Abstract
Multi-celleklumper er anriket i ascites av ovarialcancer (OvCa) pasienter. De representerer en invasiv og kjemoresistent cellular befolkningen grunnleggende for metastatisk spredning. De molekylære mekanismene utløsende enkelt celle invasiv utgang fra kulene forblir gåtefull. mDia formins er Rho GTPase effektorer som er viktige regulatorer av F-aktin cytoskeletal dynamikk. Vi antok at mDia2-drevet F-aktin dynamikk fremme encellede invasive overganger i klinisk relevante tredimensjonale (3D) OvCa kuler. Den aktuelle studien er en disseksjon av bidraget av F-aktin montering faktor mDia2 formin i invasive overganger og ved hjelp av en klinisk relevant eggstokkreft spheroid modell. Vi viser at RhoA styrt mDia2 aktivitet er nødvendig for stramt spheroid organisasjon, og berikelse av mDia2 i invasive cellulære fremspring av kollagen-embedded OVCA429 kuler. Tappe mDia2 i ES-2 kuler forbedret invasiv formidling av enkelt amoeboid formede celler. Dette står i kontrast med kuler som ble behandlet med kontroll siRNA, hvor en mesenchymale invasjon program dominerte. Hemming av en annen RhoA effektor, ROCK, hadde ingen innvirkning på ES-2 spheroid formasjon, men dramatisk hemmet spheroid invasjon gjennom induksjon av en svært langstrakt morfologi. Samtidig hemming av ROCK og mDia2 blokkert enkelt celle invasjon fra ES-2 kuler mer effektivt enn hemming av enten protein alene, noe som indikerer at invasiv utslipp av amoeboid celler fra mDia2-utarmet kuler er ROCK avhengig. Våre funn tyder på at flere GTPase effektorer må dempes for å fullstendig blokkere invasiv utgang fra eggstokkreft kuler. Videre tett regulert samspill mellom ROCK og mDia2 signalveier dikterer invasive kapasitet og type invasjonen programmet benyttes av bevegelige sfæroide-avledet ovarian kreft celler. Som tap av genet som koder mDia2,
DRF3, etter har blitt knyttet til kreft progresjon og metastase, våre resultater sette scenen for å forstå molekylære mekanismene som er involvert i mDia2 avhengig utslipp av invasive celler fra primær epiteltumorer.
Citation: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) En mDia2 /ROCK Melde Axis Regulerer Invasive Egress fra ovarialcancer Spheroids. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10,1371 /journal.pone.0090371
Redaktør: Pontus Aspenstrom, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 22 oktober 2013; Godkjent: 03.02.2014; Publisert: 28 februar 2014
Copyright: © 2014 Pettee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av University of Toledo Foundation (KME, ALNK), det amerikanske forsvarsdepartementet Eggstokkreft Concept Award (KME, OC073269), den DeArce Memorial Endowment Fund i støtte for medisinsk forskning og utvikling (KME), og National Cancer Institute ( KME, ALNK R01CA151632). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OvCa) er 5
th ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i amerikanske kvinner. The American Cancer Society anslår 22.000 nye diagnoser og 15.000 dødsfall fra ovarialcancer (EOC) i 2012. celler avledet fra eggstokkene overflaten epitel konto for 90% av primær OvCa og metastatiske lesjoner [1]. Ekspandert OvCa celler blir detektert i peritoneale ascites som enkle celler, små aggregater eller høyt organisert og sammenpressede flercellede sfæroider [1] – [5]. Komprimerte kuler er dårlig forstått invasive og kjemoresistent strukturer. Celle-celle-adhesjon, som støttes delvis av N- og E-cadherin drive dannelse og komprimering av OvCa sfæroider [6]. Det er uklart hvilke konkrete molekylære eller miljømessige signaler bidrar til invasiv overganger i kulene.
En økende mengde bevis tyder på at kompakte kuler fremme OvCa metastaser i bukhulen.
