Abstract
Cytokin og vekstfaktor signalveier som involverer STAT3 ofte konstitutivt aktivert i mange humane primære svulster, og er kjent for transkripsjons rollen de spiller i å kontrollere cellevekst og cellesyklusprogresjon. Imidlertid er omfanget av STAT3 rekkevidde på transkripsjonen kontroll av genomet som en helhet forblir et viktig spørsmål. Vi spådde at denne vedvarende STAT3 signale påvirker en rekke cellulære funksjoner, mange av dem fortsatt gjenstår å bli karakterisert. Vi tok en bred tilnærming for å identifisere nye Stat3 regulert gener ved å undersøke endringer i genom-wide genuttrykk profil ved mikromatriser, ved hjelp av celler som uttrykker konstitutivt-aktivert STAT3. Ved hjelp av beregningsorientert analyse, var vi i stand til å definere genuttrykk profiler av celler som inneholder aktivert STAT3 og identifisere kandidat målgener med et bredt spekter av biologiske funksjoner. Blant disse genene vi identifisert Necdin, en negativ vekst regulator, som en roman STAT3 target gen, hvis uttrykket er nedregulert på mRNA og proteinnivåer når STAT3 er konstitutivt aktiv. Denne undertrykkelsen er STAT3 avhengig, siden hemming av STAT3 hjelp siRNA gjenoppretter Necdin uttrykk. En STAT3 DNA-bindende setet ble identifisert i Necdin promoteren og både EMSA og kromatin immunopresipitering bekrefte binding av STAT3 til denne regionen. Necdin uttrykk har tidligere blitt vist å bli nedregulert i et melanom og en resistent ovarian cancer cellelinje. Videre analyser av Necdin uttrykk demonstrert undertrykkelse i en STAT3 avhengig måte i human melanom, prostatakreft og brystkreft cellelinjer. Disse resultatene tyder på at STAT3 koordinerer ekspresjon av gener som er involvert i flere metabolske og biosyntetiske reaksjonsveier, integrere signalene som fører til globale transkripsjonelle endringer og onkogenese. STAT3 kan utøve sin onkogen virkning av opp-regulering av transkripsjon av gener som er involvert i å fremme vekst og proliferasjon, men også ved å nedregulere ekspresjon av negative regulatorer av samme cellulære prosesser, for eksempel Necdin
relasjon:. Haviland R , Eschrich S, Bloom G, Ma Y, Minton S, Jove R, et al. (2011) Necdin, en negativ vekstregulator, er en roman STAT3 Target Gene nedregulert i Human Cancer. PLoS ONE 6 (10): e24923. doi: 10,1371 /journal.pone.0024923
Redaktør: Toshi Shioda, Massachusetts General Hospital, USA
mottatt: 21 august 2010; Godkjent: 24 august 2011; Publisert: 27 oktober 2011
Copyright: © 2011 Haviland et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Angela Musette Russo Foundation (https://www.russofoundation.com/), H. Lee Moffitt Cancer Center og Research Institute (https://www.moffitt.org) og National Cancer Institute (NCI) Grant R01-CA115674 (https://www.cancer.gov/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
STAT3 er en latent transkripsjonsfaktor cytoplasmisk, indusert av en rekke oppstrøms signaler, inkludert vekstfaktorer, cytokiner og ikke-reseptor-tyrosin-kinaser [1] – [7]. Ved aktivering av tyrosinfosforylering, danner STAT3 dimerer, som translocate til kjernen og regulerer transkripsjon av mål-gener. Under normale fysiologiske betingelser, er STAT3 aktivitet kontrollert; imidlertid, intracellulære signalveier som involverer STAT3 ofte konstitutivt aktivert i mange forskjellige humane primære tumorer [8] – [15]. Vi og andre har vist at konstitutiv aktivering av STAT3 gir kreftceller med vekst og overlevelse fordeler [16] og forbedrer tumor angiogenese [17] og metastase [18]. Nyere studier har også indikert at STAT3 aktivering bidrar til tumor immunsvik [19], [20]. Disse funnene tyder på at avvikende STAT3 signale påvirker en rekke fundamentale cellulære funksjoner gjennom flere mekanismer.
