Abstract
Silybin eller silibinin, en flavonolignan isolert fra melk tistel frø, er en av de populære kosttilskudd og har blitt grundig undersøkt for sin antioksidant, hepatoprotective og anti-kreft egenskaper. Vi har for seg at styrken av silybin kan bli ytterligere forbedret ved passende modifisering /s i sin kjemiske struktur. Følgelig her, har vi syntetisert og karakterisert en rekke av silybin-derivater, nemlig 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM), 7-O-galloylsilybin (7OG), 7,23 -disulphatesilybin (DSS), 7-
O
-palmitoylsilybin (7OP), og 23-
O
-palmitoylsilybin (23OP); og sammenlignet med deres anti-kreft effekt ved bruk av human blærekreft HTB9, tykktarmskreft HCT116 og prostata carcinoma PC3-celler. I alle de tre cellelinjene, DHS, 7OM og 7OG viste bedre veksthemmende virkninger, og i forhold til silybin, mens andre silybin derivater viste mindre eller ingen effekt. Deretter vi fremstilles de optiske isomerer (A og B) av silybin, DHS, 7OM og 7OG, og sammenlignet med deres anti-kreft effekt. Isomerene av disse tre silybin derivater viste også bedre effekt sammenlignet med de respektive silybin isomerer, men i hver, var det ingen entydige silybin A eller B isomer aktivitet preferanse. Videre studier i HTB cellene fant at DHS, 7OM og 7OG utøve bedre apoptotisk aktivitet enn silibinin. Klonogene analyser i HTB9 celler ytterligere bekreftet at både de racemiske blandinger, så vel som rene optiske isomerer av DHS, 7OM og 7OG var mer effektiv enn silybin. Samlet disse resultatene tyder klart på at anti-kreft effekt av silybin kan bli betydelig forbedret gjennom strukturelle modifikasjoner, og identifisere sterk anti-kreft effekt av silybin-derivater, nemlig DHS, 7OM, og 7OG, som viser at deres effekt og toksisitet, bør vurderes i relevante prekliniske kreft modeller i gnagere
Citation. Agarwal C, Wadhwa R, Deep G, Biedermann D, Gažák R, Kren V, et al. (2013) Anti-Cancer Effekt av silybin Derivater – En struktur-aktivitetsforhold. PLoS ONE 8 (3): e60074. doi: 10,1371 /journal.pone.0060074
Redaktør: Stephen J. Polyak, University of Washington, USA
mottatt: 10 desember 2012; Godkjent: 21 februar 2013; Publisert: 28 mars 2013
Copyright: © 2013 Agarwal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI RO1 gir CA102514 og CA112304, AMVIS CZ-amerikansk samarbeidsprosjekt ME10027 fra Kunnskapsdepartementet av Tsjekkia (VK og RA), og RVO61388971 (Institutional Concept ved institutt for mikrobiologi, Praha). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Silybin eller silibinin (C
25H
22O
10, CAS-nr 22888-70-6, Figur 1a) er et populært kosttilskudd isolert fra frøene av
Silybum marianum product: (L.) Gaertn (Familie Asteraceae), kjent som melk tistel. Milk thistle ekstrakt betegnet som silymarin har en lang historie med bruk i folkemedisinen, og er nå ofte ansatt for forebygging og /eller behandling av leversykdommer, inkludert viral hepatitt, levercirrhose forbundet med alkoholmisbruk, leverskader fra narkotika og amp; industrielle toksiner [1] – [3]. Silybin er også ansett som en effektiv motgift mot forgiftning med døden cap sopp (
grønn fluesopp
) [2], [4]. Videre silybin oppviser også sterk antioksidantaktivitet gjennom scavenging hydroksylradikaler og hemme lipidperoksydasjon ved å virke som en kjedebrytende antioksydant [5], [6]. I de siste to tiår, i tillegg til hepatoprotektiv og antioksidant virkning, og silybin vist bemerkelsesverdige anti-kreft, så vel som kreft Kjemopreventivt effekt i pre-kliniske cellekultur og dyremodeller med flere epiteliale kreftformer, inkludert hud, blære, tykktarm, prostata, lunge etc. [7], [8]. Basert på disse lovende resultatene fra pre-kliniske studier har silybin også blitt testet i humane kreftpasienter i fase I-II pilot kliniske studier, hvor det ble rapportert å være godt tolerert og viste plasma og target-vev biotilgjengelighet [7], [ ,,,0],9] – [11]. Flere tradisjonelle toksikologiske tester har bevist giftfri natur silybin, og det er rapportert å være trygt for konsum [10], [12]. Basert på dets vist seg, så vel som vekst forebyggende og terapeutisk virkning mot kreft, ville det være av stor betydning og overføringsverdi hvis effekten av silybin kan bli ytterligere forbedret gjennom passende kjemisk modifisering /s i sin struktur, idet det er innlysende at silybin har en effektiv «lead struktur».