In vitro; Eksporter celler i OvCa kuler gjennomgå forankringsuavhengig vekst, disaggregert på å følge tredimensjonale (3D) kollagen-I gels og invadere underliggende mesothelial celler [7] – [9]. Viktigere, sfæroide formasjon og komprimering korrelerer direkte med invasjon [3], [4]. Menneske OvCa celler med evne til å danne kompakte kuler
in vitro
kan generere solide svulster når injisert intraperitonealt i immunsvikt mus. I motsetning til dette, ikke-sfæroide dannende celler mislykkes i å danne svulster i mus [10]. Den tilsynelatende sammenheng mellom dannelsen av kompakte kuler og formidling av invasive OvCa celler understreker behovet for bedre forståelse av molekylære mekanismer som støtter disse prosessene [11].
Som svar på ekstracellulære signaler, kan epitelceller-avledet kreftceller konvertere til en mesenchymale-lignende fenotype. Dette kan oppnås via dissosiasjon av tette og adherens Forbindelsesstykke (AJ), løsgjøring av enkeltceller fra epitelceller ark eller 3D-strukturer, og migrering inn i tilstøtende vev (oversikt i [12] – [15]). Hallmark cellulære og molekylære endringer i forbindelse med epitel-mesenchymale overgang (EMT) og invasjonen i de omkringliggende stroma inkluderer tap av E-cadherin uttrykk, oppregulering av matriksmetalloprotease (MMP), aktivering av transkripsjons regulatorer og adopsjon av en spindel-lignende, polarisert fibroblastisk morfologi. I løpet av mesenchymale migrasjon, utvidelse av den fremre kant og tilbaketrekkingen av den bakre kant av den bevegelige celler innebærer koordinat regulering av kortikale F-aktin polymerisasjon og actomyosin sammentrekning. F-aktin montering foran sammentrekning å fremme forlengelse av aktin rike fremspring, og ROCK-mediert fosforylering av myosin lett kjede (pMLC) regulerer actomyosin sammentrekning [16].
Formins har dukket opp som viktige regulatorer av F-aktin og microtubule cytoskeletal dynamikk. Formin familie proteiner er Rho GTPase effektorer. De pattedyr Diaphanous (mDia) -relaterte formins (mDia1-3) har viktige roller i ulike cellulære aktiviteter, inkludert gentranskripsjon, cellecyklusprogresjonen, og membran trafficking. mDia proteiner også regulere F-aktin-nettverk kritisk for å opprettholde integriteten av multi-cellulære strukturer epiteliale [17] – [22]. For eksempel, utarming av mDia hemmer dannelsen av celle-celle veikryss i MDCK celler [23], og forstyrrer MCF-7 monolag av mislocalizing E-cadherin bort fra celle-celle kontakter [24]. Videre undertrykke Diaphanous, den mDia homolog i
D. melanogaster, redusert
pMLC på AJs og destabiliserer normale vev grenser og økt celle protrusiveness [25]. Sammen er disse dataene implisere mDia-Rho signale aksen i organiseringen av komplekse 3D-strukturer som er viktige for morphogenesis, og potensielt, for tumorprogresjon.
Flere linjer av bevis tyder på at formins spille konserverte roller i regulering av kreft cellemotilitet , invasjon og metastasering. mDia2 påvirker invasiv virkemåten av brystkreftceller, som til slutt avhengig av MMP og dannelsen av actin-rik fremspring som kalles invadopodia [26]. Interaksjon av mDia2 med sin negative regulator, dyppe [27], fremmer overgangen av mesenchymale MDA-MB-231 celler i svært bevegelige og invasive ROCK avhengig amoeboid celler [28]. Tilsvarende modulering av mDia2 påvirker også amoeboid invasjon og migrasjon i DU145 prostatakreftceller [29], [30]. En beslektet formin, mDia1 retning og neutrofil kjemotakse [31], [32], celle invasjon [33], og T-cellemigrering og omsetning i perifere lymfeorganer [34], [35]. Andre formin familiemedlemmer, inkludert isoformer av FRL, FHOD og Formin1, har også vært innblandet i regulering vandrende plastisitet og inter mellom mesenchymale og amoeboid bevegelighet i bryst og andre kreftceller [36] -. [41]
gener som koder mDia eller FMNL /FRL er ofte tapt i bryst, prostata, colorectal, lever karsinomer, og hematopoetiske kreft [29], [30], [41], [42]. mDia proteiner også fungere i den normale eggstokk, samt eggstokkreft. Forstyrrelse av
Diaphanous
er assosiert med for tidlig eggstokksvikt [43]. Tap av
DIAPH1 /DRF1
, genet som koder mDia1, ble vist i en modell av OvCa progresjon [10]. Videre genene som koder mDia2 (
DIAPH3 /DRF3
) og formin 1 (
FMN1
) ble nedregulert i tidlig til sent stadium OvCa celler. Dette ble fulgt av avbrudd i F-aktin akkumulering og økning i celle deformerbarhet [44], [45]. Til sammen de foregående observasjoner tyder på en rolle for mDia-kontrollerte aktin dynamikk i utviklingen av ovariesyndrom. Det er uklart om endringer i aktivering staten mDia innflytelse celle-celle adhesjon å opprettholde OvCa spheroid integritet, eller hvis modulering av mDia dirigerer overgangene som ligger til grunn celle invasjon inn i underliggende mesothelium.
