i kjernen og cytoplasma av tumorceller, mens tilstøtende normalt epitel viste negativ til svak flekker. I dyrkede celler, ble YAP1 ekspresjon og lokalisering modulert av celletetthet. YAP1 total protein uttrykk økt i de kjernefysiske fraksjoner i BxPC-3 og PANC-en, mens den gikk ned i HPDE6 som celletettheten økes. I tillegg behandling av bukspyttkjertelkreft cellelinjer, BxPC-3 og PANC-en, med YAP1-målretting siRNA oligonukleotider betydelig redusert spredning
in vitro
. Videre behandling med YAP1 siRNA oligonukleotider redusert forankringsuavhengig vekst på soft agar av kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som tyder på en rolle YAP1 i bukspyttkjertelkreft tumorigenesis.
Konklusjoner
YAP1 er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft vev og potensielt spiller en viktig rolle i clonogenicity og vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Diep CH, Zucker KM, Host G, Watanabe A, Hu C, Munoz RM, et al. (2012) nedregulering av Ja Associated Protein en Expression Reduserer celleproliferasjon og Clonogenicity av kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (3): e32783. doi: 10,1371 /journal.pone.0032783
Redaktør: Robert Oshima, Sanford Burnham Medical Research Institute, USA
mottatt: 1 juni 2011; Godkjent: 02.02.2012; Publisert: 01.03.2012
Copyright: © 2012 Diep et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av Utsmykkingsfondet for Cancer Research, Katz familien, og Helios Scholars Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Som en av de mest dødelige formene for menneskelig sykdom, har kreft i bukspyttkjertelen ett år og fem års overlevelse på 26% og 6%, henholdsvis [1]. Det eksisterer et kritisk behov for nye behandlingsstrategier for å gi en målrettet virkning på overlevelse av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
flodhest pathway regulerer organ størrelse ved inhibering av celleproliferasjon og fremmer celle apoptose [2], [3] . Komponenter av Hippo veien ble identifisert genetiske mosaikk skjermer i
Drosophila
, som består av Hippo (HPO) kinase, Salvador (SAV) adapter protein, den WTS protein kinase, Mats adapter protein, og Yorkie (Yki) atom transkripsjonen co-aktivator. Ved veien aktivering, HPO og Sav fosforylerer og aktiverer WTS sammen med Mats. WTS phosphorylates Yki å inaktivere og beholde den i cytoplasma. I pattedyr, er komponentene til flodhesten pathway sterkt konservert homologer, som inkluderer MST1 /2 (HPO), WW45 (Sav), LATS1 /2 (WTS), MOB1 (Mats), og YAP1 (Yki) [4] – [ ,,,0],8].
i likhet med
Drosophila
modell, pattedyr Hippo kjernekomponentene danne protein kinase komplekser som opptrer i en kaskade å fosforylere YAP1 (også kjent som YAP eller YAP65) og flytte den til cytoplasma [6], [7], [9], [10]. Som den store nedstrøms målet for Hippo vei, er YAP1 et paradoks. Som et onkogen, blir forsterkningen av YAP1 gen locus ved 11q22 finnes i flere krefttyper, inkludert leverkreft, brystkreft, orale squamous cell carcinoma, Medulloblastomas, og spiserøret squamous cell carcinomas [11] – [15]. I tillegg har overekspresjon av YAP1 protein og dets nukleære lokaliserings blitt bemerket i tykktarm, lever, lunge, eggstokk, prostata cancer og [6], [12], [16]. Overholtzer og medarbeidere rapporterte at overekspresjon av YAP1 i en immortalisert epitelcellelinje MCF10A resulterte i dets onkogene transformasjon [11]. I motsetning til dette ble YAP1 også funnet å stabilisere og forbedre p73-avhengig apoptotisk celledød i løpet av cisplatin-indusert skade på DNA [17]. AKT, en nøkkelspiller i flere cellulære overlevelsesreaksjonsveier, er blitt vist å fosforylere YAP1 for å undertrykke pro-apoptotiske genekspresjon [18]. I en undergruppe av brystkreft ble YAP1 proteinekspresjon betydelig redusert på grunn av tap av heterozygositet og shRNA knockdown av YAP1 økt migrasjon, invasivitet og forbedret tumorvekst [19]. Samlet er disse funnene tyder på at YAP1 uttrykk og rolle i kreft kan være celletype og /eller cellulær kontekstavhengig.