(a-h) Kjemiske strukturer av silybin, silybin A, silybin B, 2,3-dehydrosilybin, 7-
O
-methylsilybin, 7-
O
-galloylsilybin, 7,23-disulfat silybin, 7-
O
-palmitoylsilybin, og 23-
O
-palmitoylsilybin.
i de senere år har det vært en større vekt på å forstå den detaljerte kjemiske struktur av silybin, identifisere og syntetisere dens stereoisomerer, så vel som vurdering av deres biologiske effekt [13] – [17]. Silybin er nå bekreftet å være en 01:01 blanding av to optiske isomerer, nemlig silybin A og silybin B (figur 1b og 1c). Videre er den detaljerte rollen til respektive hydroksylgrupper og -deler av silybin er nå godt karakterisert, og at kunnskap har tillatt identifikasjon av egnede steder for utforming og syntese av nye silybin-derivater uten å påvirke den biologiske aktivitet av de resulterende konjugatene [18] , [19]. Disse studier har identifisert at de mest egnede posisjoner for silybin modifikasjoner er 7-OH og /eller 23-OH [18], [19]; og basert på disse observasjonene kritiske flere derivater av silybin har blitt designet, syntetisert og karakterisert [20] – [23]. For eksempel har vi syntetisert og karakterisert 7
-O
– og 23
-O
acyl-derivater av silibinin med varierende acylkjedelengder, og har bekreftet sitt antioksidant og anti-virus-aktiviteter [20]. Tilsvarende har en rekke Silybin galloyl estere også blitt syntetisert, og 7
-O
-galloylsilybin ble identifisert som den mest effektive forbindelse i form av anti-angiogen effekt [21]. Vi har også rapportert at den anti-angiogene effekt av B-isomeren av 7
-O
-galloylsilybin er betydelig høyere enn den a-isomeren [21]. Likeledes, silybin oksidasjonsprodukt, 2,3-dehydrosilybin, er også blitt syntetisert som viste bedre antioksidant potensial enn silybin; karboksylsyrederivatet av 2,3-dehydrosilybin, nemlig 2,3-dehydrosilybinic syre, har vist bedre anti-lipid-peroksydasjonsreaksjoner og anti radikal-fjernende aktivitet og viser bedre vannløselighet [22], [24]. Vi har også utarbeidet en stor serie med
O
alkyl derivater (metyl og benzyl) av silybin og 2,3-dehydrosilybin, og har identifisert noen nye derivater med sterk effekt mot P-glykoprotein-mediert legemiddelutstrømningen aktivitet [23]. Til sammen de ovennevnte studiene klart antydet at den biologiske effekten av silybin kunne bli betydelig forbedret gjennom egnede kjemiske modifikasjoner.
Med den oppfatning at flere av Silybin derivater har vist bedre aktivitet som utgangsmolekylet i ulike biologiske systemer, og at silybin selv utviser sterk anti-kreft-effekt i den foreliggende undersøkelsen, sammenlignet vi anti-kreft effekt av flere silybin-derivater (både eksisterende så vel som nylig utformet) i tre forskjellige humane kreftcellelinjer, og identifisert tre silybin-derivater med anti- kreft aktivitet bedre enn silybin.