For å utforske disse spørsmålene, vi undersøkte rollen Rho /mDia signalisering i OvCa migrasjon og invasjon. Våre resultater viser at en RhoA /mDia2 /ROCK signaliserer aksedrives invasive overganger i ES-2 OvCa celler i 2D kulturer og en 3D spheroid invasjon modell. Aktivering av RhoA ble økt i løpet spheroid formasjon, mens undertrykkelse av mDia2 forstyrret spheroid arkitektur. I motsetning til virkningene av mDia2, uttømming av mDia1 hadde ingen effekt på dannelsen eller integriteten til sfæroider. Når mDia2-utarmet kuler ble innebygd i kollagen-I gels, var det mulig å forbedre enkelt celle invasjon gjennom en ROCK avhengig amoeboid overgang. Disse funnene demonstrerer den gjensidige avhengigheten mellom mDia2 og ROCK for fremme av invasive overganger i OvCa kuler.
Resultater
Spatial lokalisering av mDia proteiner i migrere menneskelige OVCA celler
Vi har innhentet et panel av menneskelige OvCa cellelinjer som representerer flere kliniske undergrupper, deriblant serøse og tydelige celle adenokarsinomer. Noen av disse cellelinjene danner kompakte kuler (OVCA429 og ES-2), mens andre danner løsere cellestrukturer (SKOV3) (figur S1 og [4]). Alle celletypene uttrykte mDia1 og mDia2, uavhengig av sfæroide dannende evne (figur 1A).
A. mDia1 og mDia2 ble vurdert ved immunpresipitering og /eller Western blotting i et panel av humane OvCa celler. Tubulin ble utslettet som en lasting kontroll. B. Cell vedheft til BSA- eller Collagen-I-belagte brønner. Eksperimentet ble utført i triplikate brønner og forsøket ble gjentatt tre ganger. p-verdiene er BSA vs. kollagen-I for hver cellelinje. C. Transwell migrerings analyser ble utført på triplikate brønner og forsøket ble gjentatt tre ganger i 5 timer mot SFM eller 20% FBS. MDA-MB-231 human brystcancerceller er en positiv kontroll migrering. p-verdiene er for SFM lignet med 20% FBS for hver cellelinje. D. Transwell invasjons analyser ble utført på triplikate brønner og forsøket ble gjentatt tre ganger i 24 timer ved 2 mg /ml kollagen-I-geler mot enten SFM eller 20% FBS. MDA-MB-231-celler er en positiv kontroll invasjon. p-verdiene er SFM lignet med 20% FBS for hver cellelinje. E. OVCA429 celler migrert mot 20% FBS i 5 timer i en Dunn kammer. mDia1, mDia2 og F-aktin arkitektur ble visualisert ved IF. Arrow betegner retning av graderingen. N.S. = Ikke signifikant. Alle feilfelt tilsvarer SDS vises er representative eksperimenter fra hver analyse.
OVCA panel ble screenet for lim, trekkfugl og invasive egenskaper (figur 1, B-D, henholdsvis) for å identifisere en meget inngripende , sfæroide dannende cellelinje. SKOV3, OVCA429 og ES-2-celler var like lim på kollagen 2D underlag. Men OVCA429 og ES-2-celler var mer trekkfugl og invasiv enn Skov-tre linje i respons til FBS gradienter. Derfor ble de gjenværende studier utført med enten OVCA429 eller ES-2 celler.