I denne studien har vi søkt å belyse rollen YAP1 i bukspyttkjertelkreft. Vi undersøkte YAP1 protein uttrykk og lokalisering i bukspyttkjertelen tumorvev tatt fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og undersøkte fenotypiske effekter av YAP1 nedregulering i dyrkede bukspyttkjertelen cellelinjer. Vi har funnet ut at YAP1 er overuttrykt i bukspyttkjertelen tumorvev, og nedregulering av YAP1 avtok spredning og clonogenicity av dyrkede kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Cell Culture
bukspyttkjertelkreft cellelinjer ASPC-1, BxPC-3, CAPAN-en, CFPAC-en, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, og Panc-1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia). Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gemini Bio-Products, Woodland, CA), penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 mg /ml) (Invitrogen). De udødeliggjort human pankreatisk duktus epitelcellelinje, HPDE6, ble gitt av Dr. MS Tsao (University of Toronto, Canada) og dyrket i keratinocytt-serumfritt medium supplert med bovint hypofyseekstrakt (30 ug /ml) og epidermal vekstfaktor (0,2 ng /ml) (Invitrogen) [20], [21]. De udødeliggjort human pankreatisk duktus epitelcellelinje, hTERT-HPNE, ble oppnådd fra ATCC og dyrket i DMEM media supplert med 20% FBS [22]. Alle celler ble rutinemessig dyrket i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Cellelinje identiteter ble verifisert som tidligere beskrevet [23].
Tissue microarray og Immunohistochemistry (IHC)
En vev microarray (TMA) ble konstruert fra parafininnstøpte blokker med 66 unike tilfeller av bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer, 5 tilfeller av kronisk pankreatitt og 6 normal pankreas prøvene som tidligere beskrevet [24]. For hver kreft tilfelle ble to tumorkjerner og en tilstøtende normal kjernehullet for TMA. Den TMA blokkene ble seksjonert ved 5 mikrometer tykkelse, overføres ved flotasjon vann, og tørket over natten ved romtemperatur. Glassene ble avvokset, rehydrert og antigen hentet on-line på BondMax ™ Autostainer (Leica Microsystems, Inc Bannockburn, IL). Alle plater ble utsatt for varmeinduserte epitop hentes ved hjelp av en EDTA-basert henting løsning (Leica Micro) i 20 minutter. Endogen peroksidase og biotin ble blokkert. Den TMA seksjoner ble inkubert i 30 minutter ved 1:125 med YAP1 (H-125) antistoff fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Seksjonene ble visualisert ved hjelp av Bond ™ Polymer Begrens Detection kit (Leica Microsystems) ved hjelp av diaminobenzidin kromogen som substrat og scoret som tidligere beskrevet [24]. Den Wilcoxon signed-rank test ble brukt for å sammenligne nivået av YAP1 uttrykk mellom svulsten og tilstøtende normale prøver. Den Wilcoxon rank sum test ble brukt for å sammenligne YAP1 uttrykk mellom svulst og pankreatitt samt normal bukspyttkjertel prøver fra en egen gruppe av fag. Pearsons korrelasjonskoeffisient ble brukt til å estimere og teste sammenhengen mellom atom YAP1 uttrykk og histopatologiske parametre (tumor klasse, scene, og sykdom i regionale lymfeknuter), og sensitivitetsanalyse ble utført ved hjelp av Kendall tau og Spearmans rho.