Materialer og metoder
Cell Culture, behandling og reagenser
Menneskelige blærekreft HTB9 celler, tykktarmskreft HCT116-celler og prostata karsinom PC3 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HTB9 og PC3-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin sulfat ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. HCT116-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin sulfat ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Alle cellekulturmateriale var fra Invitrogen Corporation (Gaithersburg, MD). Celler ble sådd ut og behandlet ved 40-50% konfluens med forskjellige doser av silybin eller dets derivater (5-60 um i medium) oppløst opprinnelig i DMSO for de ønskede tidsperioder i henhold til serum tilstand. En like stor mengde av DMSO (kjøretøy) var til stede i hver behandling, herunder kontroll; DMSO-konsentrasjonen ikke overstige 0,1% (v /v) i en hvilken som helst behandling. Ved slutten av ønskede behandlinger, ble forskjellige analyser utført som beskrevet senere. Primært antistoff for cPARP og anti-kanin-peroksidase konjugert sekundært antistoff ble anskaffet fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoff for tubulin var fra Neomarkers (Fremont, California). Hoechst 33342, krystallfiolett og propidiumjodid (PI) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL deteksjonssystem og anti-mus konjugert sekundært antistoff var fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Alle andre reagenser ble oppnådd i sin kommersielt tilgjengelige høyeste renhetsgrad.
Kjemi
Silymarin som et grunnlagsmateriale for alle påfølgende produkter er innhentet fra Liaoning Senrong Pharm. Co, LTD (Panjin Liaoning-provinsen i Kina). Optisk rene silybin A og silybin B ble oppnådd som tidligere beskrevet [25], [26]; spesielt, en ny preparativ separasjonsmetode som er utviklet av oss nylig [25], [26], som er basert på lipase-katalysert enzymatisk diskriminering av begge silybin stereoisomerer, muliggjorde fremstilling av alle derivater som er nevnt i dette arbeidet i optisk ren form ved det store skala. Metodene for syntesen, de syntetiske skjemaer og de analytiske data bekrefter strukturen av de tidligere syntetisert og rapportert silybin-derivater (som ble evaluert for sin anti-kreft-aktivitet i foreliggende studie) er oppsummert i Methods S1 og fig S1, S2, S3, S4, S5, og tabell S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, respektivt. I korte trekk ble 2,3-dehydrosilybin (DHS) A og B fremstilles ved en base-katalysert oksydasjon av respektive silybin A og B som beskrevet nylig [22], [24]; 7-
O
-Methylsilybin (7OM) A og B ble fremstilt ved basekatalysert metylering av respektive silybin A og B [23]; og 7-
O
-palmitoylsilybin (7OP), 23-
O
-palmitoylsilybin (23OP) og 7-
O
-galloylsilybin (7OG) fra både silybin A og B ble syntetisert som beskrevet tidligere av oss [20] -. [23]
Utarbeidelse av 7,23-disulfat silybin [silybin-7,23-diyl
bis plakater (hydrogensulfat), DSS], og karakterisering av Mass og NMR Spectra
til en omrørt løsning av silybin [silybin A, silybin B eller naturlig silybin A B (01:01), 200 mg, 0,43 mmol] i DMF (2 ml), Py⋅SO
3 (200 mg, 1,26 mmol) ble tilsatt. Reaksjonen ble stoppet etter 1 time med omrøring ved 40 ° C ved tilsetning av EtOH (0,5 ml). Etter en kort omrøring ble reaksjonsblandingen applisert på en kolonne av silikagel og kromatografert med løsningsmidlet EtOH /MeOH /CH
2 Cl
2 /vann (2/1/9 /0,3) for å gi en lys gul olje, som ble frysetørket for å oppnå tittelforbindelsen enten som ren diastereomer A eller B eller blandingen A og B (cca 160 mg, 60%) som et blekgult, lyofilisat
massespektra av den syntetiserte. forbindelse ble målt på en matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering reflectron time-of-flight MALDI-TOF massespektrometer Ultraflex (Bruker-Daltonics, Bremen, DE). Positive spektra ble kalibrert eksternt med monoisotopic [M + H] + ion av menneskelig angiotensin I 1296,69
m /z
, MRFA peptid 524,26
m /z Hotell og CCA matrise topp 379,09
m /z
. En 10 mg /ml oppløsning av α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre eller 2,5- dihydrobenzoic syre i 50% MeCN /0,3% eddiksyre ble brukt som en MALDI matrise. En 1 pl av prøve oppløst i vann ble tillatt å tørke ved omgivelsestemperatur og over lagt med et 0,3 mL av matriseoppløsningen på målet. De MALDI-TOF positive eller negative spektra ble oppsamlet i reflectron modus. MS (MALDI-TOF):
m /z product: (%) = 643 (17, M
+ + H.), 561 (32), 547 (36), 545 (100), 481 (25), 465 (69).