Den romlige lokalisering av endogene mDia proteiner ble evaluert i migrere OVCA429 celler ved hjelp av et Dunn kammer for å opprettholde en stabil FBS gradient. Immunfluorescens (IF) ble utført etter 5 timer migrasjon (figur 1E). Både mDia1 og mDia2 viste en polarisert fordeling orientert mot FBS gradient innenfor trekkende OVCA429 celler (pil viser gradient plassering). mDia1 og mDia2 lokalisert hovedsakelig til lamellene, i motsetning til F-aktin rik lamellapodia, som tidligere er sett i migrere epitel-celler [46]. Disse resultatene tyder på en mulig rolle for mDia1 og /eller mDia2 i å stabilisere kortikale aktin bassenger under OvCa chemotaxis.
Krav for mDia2 i kjemotaktisk migrasjon i OVCA429 celler
neste spurte om mDia protein aktivitet og /eller uttrykk var nødvendig for kjemotaktisk migrasjon. Avstanden migrert av transfekterte OVCA429 celler i et Dunn kammeret ble kvantifisert ved levende celle sporing. Celler ble konstruert for å uttrykke enten mDia-YFP-fusjonsproteiner alene, eller ulike kombinasjoner av kontroll YFP vektor og FLAG-merket proteiner. mDia overekspresjon ble validert ved Western blotting (figur 2A). Celler som uttrykker dominant-negative YFP-mDia-FH2ΔN, som forstyrrer både mDia1 og mDia2 drevet F-aktin montering, [34], [47], [48] migrert dårlig forhold til YFP kontroller. Omvendt, celler som uttrykker den konstitutivt aktivert mDia2 M1041A [49], hvor autoinhibited tilstand er lettet, oppviste økt migrasjon i forhold til YFP + 3XFLAG tom vektorkontroll. mDia1 overekspresjon endret ikke cellevandring i forhold til tomme vektor kontroller. Disse dataene antyder at mDia2 autoinhibition må løslates for at effektiv cellevandring til å skje. I neste rekke studier, ble rollen som mDia2 i kjemotaktisk migrasjon vurdert av seeding mDia2-utarmet OVCA429 celler i transwells. Mens lipid og kontroll siRNA-behandlede celler robust migrerte mot FBS (i forhold til serum-frie kontrollbrønner), ble migrerings betydelig redusert i mDia2-utarmet celler (figur 2C). Til sammen indikerer disse data at mDia2 ekspresjon og /eller aktivitet er nødvendig for optimal kjemotaktisk migrering av OVCA429 celler.
A. Transfekterte OVCA429 migrert for 5% FBS. Levende encellede sporing av transfekterte celler ble utført, og total distanse migrert beregnet. Minst 10 celler ble sporet per tilstand. p-verdiene blir kalkulert i forhold til respektive tomme vektor kontroller. B. OVCA429-celler ble transfektert med lipid bare styrer siRNA eller siRNA rettet mot mDia2 ved økende konsentrasjoner (25, 50, 100 nM, betegnet med kiler) for enten 72 eller 96 timer. mDia2 uttømming ble bekreftet av Western blot. C. OVCA429-celler ble transfektert med 100 nM siRNA i 72 timer, og transwell migrasjon analysene ble utført i 5 timer mot en SFM eller 10% FBS. Analysen ble utført i triplikate brønner og forsøket ble gjentatt tre ganger. Et representativt forsøk er vist. p-verdi som vises er 10% FBS behandlet kontroll vs. mDia2-utarmet celler. Alle feilfelt tilsvarer angå som representant eksperiment.