YAP1 Immunoblotting Analyse
for å oppnå den nødvendige celletetthet etter 48 timer med vekst, BxPC-3, PANC-en, og HPDE6 celler ble sådd på følgende måte i T175 cm
2 kolber i fullstendig vekstmedier: to millioner celler for 20-30%, fire millioner celler for 50-70%, og sju millioner celler for 100%. Cellene ble vasket med DPBS, trypsinert, og deretter talt på Cellometer Auto T4 (Nexcelcom Biosciences, Lawrence, MA). Fire millioner celler ble brukt for sub-cellulær fraksjonering ved hjelp av BioVision Nuclear /cytosolic Fraksjone Kit (Mountain View, CA) ved å følge produsentens protokoll. For å generere helcellelysater en million celler ble lysert i RIPA-buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) med 1X protease og fosfatase-inhibitor cocktail (Roche) og inkubert på is i 30 minutter. Ekstraktene ble sentrifugert ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av bicinchoninic syre (BCA) proteinanalyse (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL). En total på 20 ug protein per kjørefelt ble separert ved 4-12% NuPAGE Bis-Tris-gel-elektroforese (Invitrogen). Blottene ble inkubert med enten en Phospho-YAP1 (Ser127) antistoff (Cell Signaling) ved 1:2000 fortynning eller en total YAP1 (H-125) antistoff (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) på 1:2000 fortynning overnatter på 4 ° C og deretter eksponert for anti-kanin-IgG-HRP-bundet antistoff (Cell Signaling) ved 1:3000 fortynning ved romtemperatur i 1 time. PARP (Cell Signaling) på 1:2000 fortynning tjente som lasting kontroll for atomfraksjonen, mens α-tubulin (Cell Signaling) på 1:2000 fortynning fungerte som kontrollgruppe for helcellelysater og cytosoliske brøkdel.
siRNA behandling og celleproliferasjon Analyser
YAP1 uttrykk stanse ble oppnådd med to YAP1 siRNA duplex oligonukleotider rettet mot to forskjellige regioner i YAP1 transkripsjon (Qiagen, Valencia, CA) ved en endelig konsentrasjon på 20 nM bruke siLentfect transfeksjon reagens (Bio-Rad) ifølge produsentens protokoll. De sirnas ble revers-transfektert ved å inkubere sirnas i 10 pl serumfritt RPMI 1640 cellekulturmedia (Invitrogen) inneholdende 50 pl av siLentfect lipid reagens (Bio-Rad) blanding per brønn og oppstilt i 96-brønners plater. Den sirnas og transfeksjon av reagens ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Etterpå ble cellene sådd ut til den siRNA-transfeksjon reagens blanding ved 4800 celler /brønn og serum-supplert til en sluttkonsentrasjon på 5% for BxPC-3 og 2% for PANC-1. For HPDE6 cellelinjen, 6000 celler /brønn ble sådd ut for å siRNA-transfeksjon reagensblanding i keratinocytt medium. Platene ble lagret i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO
2. Etter 24 timer ble transfeksjon media fjernet fra hver brønn og erstattet med friskt serum-supplert vekstmedier. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved tilsetning av 100 ul av den CellTiter-Glo Luminescent Assay (Promega, Madison, Wisconsin) til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en time, og luminescens ble spilt inn med Synergy HT mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT).
apoptose og cellesyklusanalyse
transfeksjon av YAP1 sirnas inn i de pankreatiske cellelinjer var som beskrevet i de celleproliferasjonsprosesser studiene ovenfor. Nitti-seks timer etter innledende transfeksjonen ble caspase-3 og -7 aktiviteter bestemmes ved tilsetning av 100 ul av caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en time, og luminescens ble tatt opp med den Synergy HT mikroplateleser (BioTek). Caspase-aktivitet i celler behandlet med siRNA ble normalisert til den av cellene bare kontroll.
Cell syklus analyse av YAP1 siRNA behandlet pankreatiske cellelinjer ble som tidligere beskrevet [23].
Anchorage- uavhengige analyser
i 6-brønns plater, 250.000 celler (BxPC-3 og PANC-1) ble revers transfektert med 20 nM av den YAP1 sirnas (Qiagen) i 48 timer (og 72 timer for proteinekstraksjon og immunoblot analyse). Cellene ble vasket med DPBS, trypsinert og telt ved trypanblått-eksklusjon. Seks tusen levedyktige BxPC-3-celler og levedyktige 3000 PANC-1-celler ble blandet med 1 ml vekstmedier og 0,3% agar og deretter lagvis på 0,5% agar-senger på 35 mm gitter retter. Celler ble tillatt å vokse i 21 dager, og hele området av fatet ble tellet. Kolonier større enn 50 celler ble regnet som positiv for transformasjon. Analyser ble utført i tre eksemplarer.