NMR spektra ble målt på Bruker Avance III 400 (observasjon frekvens 400,13 MHz for
1 H, 100,62 MHz for
13C) i DMSO
d
6 product: (Sigma Aldrich) ved 30 ° C. Residual løsemiddel signal ble brukt som intern standard ((δ
H 2,500, δ
C 39,60). Kjemiske skift og interaksjons konstanter ble registrert fra spektra som vektfunksjoner (eksponentiell med negativ eksponent og Gauss-funksjon) ble brukt. kjemiske skift er uttrykt i δ-skala (ppm) og interaksjons konstanter i Hz. Digital oppløsning gir mulighet for å uttrykke kjemiske skift av protoner med tre og karboner med to desimaler, henholdsvis, og proton-proton interaksjons konstanter med én desimal. mangfaldet av karbon signaler ble bestemt fra proton redigert HSQC spektra Signal oppdrag er basert på 2D NMR eksperimenter -. COSY, HSQC, HMBC, som ble utført ved bruk av standard programmer (bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, DE)
1 H og
. 13C NMR spektra av både optisk rent silybinA-7,23-diyl
bis plakater (hydrogensulfat) og silybinB-7,23-diyl
bis plakater (hydrogensulfat), som ikke har blitt rapportert så langt, er beskrevet i tabellene 1 og 2, respektivt.
Cell Growth Assays
i hvert tilfelle ble cellene belagt til omtrent 40-50% konfluens og behandles med silybin eller dets derivater eller rene isomerer av hver forbindelse i henhold til serum tilstand som beskrevet ovenfor. Etter 24 og 48 timer for behandlinger, ble celler oppsamlet ved kort trypsinering og vasket med PBS. Totalt celletall ble bestemt ved å telle hver prøve i duplikat ved å bruke et hemocytometer i henhold til et invertert mikroskop. Hver behandling og tidspunkt hadde tre uavhengige plater.
Apoptose-analysen
Quantitative apoptotisk celledød av silybin og dets derivater i HTB9-celler ble målt ved hjelp av Hoechst assay som tidligere beskrevet [27]. I korthet, etter ønskede behandlinger, ble cellene oppsamlet og deretter farget med DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 og PI. Apoptotiske celler ble kvantifisert ved hjelp av fluorescerende mikroskop (Axioskope 2 pluss-HBO 100, Zeiss, Jena, DE) ved å telle celler /mikroskopisk felt (400 ×) i seks felt for hver prøve (i tre eksemplarer). Apoptotiske celler viste lyse blå (tidlig apoptotisk) eller orange-rød fluorescens (sent apoptotiske), som var preget av nekrotiske celler som viser rød fluorescens (PI-farget).