Den RhoA /mDia2 signale akse i dannelsen av kompakte OvCa kuler
Rho-responsive mDia proteiner kan regulere celle-celle kontakter og fremme enkeltcelle motilitet [18], [26] – [28], [49]. Vi neste fastslått hvorvidt RhoA /mDia2 signaliserer aksen var involvert i OvCa spheroid formasjon. ES-2-celler hurtig dannes sterkt komprimerte kuler (figur S1) og ble anvendt for de gjenværende studiene. Kravet til Rho GTPase-aktivitet i celleklump dannelse ble testet ved å eksponere ES-2-celler til økende konsentrasjoner (0,5 til 2,0 mikrogram /ml) av C3-transferase, en inhibitor av RhoA-C. Som vist i fig S2A, C3-behandlede kuler ble mer løst organisert og mindre sammenpresset i forhold til bærer-behandlede kontroller. Siden tidligere arbeid har vist at det totale nivå av RhoA er økt i sfæroider avledet fra hepatokarsinom [50], ved spurte vi dersom endringer i RhoA aktivitet forekommer i forbindelse med dannelsen av ES-2 sfæroider. Sfæroidene ble dannet fra 500 celler i løpet av 24 timer (figur 3A). RhoA og uttrykk for sine nedstrøms effektorer, mDia1 og mDia2 ble deretter evaluert i lysatene fra cellemono og sammenslåtte kuler høstet mellom 24-120 timer. Totalt sett mDia2 nivåene gikk ned i kulene i forhold til monolagene. Innenfor de sfæroide populasjoner ble det tidsavhengige forskjeller i mDia2 ekspresjon observert med litt lavere nivå som angis i 72 og 96 timer sfæroider, i forhold til 24, 48 og 120 timer sfæroider (figurene 3B og S3A). I motsetning til mDia2, ble nivåene av mDia1 økt i kuler i forhold til monolag. I kulene mDia1 falt svakt fra 24 timer gjennom 120 h (Tall 3B og S3b). Totalt RhoA nivåer også falt i kulene, i forhold til monolagene. Likevel, RhoA nivåer dramatisk gjenvinnes 120 h av spheroid dannelse (figur 3B og S3C). Siden, er avhengig av aktivering av GTP-bindende samspillet av RhoA med sine nedstrøms effektorer (som mDia eller ROCK), vi neste kvantifisert nivåene av aktive GTP-bundet RhoA i kuler av G-LISA. Mengden av RhoA-GTP var signifikant økt i sfæroider som dannes i 48-120 timer sammenlignet med ikke-stimulerte ES-2 cellemonolagene, som nærmer seg den som ble observert i monolag ble behandlet med en kjent RhoA aktivator, lysofosfatidisk syre (LPA) (figur 3C). Derfor er det generelle nivået av RhoA aktivering forbedret på spheroid modning.
A. ES-2 sfæroider fotografert av lysfelt mikroskopi. Scale bar = 250 mikrometer. (Merk: ute av fokus plate-belegg bildeartefakter og /eller kondens innen uregelmessige plastplater sett her er felles for BF bildebehandling). B. Lysates fra ES-2 monolagene eller kuler ble Western-strøket etter angitte tider. C. RhoA G-Lisas ble utført på ubehandlede eller LPA-behandlede ES-2 monolagene, eller kuler. p-verdiene står i forhold til ubehandlet enkeltlag. Eksperimentet ble utført i kvadruplikat-brønner, og eksperimentet ble deretter gjentatt tre ganger. Data kombinert fra 3 eksperimenter er vist. p-verdiene er vist ovenfor stolpene og står i forhold til ubehandlede kontroller monolags. D. Spheroids dannet i 72 timer ble innebygd, faste og mDia2 visualisert ved konfokalmikroskopi. Bilder ble innhentet ved hjelp av en 20 × objektiv med 3D-gjengivelse av serie skiver. Bar = 25 mikrometer. Åpne piler indikerer områder med overlapping, mens lukkede piler indikerer en sammenstilling av F-aktin og mDia2. Alle feilfelt tilsvarer angå som representant eksperiment, hvis ingenting.
Som et første skritt mot å avgjøre om RhoA avhengig aktivering av mDia2 kan påvirke dannelsen av celle-celle veikryss, ved siden spurte vi om mDia2 og F-aktin er samlokalisert i kuler på celle-celle veikryss (Figur 3D). Spheroids dannet for 72 timer avslørte tydelige F-aktin-beriket celle-celle veikryss, med punktat mDia2 underliggende /proksimale til disse knutepunktene (fylt pilspiss). I noen veikryss, mDia2 syntes å co-lokalisere med F-aktin (uten fylling pilspiss). Dette tyder på en mulig rolle for mDia2 i å regulere F-aktin dynamikk nødvendige for utvikling eller vedlikehold av celle-celle veikryss.