Celler igjen fra transfeksjonen ble holdt for RNA og protein utvinning. For RNA ekstraksjon ble RNeasy Mini Kit (Qiagen) benyttes følgende produsentens anbefalte protokoll. Ett mikrogram av total RNA ble brukt i en 20 pl cDNA-syntesereaksjon (Quantas Biosciences, Gaithersburg, MD). Reaksjonene ble utført i 1 pl av cDNA-reaksjonsblanding, 10 ul SYBR grønn /Taq-polymerase masterblanding (Roche, Indianapolis, IN), 4 ul av primere (YAP1, 5′-GCCATTAAAGGCAGCTGTTC-3 «og 5»-AGCACTGTGCCAGGTATCAC- 3 «, GAPDH, 5′-ATTGCCCTCAACGACCACTT-3′ og 5»-GGTCCACCACCCTGTTGC-3 «, ved en sluttkonsentrasjon 400 nM), og 5 pl vann til et sluttvolum på 20 ul. Bio-Rad MyIQ enkelt farge real-time PCR deteksjonssystem (Hercules, CA) ble brukt til å utføre RT-PCR. To-trinns forsterkning (95 ° C i 30 sekunder og 58 ° C i 30 sekunder) ble gjentatt for 40 sykluser. Etter PCR-reaksjonen, ble et smeltekurve analyse utført (60 ° C i 5 sekunder) for 35 sykluser. Dataene ble analysert ved hjelp av komparative C
T-metoden [25]. Analyse av hele cellelysatet proteinnivået ekspresjon av YAP1 ble som tidligere beskrevet, med det unntak at den siRNA-behandling var i 72 timer.
Resultatene
YAP1 er overuttrykt i bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer (PDA )
for å behandle uttrykket nivået av YAP1 protein i PDA vev, vi utførte farging bruke en vev microarray (TMA). Blant de 66 PDA tilfeller finnes i TMA, 64 ble evaluert for svulst farging, hvorav 33 hadde matchende normal epitel. Den YAP1 antistoffet viste både nukleær og cytoplasmatisk farge, som er konsistent med den kjente cellulære funksjonen til proteinet YAP1 – YAP1 er lokalisert i cytoplasma når den er inaktivert, og det blir translokert inn i kjernen når den er aktivert. Vi vurderte fargeintensitet for både kjernekraft og cytoplasma YAP1 og oppsummert resultatet i tabell 1. Omtrent 77% (49/64) av PDA tilfeller hadde positive (scoret 1+ eller høyere) atom YAP1 flekker i tumorceller, 63% ( 31/49) som hadde moderat (2+) eller sterk (3+) farging. I motsetning til dette, bare 48% (16/33) av tilfellene hadde positiv farging i den tilstøtende normal epitel, med bare 18% (6/33) hadde moderat eller sterk farging. På den annen side, fargeintensitetene i cytoplasma er sammenlignbare mellom tumoren og tilstøtende normale vev, hvor 56% (36/64) av de tilfellene hadde 2+ eller høyere farging i tumoren og 43% (14/33) hadde 2+ eller høyere flekker i tilstøtende normalt epitel. Analyse av tumor tilfeller med matchende tilstøtende normalt vev ved hjelp av Wilcoxon signed-rank test viste også signifikant høyere uttrykk i tumorceller sammenlignet med tilstøtende normale duktale celler med en p-verdi på 0,0002. Men enda viktigere, er forskjellen i YAP1 proteinnivå mellom svulst og tilstøtende normal epitel mye mer signifikant i kjernen (p-verdi = 0,0007) enn i cytoplasma (p-verdi = 0,027), noe som indikerer at YAP1 ikke bare er overuttrykt i PDA, men det er også sterkt aktivert.