Western blotting
For Western blotting, lysater (80 mikrogram) ble denaturert i 2X SDS-PAGE-prøvebuffer og ble løst på 8% Tris-glysingeler. De separerte proteiner ble overført til nitrocellulosemembran etterfulgt av blokkering med 5% ikke-fett tørrmelk (w /v) i Tris-bufret saltvann (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) for 1 time ved romtemperatur. Etter blokkering ble membranene probet med primært antistoff i 2 timer ved romtemperatur og deretter over natten ved 4 ° C etterfulgt av passende peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur og visualisert ved ECL-deteksjonssystemet. I hvert tilfelle, ble blottene utsatt for flere eksponeringer på filmen for å være sikker på at bandet tettheten er i det lineære området. For alle resultater, ble autoradiogram /band skannet med Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, California). For å sikre lik protein lasting ble hver membran strippet og re-analysert med α-tubulin antistoff.
klonogene analysen
HTB9 celler ble sådd ut i 6-brønners plater og lov til å feste til platene i 24 timer. Deretter, avhengig av behandlingsprotokollen ble celler behandlet med hver forbindelse hver 72 timer, eller bare behandlet i 2 timer hver 24 timer. Ved slutten av angitte perioden ble cellene vasket to ganger med iskald PBS, fiksert med en blanding av metanol og iseddik (03:01) i 10 minutter og deretter farget med 1% krystallfiolett i metanol i 15 minutter, etterfulgt av vasking med avionisert vann. Kolonier med mer enn 50 celler ble talt opp.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp SigmaStat 2,03 programvare (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Data ble analysert ved hjelp av en vei ANOVA etterfulgt av Tukey t-test, og en statistisk signifikant forskjell ble ansett på
p
≤0.05.
Resultater
Effekt av Silybin og dens derivater på kreft celle vekst
Først sammenlignet vi veksthemmende virkning av silybin og dets derivater (kjemiske strukturer vist i figur 1) DHS, 7OM, 7OG, DSS, 7OP og 23OP i humane kreftcellelinjer fra blæren , tykktarm og prostata opprinnelse, nemlig HTB9 henholdsvis HCT116 og PC3; spesielt, har silibinin vist sterk anti-kreft effekt i pre-kreft modeller av blære, tykktarm og prostata kreft [7], [8]. Som vist i tabell 3, i HTB9 celler ved 30 og 60 uM doseringer, DHS, 7OM og 7OG var mer effektive enn silybin etter 24 og 48 timer med behandling i form hemming av cellevekst; men på ekvimolare konsentrasjoner er veksthemmende effekten av andre derivater, nemlig DSS, 7OP, og 23OP, var inkonsekvent og enten lik eller lavere enn silybin. Tilsvarende i HCT116-celler, DHS, 7OM og 7OG var mer effektive ved inhibering av celleveksten i forhold til silybin og andre silybin-derivater (tabell 3). I PC3-celler, silybin-derivat (30 og 60 uM doser), viste tilsvarende eller bedre veksthemming enn silybin etter 24 timer med behandling (tabell 3). Igjen, DHS, 7OM og 7OG var mye mer effektive enn silybin eller andre derivater etter 24 og 48 timer av behandlinger i form av hemming av cellevekst; men effekten av andre Silybin derivater (DSS, 7OP, og 23OP) ble i stor grad tapt på 48 h tidspoeng (tabell 3). Sammen utgjør disse resultatene viste tydelig at bare DHS, 7OM og 7OG derivater av silybin har mye sterkere anti-kreft effekt enn ordnede strukturen, og derfor bare disse tre derivater ble brukt i senere studier.
Effect av silybin og dets derivater på apoptoseinduksjon i HTB9 celler
ved, sammenlignet vi effekten av silybin og de tre mest aktive derivater (DHS, 7OM og 7OG) ved 30 uM dose på induksjonen av apoptotisk celledød i HTB9 celler. Som vist i figur 2A-bunnfeltet, etter 24 timers behandling, silybin og dets derivater betydelig økt apoptotisk celledød i HTB9 celle, og 7OG var mest potent til å indusere apoptose. Men Western blot analyser for apoptose markør cPARP viste en kraftig økning med bare 7OG (figur 2A-øvre panel). Jo bedre effekt av Silybin derivater var mer tydelig etter 48 timers behandling der DHS, 7OM og 7OG betydelig økt apoptotiske cellen befolkningen (figur 2B-bunn panel) samt økt nivå av cPARP i HTB9 celler (figur 2B-øvre panel). Disse resultatene bekreftet videre den sterke og bedre anti-kreft effekt av DHS, 7OM og 7OG forhold til silybin mot HTB9 celler.