mDia2 uttømming fører til dannelsen av mindre, uorganisert kuler
For å ytterligere evaluere rollen mDia proteiner i eggstokkene spheroid formasjon /integritet, ansatt vi en RNA interferens strategi. Robust siRNA-mediert knockdown av enten mDia2 eller mDia1 ble validert gjennom 120 h i monolagskulturer, med svak oppgang fra 144 h (Figur 4A og S4). Spheroids ble dannet fra monolagcellene 72 timer etter siRNA behandling. Spheroid diameter ble deretter målt 24-48 timer senere (96-120 h totalt siRNA behandling). mDia2 tømming etter 48 timer resulterte i en beskjeden, men statistisk signifikant reduksjon (10-20%) i sfæroide diameter i forhold til kontroll siRNA behandling. Lignende resultater ble oppnådd når mDia2 ble uttømt med siRNA bassengene eller individet siRNA rettet mot mDia2 (figur S4), selv om undertrykkelse av mDia2 uttrykk med sammenslått siRNA var mer konsekvent og vedvarende. Derfor ble alle etterfølgende studier utført ved anvendelse av sammenslått siRNA. I tillegg til svak nedgang i celleklump diameter, mDia2-utarmet ES-2 sfæroider var synlig mindre organisert med ujevne kanter og noen enkeltceller løst festet til kantene. En lignende uorganisert sfæroide fenotype et resultat av tilsetning av en mDia1 /mDia2 FH2 inhibitor, SMIFH2 (figur S5) [51]. Der resultatene skyldtes mDia2 utarming, som mDia1 uttømming hadde ingen effekt på spheroid størrelse (figur 4B, C).
A. siRNA-mediert mDia1 (øverst) eller mDia2 (lavere) knockdowns ble utført på ES-2 monolag (Merk: ute av fokus plate-belegg bildeartefakter /kondens i uregelmessige plastplater sett her er felles for BF bildebehandling). B-C. Etter 72 timer etter siRNA eller kontroll behandling, ble kulene dannet og diameter målt under lysfelt mikroskopi 48 timer senere (120 timer etter siRNA behandling). Bar = 100 mikrometer. Minst 30 sfæroider ble målt for hver betingelse. p-verdiene er nevnt ovenfor barer og står i forhold til kontroll siRNA kuler. D-E. ES-2 monolag var ubehandlet eller behandlet med de angitte sirnas i 48 timer, sfæroider som dannes i ytterligere 48 timer, og Western blot eller RhoA G-lisas utføres på lysater. LPA er en positiv kontroll for RhoA aktivering. G-LISA Forsøket ble utført to ganger, i fire eksemplarer, og kombinerte data er vist med p-verdiene som er oppført ved siden av stolpene. P-verdier er i forhold til enten ubehandlede eller kontroll siRNA-behandlede kuler, som nevnt. F. Ubehandlet (UT), lipid bare eller siRNA-mediert kontroll og mDia2 knockdowns ble utført på ES-2 monolagene i 72 timer og pMLC2 nivåer vurderes av Western blotting. G. Kontroll og mDia2 knockdowns ble utført i 72 timer, og kuler dannet. Spheroids ble inndelt på angitte tidspunkter etter dannelsen og cellene telles. Forsøket ble gjentatt 5 ganger. Et representativt forsøk er vist. Feilfelt tilsvarer SDS fra et representativt eksperiment.
Mulige forklaringer på den litt mindre størrelsen på ES-2 kuler kan omfatte redusert celleproliferasjon, redusert gjennomsnittlig cellestørrelse, celle avløsning eller større spheroid komprimering via økt RhoA styrt pMLC2 aktivitet. Vi bestemte derfor hvis RhoA-GTP nivåene ble endret på mDia2-utarmet kuler. mDia2 uttømming ble validert i kulene dannet for 24-48 h (siRNA behandling for 72-96 h) (figur 4D). På 96 timer etter siRNA behandling, RhoA-GTP aktivitet var upåvirket i kontroll og mDia2-utarmet kuler (Figur 4E). I samsvar med denne observasjonen, forble pMLC2 uforandret i cellemonolagene (figur 4F). Videre gjorde mDia2 uttømming ikke endre mobiltelefonnummer innen inndelt kuler (Figur 4G). Dette indikerer at verken celleproliferasjon eller tap av de-levd cellene var ansvarlig for den mindre spheroid størrelse. Det foreslår også at mens siRNA-mediert uttømming av mDia2 fører til en mer uorganisert og uregelmessig spheroid montering, er sannsynligvis tilstrekkelig til å opprettholde både RhoA-mediert kontraktilitet og cellulær proliferasjon de rester mDia2 protein. Sistnevnte begrep er i samsvar med en tidligere studie av mDia1 i T-celleaktivering, hvor lave nivåer av mDia proteiner viste seg å være tilstrekkelig til å opprettholde noen cellulære prosesser (
f.eks
., F-aktin opphopning vs. mikrotubul-dynamikk) , mens samtidig svekke andre funksjoner [52].