Figur 1 viser eksempler på differensial YAP1 flekker i PDA, tilstøtende normalt vev, og normal bukspyttkjertelen. I noen normale bukspyttkjertel og pankreatitt vev observerte vi moderat til sterk YAP1 flekker i akinærceller og små kanaler (figur 1C). Likevel er den generelle uttrykk for YAP1 i svulsten betydelig høyere enn i de vanlige bukspyttkjertelen og pankreatitt tilfeller (p-verdi = 0,011).
A) Negativ til svak cytoplasma farging i normal ductal epitel (hvite piler) . B) Moderat flekker (for det meste cytoplasma) i normale kanaler i tilknytning til kreft (hvite piler). C) Moderat til sterk farging i en normal centroacinar og små duktale celler (hvite piler); D) Svak flekker i et duktalt adenokarsinom (svarte piler); E) Sterk farging i et godt differensiert ductal adenocarcinom (svarte piler); og F) sterk farging (for det meste atom) i et dårlig differensiert ductal adenokarsinom (svarte piler).
Neste, vi korrelert aktivert atom YAP1 uttrykk nivå med histopatologiske parametre hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Som vist i tabell 2, er det ingen sammenheng mellom kjerne YAP1 ekspresjon og tumor karakter eller restsykdom i regionale lymfeknuter, men det eksisterer en marginalt signifikant korrelasjon (r = 0,33 og p-verdi = 0,068 i Pearson korrelasjonskoeffisient analyse) mellom kjernekraft YAP1 nivå og tumorstadium.
Vi har også undersøke uttrykk nivået YAP1 i et panel av åtte menneskelig kreft i bukspyttkjertelen og to udødeliggjort normale menneskelige bukspyttkjertelen epiteliale cellelinjer ved hjelp av Western blotting (figur 2A). Seks bukspyttkjertelkreft cellelinjer (BxPC-3, CFPAC-en, HPAF-II, Hs 766T, MIA PACA-2, og Panc-1) viste høy til moderat protein nivåer av YAP1. To bukspyttkjertelkreft cellelinjer (ASPC-en og CAPAN-1) hadde usynlige for lave YAP1 protein nivåer, henholdsvis. De to udødeliggjort bukspyttkjertelen cellelinjer (HPDE6 og hTERT-HPNE) hadde lav til moderat YAP1 protein uttrykk. Dette uttrykket profilen til YAP1 i pankreas cellelinjer er konsistent med det som vi observerte i de pankreatiske tumor vevsprøver (tabell 1).
A) Western blotting-analyse av YAP1 protein ekspresjon i et panel på åtte kreft i bukspyttkjertelen og to udødeliggjort (ikke-transform) bukspyttkjertelen cellelinjer. B-E) Immunhistokjemisk farging for YAP1 i bukspyttkjertelkreft xenografter: B) ASPC-1; C) BxPC-3; D) MIA Paca-2; og E) PANC-en.
Videre undersøkelser av YAP1 uttrykk i xenografttumorer dannet av bukspyttkjertelkreft cellelinjer viste også lignende resultater. Figur 2 viser differensialfarging og lokalisering av YAP1 i xenografttumorer av fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer ved hjelp av immunhistokjemi. Den ASPC-1 tumor hadde svært lav farging av YAP1 og var begrenset til cytoplasma (figur 2B), som er i henhold til Western blotting resultater (figur 2A). BxPC-3 og MIA PACA-2, som hadde moderat til høy protein ekspresjon av YAP1 ved Western-blotting (figur 2A), viste moderat til sterk farging i cytoplasma og moderat (noen ganger sterk) farging i kjernene (2C og 2D, respektivt ). PANC-en hadde lignende YAP1 protein uttrykk med intens farging av cytoplasma med lav til moderat farging av atomkjerner (figur 2E).