(A-B) HTB9-celler ble behandlet med 30 uM dose av silybin (SB), 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM), og 7
O
-galloylsilybin (7OG). Etter 24 eller 48 timer av hver behandling ble cellene samlet og apoptotiske populasjonen ble bestemt ved Hoechst-analyse som beskrevet i «Materialer og metoder». I søylediagrammene, er hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av 3 prøver. (A-B, western blot insert) Celler ble også samlet opp følgende silybin eller dets derivater behandling og analysert for cPARP proteinnivå ved Western blotting. I hvert tilfelle, ble membranene også strippet og re-probet med α-tubulin-antistoff for å kontrollere lasting protein. * P≤0.001.
Effekt av Pure optiske isomerer av Silybin og dets derivater på kreft celle vekst
Som nevnt ovenfor at silybin er en blanding (01:01 ratio) av optisk isomerer silybin A og silybin B, vi neste fremstilles store mengder av disse to silybin isomerer og anvendt dem for å syntetisere store mengder av deres derivater DHS (A og B), 7OM (A og B) og 7OG (A og B) som oppsummert i metodene ovenfor. Disse rene optiske isomerer av silybin og deres derivater ble deretter bedømt for sine kreftcellevekst inhiberende virkninger. I alle de tre cancercellelinjer, nemlig HTB9, HCT116 og PC3, rene isomerer (30 og 60 uM doser) av DHS, 7OM og 7OG var mer effektivt i forhold til respektive isomer av silybin etter 24 og 48 timer etter behandlingene (tabell 4) . Når vi sammenlignet celleveksthemmende virkninger av isomer A i forhold til isomer B og deres respektive derivater, kunne ingen entydige observasjon gjøres imidlertid silybin B isomer og dets derivater virket mer effektivt enn isomer A og dets derivater (tabell 4).
Deretter sammenlignet vi veksthemmende effekten av lavere doser (5 og 10 mm) av optiske isomerer av silybin (silybin A og silybin B) så vel som dens derivater DHS (A og B), 7OM (A og B) og 7OG (A og B) i HTB9 celler. Som vist i figur 3, ved 5 uM dose, forskjellen mellom silybin og dets derivater var mindre påfallende. Imidlertid, ved 10 uM konsentrasjon, forskjellen i effektiviteten av silybin isomerer med deres derivater isomerer var klart synlig med sterkere vekst-hemming derivater sammenlignet med moderstrukturer, nærmere bestemt etter 48 timer med behandling (figur 3). Sammen viser disse resultater antydet at i likhet med en bedre aktivitet av racemiske silybin isomerer nemlig DHS, 7OM og 7OG sammenlignet med moder racemisk silybin, den deriverte av ren silybin isomerer A og B er også mer effektiv i forhold til deres respektive ren silybin A- og B-isomerer .
HTB9 celler ble behandlet med 5 og 10 mikrometer doser av silybin A, 2,3-dehydrosilybin A, 7-
O
-methylsilybin A, 7-
O
-galloylsilybin A eller silybin B, 2,3-dehydrosilybin B, 7-
O
-methylsilybin B, 7-
O
-galloylsilybin B. Etter 24 eller 48 timer for hver behandling, total celle nummer ble bestemt som beskrevet i «Materialer og metoder». I søylediagrammene, er hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av 3 prøver. * P≤0.001; # P≤0.01; $ P≤0.05.
Effekt av racemiske blandinger og rene optiske isomerer av Silybin og dets derivater på Colony Forming i HTB9 Cells
Deretter sammenlignet vi effekten av racemiske blandinger og rene isomerer av silybin og sine tre mest effektive DHS, 7OM og 7OG derivater på koloni formasjon ved HTB9 celler. I det første eksperimentet, vi anvendt en dose på 20 uM av alle de forbindelser og vi har observert en fullstendig inhibering av kolonidannelse ved silybin, så vel som dets derivater (data ikke vist). Derfor, ved siden vi brukte lavere doser av racemiske blandinger, så vel som rene isomerer av silybin og dets derivater. Som vist i figur 4A, DHS, 7OM, og 7OG (5 og 10 uM doser hver 72 h) inhiberte kolonidannelse ved HTB9 celler, og alle tre derivater var mer effektiv enn silybin ved begge dosene. Tilsvarende behandling (5 og 10 uM doser) med rene isomerer (A og B) av DHS, 7OM, og 7OG også sterkt inhibert av kolonidannelse ved HTB9 celler; isomerer av alle tre derivatene var entydig mer effektiv i forhold til de respektive isomerer silybin A og silybin B (figur 4A). Blant alle de rene isomerer i denne analyse, 7OG-B viste den høyeste effekt (figur 4A).