mDia2 uttømming forbedrer ES-2 spheroid invasjon via en amoeboid overgang
For å vurdere om de RhoA /mDia2 akse funksjoner i spheroid invasjon, ES-2 kuler ble innebygd i kollagen ved (T0) og lov til å invadere gjennom 168 h (figur 5A). En raskt fremme foran invasive celler dukket opp etter 24 timer, og gel sammentrekning var omfattende nok til å rippe gels innen 72 timer. Sfæroid invasjon ble målt ved å trekke en region av interesse rundt omkretsen av invasive foran, som omfattet minst 95% av fremmede celler (som bestemt ved fluorescens merking). Invasion avhang Rho GTPases, som invasive fronten ble kraftig redusert i ES-2 kuler som ble dyrket og innebygd i nærvær av C3 transferase, i forhold til kjøretøykontroll behandlede kuler (Figur S2, B og C). Siden Rho-rettede mDia proteiner drive invasjon i en rekke epitel-avledede cancerceller [26], [29], [30], visualisert vi den romlige lokalisering av mDia proteiner i faste invasive ES-2 sfæroider. mDia2 ble distribuert i et polarisert mønster, med anrikning på sfæroide kantene der invasive celler utgikk inn i collagen (figur 5B). Ved høyere forstørrelse av invasiv front, ble mDia2 dramatisk lokalisert til avlange strukturer som ligner tubulated endosomes [53], som utvidet gjennom de lange utstikkere av mesenchymale celler. Interessant, mDia1 var for det meste atom i invaderer celler, i samsvar med tidligere rapporter for atom aktivert mDia1 regi SRF-mediert F-aktin dynamikk i kjernen [54]. Vi har observert flere cellulære morfologi i invaderende celler i kollagen, inkludert sfæriske amoeboid celler (~40% invaderende celler), samt langstrakte, polarisert mesenchymale celler (-60% invaderende celler) som migrerer i tråder (data ikke vist). Interessant, invasive sfæroider reproduserbart (ved hjelp av flere primære antistoffer av forskjellige vert og kommersielle avledninger) viste tydelig, punktformet mDia2 flekker inne i matriksen (Figur 5C og data ikke vist). Tidligere ble mDia proteiner påvist i pro-trekkende OvCa-avledet mikropartikler [55] og mDia2 rettet pro-trekkfugl oncosome formasjonen i prostatakreftceller [29]. Biokjemiske studier er for tiden i gang for å karakterisere mDia2-beriket ekstracellulære partikler som finnes i invaderende OvCa kuler.
A. Spheroids ble dannet først i 48-I gels, og avbildes ved lysfelt mikroskopi etter angitte tider. Bar = 150 mikrometer. B. Spheroids ble dannet i 72 timer, innleiret i kollagen I geler og lov til å invadere i 24 timer. Spheroids ble fikset og IF utført for mDia1, mDia2 og F-aktin. Bar = 100 mikrometer. C. Høyere forstørrelse bilde (63 ×) invadere celler fra utpekt ROI i B. mDia1, mDia2, og F-aktin ble visualisert ved konfokalmikroskopi. Bar = 25 mikrometer. D. Etter 56 timer etter siRNA behandling, ble kulene dannet og innebygd i kollagen i 104 timer etter siRNA behandling. Området for ROI trukket tilsvarende 95% av invaderende celler ble beregnet for 0 og 18 timer etter invasjon (122 timer etter siRNA behandling). Representative kuler på 4X er vist farget for phalloidin og bilder kontrastforsterket. Bar = 100 mikrometer. Minst 30 sfæroider ble målt for hver betingelse. p-verdiene er vist ovenfor histogrammet og står i forhold til invasjonen på 18 timer for enten lipid eller kontroll behandlet kuler. E. Forlengelse indeksene ble beregnet for invasive celler fra D. Minst 30 invasive cellene ble målt per tilstand. Representant phalloidin farging er vist. Bar = 25 mikrometer. EI 2 (stiplet linje) regnes mesenchymale celletype. p-verdiene er vist ovenfor tomten og står i forhold til invasjonen på 18 timer for enten lipid eller kontroll behandlet kuler. Alle feilfelt tilsvarer SDS fra et representativt eksperiment.