Uttrykket og lokalisering av YAP1 er regulert av celletetthet
det har blitt rapportert at økt celletetthet, kan resultere i aktivering av flodhesten veien og deretter de sekvestrerende av YAP1 i cytoplasma [6]. Vi antok at kreft i bukspyttkjertelen celler slik regulering av YAP1 lokalisering av celletetthet er redusert. For å utforske denne hypotese, vurderte vi ekspresjonsnivået og lokalisering av YAP1 ved å variere celletettheter av subcellulære proteinfraksjonering og immunblotting.
Som vist i figur 3, ved lavere celletettheter (20-70%), det YAP1 -protein var til stede i både cytoplasma og kjernen i de to bukspyttkjertelcancercellelinjer, BxPC-3, og PANC-1, mens i udødelig normal pankreatisk duktus epitelcellelinje, HPDE6, YAP1 ikke var detekterbar i den cytosoliske fraksjonen. Når cellene ble 100% konfluent, den relative atom YAP1 proteinnivå (forholdet mellom atom YAP1 i forhold til totalt YAP1) økte i BxPC-3 og PANC-1, men ikke i HPDE6 (figur S1). Selv om cytosoliske YAP1 proteinnivå øker etter hvert som cellene blir sammenflytende i alle tre cellelinjer, er økningen i HPDE6 den mest betydningsfulle. Dette indikerer at relativt mer YAP1 være aktivert (ufosforylerte) i kreftcellelinjer enn i udødelig normal HPDE6 cellelinje når cellene blir sammenflytende. Nivået av fosfo-YAP1 (p-YAP1) protein, som kun påvises i hele cellelysatet og den cytosoliske fraksjonen i cellelinjene, bekrefter også forskjellene i YAP1 cellulær lokalisering mellom cancercellelinjer og HPDE6. p-YAP1 ble ikke påvist i den cytosoliske fraksjon av lav konfluente HPDE6 celler, og det var en dramatisk økning når cellene ble 100% sammenflytende. I kreftcellene, på den annen side, er p-YAP1 til stede ved lave celletettheter og øker etter hvert som cellene blir mer sammenflytende. Disse resultatene indikerer at YAP1 ekspresjon og lokalisering ikke er så strengt regulert av celletetthet i kreftceller som i de normale celler, noe som antyder at YAP1 funksjon kan være dysregulerte i kreft i bukspyttkjertelen celler.
som øker celletetthet, bukspyttkjertelen kreftcellelinjer, BxPC-3 og PANC-en, svar på deaktivering av YAP1 som en transkripsjon kofaktor ved cytosolic binding er mindre omfattende enn HPDE6. Celler ble hentet ved å øke celletettheter etter 48 timer med innledende seeding. PARP fungerer som lasting kontroll for atomfraksjonen. α-tubulin fungerer som lasting kontroll for hele cellelysatene og cytosoliske brøkdel.
siRNA knockdown av YAP1 reduserer celleproliferasjon, induserer apoptose, og avtar forankringsuavhengig vekst i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
for ytterligere å analysere rollen YAP1 i tumorigenesis, undersøkte vi effekten av YAP1 lyddemping av siRNA oligonukleotider på bukspyttkjertelen celleproliferasjon, apoptose, og forankringsuavhengig vekst. BxPC-3 og PANC-1 celler ble omvendt-transfektert med to siRNA oligonukleotider rettet mot ulike regioner av YAP1 mRNA sekvens. De AllStars negativ kontroll siRNA (Neg siRNA) og AllStars død Kontroll siRNA (Qiagen) ble anvendt som kontroller for å sammenligne siRNA transfeksjon virkning på celleformering og transfeksjonseffektivitet.
I løpet av et tidsforløp på 96 timer ble cellene behandlet med YAP1 siRNA hadde betydelig reduksjon i vekstrater i forhold til cellene Bare og negative siRNA (Neg siRNA) kontroll. I figur 4 er Neg siRNA hadde en minimal effekt på proliferasjonen av BxPC-3 og PANC-1 sammenlignet med ubehandlede celler bare kontroll. Men begge YAP1 siRNA sekvenser hadde betydelig undertrykt proliferasjon i begge BxPC-3 og PANC-1. Nitti-seks timer etter siRNA behandling, siRNA sekvens YAP1_1 hemmet veksten av BxPC-3 og PANC-1-celler ved 69% og 53%, henholdsvis (p 0,01) og siRNA-sekvensen YAP1_2 hemmet veksten med 34% og 33% henholdsvis (p 0,05). YAP1 siRNA sekvenser ikke redusere spredning i HPDE6 (figur S2A).