(A) HTB9 celler (~1000 celler) ble sådd ut i 6-brønners plater og behandlet hver 72 timer med 5 og 10 mikrometer doser av silybin (SB), 2,3-dehydrosilybin (DHS), 7-
O
-methylsilybin (7OM), 7-
O
-galloylsilybin (7OG), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybin A (DHS-A), 7-
O
-methylsilybin A (7OM-A), 7-
O
-galloylsilybin A ( 7OG-A) eller silybin B (SB-B), 2,3-dehydrosilybin B (DHS-B), 7-
O
-methylsilybin B (7OM-B), 7-
O
-galloylsilybin B (7OG-B). På 11
th dag ble cellene behandlet og kolonier med mer enn 50 celler ble talt opp. (B) HTB9 celler (~1000 celler) ble sådd ut i 6-brønners plater og behandlet i 2 timer hver 24 timer med 20 uM dose av silybin (SB), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybin A (DHS -A), 7-
O
-methylsilybin A (7OM-A), 7-
O
-galloylsilybin A (7OG-A) eller silybin B (SB-B), 2, 3-dehydrosilybin B (DHS-B), 7-
O
-methylsilybin B (7OM-B), 7-
O
-galloylsilybin B (7OG-B). Etter 7 dager ble cellene behandlet og kolonier med mer enn 50 celler ble tellet. I søylediagrammene, er hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av 3 prøver. *, P≤0.001; #, P≤0.01; $, P≤0.05.
I en annen behandlingsregime, HTB9 celler ble eksponert for 20 uM dose av silybin eller isomerer av silybin og dets derivater (DHS, 7OM, og 7OG) i 2 timer, og deretter, friskt medium ble tilsatt uten forbindelsene, og samme behandlingsprotokoll ble fulgt med hver 24 timer. Disse forsøksbetingelser var basert på vår observasjon utført klinisk forsøk hvor vi har rapportert silybin halveringstid og konsentrasjon i plasma hos kreftpasienter i samme størrelsesorden dvs. 20 uM silybin i ca. 2 timer [28] Som vist i figur 4B, i henhold disse behandlingsforhold, effekt av alle forbindelsene ble kompromittert til en viss grad, men likevel 7OG og DHS beholdt høyere hemmende effekt mot HTB9 kolonidannelse. Denne analysen bekreftet at 7OG er den mest effektive blant alle Silybin derivater fulgt av DHS og 7OM.
Diskusjoner
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødelighet og sykelighet rundt om i verden. I USA alene, ble totalt 1,638,910 nye krefttilfeller og 577,190 dødsfall fra kreft anslått å skje i 2012 [29]. Med økende bruk av bilde verktøy og biomarkører, er mange kreftformer diagnostisert på et tidlig stadium hvor behandlingsalternativer er ganske begrenset på grunn av iboende bivirkninger forbundet med disse behandlingene. Hos slike pasienter, kreft chemoprevention og /eller intervensjon gjennom ikke-giftige stoffer som silybin kan være et attraktivt alternativ kombinert med vaktsom-venter. Videre er kreftkjemoterapi ofte begrenset av medfølgende akutt toksisitet spesielt hepatotoksisitet, noe som resulterer i reduksjon av dosen eller forsinkelser i terapi, og potensielt øke risikoen for tilbakefall [8]. Silybin har en lang historie med bruk for sine hepatoprotektiv fordeler, og derfor den kan brukes sammen med kjemoterapi som en hepatoprotectant [8]. I tillegg til å senke toksisitet, kan silybin forbedre effekten av kreftcellegifter [30]. I denne forbindelse har vi rapportert at silybin sterkt synergizes humane prostata-carcinomceller til doxorubicin-, cisplatin-, carboplatin- og mitoksantron-indusert veksthemming og apoptotisk død [31] – [33]. Lignende synergistiske effekter av silybin med doksorubicin og cisplatin er også rapportert i forskjellige andre kreftcellelinjer [34] – [37]. Andre vanlige elementer som bidrar vesentlig til kreftutvikling er kronisk betennelse og oksidativt stress [38]. Derfor er frukt og grønnsaker som er rike på antioksidanter, samt antiinflammatoriske midler anbefales for kreft chemoprevention strategier [38]. Silybin har vist anti-inflammatorisk og antioksidantegenskaper [38], noe som gir en ekstra begrunnelse for sin søknad i kreft forebygging og intervensjon.