For å vurdere rollen til mDia i enkelt celle invasjon, målte vi invasiv område av embedded mDia1 eller mDia2-utarmet ES2 kuler etter 0 h (104 h post-knockdown) og 18 timer (122 timer etter knockdown). Ubehandlede og kontroll siRNA-behandlede kuler robust invaderte kollagenmatriksen i 20 timer. Men mDia2-utarmet kuler avdekket betydelig forbedret invasjonen i forhold til kontroller (Figur 5D og Figur S4C), til tross for deres beskjedent mindre størrelse på embedding (Figur 4C). Omvendt, mDia1-utarmet sfæroider invaderte i samme grad som kontroll kuler (fig S6), noe som indikerer at mDia1 ikke spiller en vesentlig rolle i OvCa sfæroide invasjon. Siden endringer i mDia2 ekspresjon og /eller funksjon i forbindelse med amoeboid overganger [27] – [29], beregnet vi forlengelsesindekser (EI) i invasive celler avledet fra kulene ved å dividere den lange aksen av cellen ved den korte aksen; En EI på 2 eller mer indikerer en langstrakt mesenchymale form, mens en EI på mindre enn 2 indikerer en mer fremtredende avrundet, amoeboid fenotype. Resultatene tyder på at i de kulene der mDia2 utarming forbedrede invasjon invasiv cellene var overveiende amoeboid i form i forhold til ubehandlet og kontroll siRNA-behandlede kuler (figur 5E).
ROCK støtter både mesenchymale og amoeboid 3D motilitet programmer i invasive ES-2 sfæroider
amoeboid overganger kan innebære Rho-rettet ROCK signale til direkte kontraktilitet [56], [57]. ROCK motvirker også mDia proteiner med hensyn til å opprettholde celle-celle veikryss i 2D monolag [18]. Imidlertid er samspillet mellom ROCK og mDia proteiner for å opprettholde celle-celle veikryss i 3D-strukturer som OvCa kuler uklart. Vi vurderte derfor rollen ROCK aktivitet i spheroid formasjon. Vi blokkert ROCK aktivitet ved å behandle kuler med spesifikk hemmer, Y27632. Sfæroid størrelse ble noe redusert i løpet av 48 timer fra behandlingen (figur 6A), hvilket antyder at ROCK /myosin-formidlet kryssbinding av mDia regulerte F-aktin kan spille en rolle i sfæroide formasjon. Hemming av ROCK dramatisk undertrykt spheroid invasjonen i forhold til kontroller (Figur 6b), i samsvar med tidligere studier implicating ROCK i blebbing av tykktarms [58] og Caov3 eggstokkreft monolagcellene [59]. En påfallende overdrevet mesenchymale overgang dominerte i de få cellene fyller den beskjedne invasive fronten i celler behandlet med ROCK inhibitor (figur 6C), noe som indikerer et krav for ROCK å effektivt direkte cellular kontraktilitet i både amoeboid og mesenchymale invasjons programmer.
A. Sfæroider ble dannet i nærvær av kjøretøyet eller 90 uM Y27632 i de angitte tidsrom. Spheroid diameter ble deretter målt i minst 30 kuler på 10 ×. Bar = 100 mikrometer. p-verdiene er vist ovenfor tomten og er kontroll H
20-behandlede kuler. B. Spheroids ble dannet i 48 timer i nærvær av Y27632, og deretter innleiret i kollagen-I i 0-48 timer i nærvær av kjøretøy eller Y27632. Invasive fronter ble målt ved hvert tidspunkt i minst 30 kuler per tilstand. Bar = 400 mikrometer. Representative kuler på 4 × blir vist farget for phalloidin og bilder kontrastforsterket. P-verdiene er oppført over grafen og står i forhold til å kontrollere H
20-behandlede kuler. C. Forlengelse indeksene ble beregnet for invasive celler i kollagen gels er vist i B. EI 2 (stiplet linje) ble vurdert som mesenchymale celletype. Minst 30-celler ble målt pr tilstand.