cellevekst kurver av A) BxPC-3 og B) PANC-en transfektert med YAP1 siRNA oligonukleotider. Den uavhengige to-prøve
t
test (to-halet) ble benyttet for å beregne statistisk signifikans ved 96-timers tidspunktet i forhold til Neg siRNA. * Betyr p 0,05, og ** betyr p 0,01. C) Den Caspase-Glo 3/7 Assay (Promega) ble anvendt for å bestemme nivået av apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler transfektert med YAP1 siRNA oligonukleotider etter 72 timer. ** Betegner en uavhengig to-utvalg
t
test (tosidige) p-verdi. 0,01 i forhold til den negative siRNA kontroll (Neg siRNA)
Å evaluere effekten av YAP1 inhibering på apoptose, målte vi aktiveringen av caspase-3 og kaspase-7 i kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med siRNA. Som vist på figur 4C, 72 timer etter transfeksjon, begge YAP1 siRNA sekvenser induserte kaspase 3/7 aktivitet med mer enn 2-ganger (p 0,05) sammenlignet med den negative siRNA kontroll i BxPC-3, mens en sekvens (YAP1_1) vesentlig indusert kaspase-aktivitet (p 0,05) i PANC-1. Men verken YAP1 siRNA sekvens indusert betydelig caspase 3/7 aktivitet i HPDE6 celler (Figur S2B). Dette funnet tyder på at knockdown av YAP1 uttrykk induserer caspase-avhengig apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Deretter effektene av YAP1 hemming på cellesyklus distribusjon ble undersøkt (tabell S1). Begge YAP1 siRNA-sekvenser forårsaket en betydelig økning i G0 /G1-cellepopulasjonen i både BxPC-3 og PANC-1, sammenlignet med den negative kontroll siRNA. I HPDE6, gjorde de to siRNA sekvenser ikke indusere konsistente effekter på cellesyklusfordeling i forhold til Neg siRNA kontroll (tabell S1).
Siden vi observert en betydelig effekt på celleproliferasjon, ønsket vi å vurdere om YAP1 knockdown av siRNA ville avskaffe forankringsuavhengig vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler. BxPC-3 og PANC-1-cellene ble behandlet med siRNA-sekvensene i 48 timer og høstet ved trypsinering. Samme antall levedyktige celler for hver behandling ble deretter sådd ut på bløt agar. Etter 21 dager ble kolonier tellet fra hver gruppe, og deretter normalisert til cellene bare kontroll og representert som en prosentandel av kolonier. Både YAP1_1 og YAP1_2 sirnas trykt clonogenicity i myk agar i BxPC-3 (95%, p 0,01) og i PANC-en (60%, p 0,05) (figur 5A). I motsetning til den tilsvarende inhiberende aktivitet i celle-proliferasjonsanalyse (figur 4A og 4B), er reduksjonen i kolonidannelse var mye større i BxPC-3-celler (~95%) enn det i PANC-1-celler (-60%). Denne forskjellen er i overensstemmelse med nivået av mRNA og protein YAP1 reduksjon av siRNA oligonukleotider i cellelinjer (figur 5B og 5C). Som vist i figur 5C, er den reduserte proteinekspresjon ved YAP1 sirnas mer dramatisk i BxPC-3-celler enn i PANC-1-celler.