En av de viktigste begrensninger, som har hindret silybin terapeutiske nytten i det siste, er dens biotilgjengelighet, noe som i stor grad på grunn av sin store multi-ringstruktur og vannoppløselighet lav [22]. Flere Silybin formuleringer (phosphatidylcholine, nano-suspensjoner, etc.) er testet for å ytterligere forbedre biotilgjengeligheten og disse formuleringene har vist betydelig bedring i silybin sin biotilgjengelighet [12]. For eksempel ble silybin resepter med phosphatidylcholine (kjent som «Silipide «, handelsnavn» Siliphos») testet i prostatakreft og tykktarmskreftpasienter og viste høy plasma biotilgjengelighet [9] – [11]. En annen tilnærming til å bedre silybin sin biotilgjengelighet samt biologisk effekt er gjennom egnet kjemisk modifikasjon /s i sin struktur; særlig er silybin struktur, så vel som betydningen av dens funksjonelle grupper godt karakterisert i de senere studier [13], [18], [19]. I den forbindelse har vi allerede har syntetisert og karakterisert en rekke av silybin-derivater, identifisert flere av dem med overlegen antioksidant og anti-angiogene aktiviteter og fant dem vannoppløselige, sammenlignet med silybin [20] – [23]. Basert på disse viktige funn og på tilsvarende vis, her vi syntetisert og karakterisert en annen silybin-derivat, nemlig 7,23-disulfat silybin (DSS), som er en potensiell silybin metabolitt i fase II biotransformasjon, og sammenlignet silibinin anti-kreft-aktivitet med DSS samt flere tidligere syntetiserte silybin derivater som DHS, 7OM, 7OG, 7OP, og 23OP. De viktigste resultatene av disse effektstudier er: a) 7OG, DHS, 7OM konsekvent viste anti-kreft effekt bedre enn silybin, mens Silybin derivater DSS, 7OP og 23OP viste mindre eller inkonsekvent effekt; støtter en overordnet struktur-aktivitetsforhold; b) de rene optiske isomerer av 7OG, DHS, og 7OM også utøves bedre anti-kreft-effekt i forhold til de respektive silybin isomerer (A og B); c) var det ingen entydige preferanse mellom A- og B-isomerer når det gjelder effekt av silybin eller dets derivater; og d) den samlede effekt av disse silybin derivatene var avhengig av både typen av funksjonelle grupper til stede så vel som deres romlige lokalisering.
I sammendrag viser resultatene fra den foreliggende studie viste at anti-kreft effekt av silybin kan bli betydelig forbedret gjennom passende modifiseringer i dens kjemiske struktur, og identifisert 7OG, DHS, og 7OM som mer effektive silybin-derivater. Dette funnet er i tråd med tidligere observasjoner som viser at substitusjons på C-7 av silybin struktur sterkt forbedrer sin antioxidant og /eller antiradical aktivitet. Videre, siden våre resultater med tre bly Silybin derivater var konsekvent i tre helt forskjellige humane kreftcellelinjer, foreslår vi at den observerte anti-kreft aktivitet i ikke cellelinje bestemt.