A) Prosent av kolonier i forhold til cellene bare kontroll på bløt agar etter 21 dager med vekst fra første seeding. p-verdier ble beregnet ved å sammenligne YAP1 siRNA (YAP1_1 og YAP1_2) til Neg siRNA (uavhengig to halet
t
test, to-halet). B) qPCR analyse av YAP1 mRNA uttrykk etter 48 timer med siRNA transfeksjon. C) Western blotting-analyse av YAP1 uttrykk etter siRNA-behandling i 72 timer. Prøvene for hver cellelinje ble separert og analysert på samme blot * betyr p. 0,05, og ** betyr p. 0,01
Diskusjoner
Opprinnelig oppdaget i Drosophila som en potent vei for tumor suppresjon, flodhesten pathway regulerer negativt cellevekst gjennom en kaskade-kinase og resulterer i inaktivering av Yki (YAP1 i pattedyr) [6], [7], [9], [10]. Den veien og komponentene er høyt konservert hos pattedyr, og flere studier har vist pathway sin overbevisende rolle for regulering av cellevekst, spredning, overlevelse, og foreningen i maligniteter [26] – [33]. Som den kjernefysiske effektor av transkripsjon, har YAP1 blitt et attraktivt mål for etterforskning i pattedyr maligniteter. I vår studie har vi observert at YAP1 er overuttrykt i pankreastumorer og i kreftcellelinjer. Den nedregulering av YAP1 redusert celle levedyktighet, spredning, og forankringsuavhengig vekst i dyrkede celler.
subcellulære lokalisering av YAP1 i bukspyttkjertelen svulster og i de dyrkede cellelinjer fremhevet feilregulering av Hippo veien. Ved reaksjonsvei aktivering, er YAP1 inaktivert via fosforylering av LATS1 /2 og dermed fastholdt i cytoplasma [6], [7]. I våre studier immunofarging, er YAP1 farging generelt mer intens i cytoplasma enn i kjernen, og svulsten har en betydelig høyere andel av celler med positiv farging YAP1 i kjernen enn det tilstøtende normale (77% vs. 48%). Selv om en betydelig prosentandel av tilstøtende normale tilfeller farget positivt for YAP1, er det totale ekspresjonsnivået signifikant høyere i tumor (Tabell 1). Farging av YAP1 i normal pankreas vev er begrenset til akinærceller og små kanaler, som er forenlig med en tidligere studie [34] og sannsynligvis representerer den normale funksjon av YAP1 i å opprettholde homeostase vev.
Som en tidligere studie [6] og våre har observert, er YAP1 protein uttrykk modulert ved å øke tettheten. Ved lav tetthet, er YAP1 proteinekspresjon minimal, men som celletettheten øker YAP1 ekspresjonen øker tilsvarende. I figur 3, ble et langsommere migrerende bånd observert i de pankreatiske kreftcellelinjer immunoblottet for total YAP1 når celletettheten nådde 100% i hele cellelysatet og atomfraksjoner. Vi postulere at jo langsommere migrerende bånd observert i atomfraksjonen er ikke på grunn av fosforylering kjent for å regulere YAP1 lokalisering, men snarere en post-translasjonell modifikasjon ukjente på dette tidspunktet [35] – [38]. For fremtidige studier bør celletetthet noteres i forhold til YAP1 protein uttrykk. I bukspyttkjertelen cellelinjer, er YAP1 proteinekspresjon og lokalisering regulert av celletettheten, men en slik regulering syntes å være betydelig redusert i kreftceller sammenlignet med det i normale ductal epitelceller (figur 3). Interessant, selv om vi se høye nivåer av YAP1 farging i både kjernen og cytoplasmaet i PDA vev, måtte den nukleære YAP1 proteinnivået mer betydelig økning enn det cytoplasmatiske YAP1 i forhold til tilstøtende normale vev (tabell 1). Dette indikerer kanskje at i tillegg til den oppregulering av YAP1 proteinekspresjon, komponenter av flodhesten bane som regulerer YAP1 lokalisering (fosforylering) kan også være dysregulerte i bukspyttkjertelkreft. Faktisk har de LATS1 /2-kinaser oppstrøms av YAP1 blitt vist å bli nedregulert i flere krefttyper, inkludert mykvevssarkom [39], astrocytom [40], og brystkreft [41], [42]. Nå nylig, Zhou et al. rapporterte tap av aktiv MST1, en annen kinase oppstrøms YAP1, i menneskelige hepatocellulært karsinom (HCC) og er svulst undertrykkende i transgene musemodeller [43] – [45].