Til dags dato, oppregulert uttrykk for mange STAT3 målgener har blitt identifisert, inkludert VEGF [17], BCL-2 , BCL-xL [21], p21, cyclin D1 [22] og survivin [23]. Disse STAT3 målgener har generelt blitt identifisert på individuell basis, mens få studier har forsøkt å identifisere et stort antall Stat3 regulerte gener [24] – [28]. Vi tok en bred tilnærming for å identifisere nye Stat3 regulert gener involvert i onkogenese ved å undersøke endringer i genom-wide genuttrykk profil ved mikromatriser, ved hjelp av celler som uttrykker konstitutivt aktiv STAT3. Kombinere denne tilnærmingen med beregnings analyse av microarray resultater, var vi i stand til å definere genuttrykk profilen til celler som uttrykker aktivert STAT3 og undersøke hvilken rolle STAT3 i både positiv og negativ regulering av genekspresjon.
Pathway og funksjonell analysen viser at STAT3 har en viktig rolle i å regulere, både positivt og negativt, et variert utvalg av cellulære prosesser, i tillegg til transkripsjon. STAT3 koordinerer uttrykket av gener som er involvert i flere metabolske og biosyntetiske veier, integrere signaler som fører til globale transkripsjons endringer og onkogenese. Disse inkluderer gener som er involvert i celleadhesjon, cytoskeletal remodellering, nukleotid, lipid- og proteinmetabolisme, så vel som signaloverføring.
Gjennom matematisk analyse av våre data, identifiserte vi Necdin, en negativ vekstregulator, som en ny potensiell STAT3 target genet. Necdin er en potent vekst suppressor som er overveiende uttrykt i post-mitotisk nevroner [29] – [32]. Necdin uttrykk har vist seg å bli nedregulert i begge carcinoma cellelinjer og primære tumorer [33], som tyder på at undertrykkelse av Necdin uttrykk kan ha en rolle i onkogenesen. Vi har bekreftet at Necdin mRNA-ekspresjon inverst korrelerer med STAT3 aktivitet i celler som uttrykker konstitutivt aktiv STAT3 og at STAT3 regulerer direkte ekspresjon av Necdin ved promotoren nivå. I tillegg er Necdin ekspresjon i humane tumorcellelinjer omvendt korrelert med aktivering av endogen STAT3. Våre funn gir ytterligere bevis for en rolle Necdin som en fysiologisk mål av STAT3, viser at beregnings analyse av microarray data kan brukes til å identifisere potensielle STAT3 målgener for videre etterforskning.
Resultater
identifisering av potensielle STAT3 målgener Bruke oligonukleotid Mikromatriser
for å identifisere potensielle nye Stat3-regulert gener, undersøkte vi globale genuttrykksmønster i cellelinjer som bærer vedvarende aktiv STAT3. Genekspresjonsprofiler i slike celler som er sannsynlig å være representative for den genetiske profilen til en kreftcelle med avvikende STAT3 ekspresjon, sammenlignet med å indusere STAT3 aktivitet forbigående ved hjelp av eksogen stimulering, slik som IL-6 eller transient transfeksjon [25].
RNA ble innhøstet fra normale Balb /c-3T3-celler med lave nivåer av endogen STAT3 aktivitet, for å tjene som en kontroll. RNA ble også utvunnet fra Balb /c-3T3-celler som er stabilt transfektert med enten v-Src, som induserer vedvarende aktivering av STAT3 [34], [35], eller konstitutivt aktiv mutant, STAT3-C [36]. Triplikatprøver ble oppsamlet, en fra hver av tre påfølgende passasjer, og hver prøve ble hybridisert RNA til en enkelt Affymetrix mus Genome 430 2,0 Genechip. Analyse av betydning Mikromatriser (SAM) [37] ble brukt til å identifisere differensielt uttrykte gener mellom sperre Balb /c 3T3-celler og celler som er stabilt transfektert med enten v-Src eller STAT3-C. Vi aksepterte alle gener er identifisert av SAM som ulikt regulert av minst 1,5 ganger [38].
Overlapping av Two Microarray datasett
Microarray analyse og påfølgende SAM generert to lister med forskjellig uttrykt gener: en liste over identifiserte gener uttrykt forskjellig mellom kontroll Balb /c-3T3-celler og celler transfektert med v-Src, og den andre listen inneholdt gener som differensielt uttrykte mellom kontroll Balb /c-3T3-celler og celler transfektert med STAT3-C. Gener er felles for begge listene er mest sannsynlig å være direkte regulert av STAT3. Disse genene ble identifisert ved kryssreferanser dataene i de to listene ved hjelp av Microsoft Excel FINN.RAD-funksjonen
Mens v-Src transformerte celler har konstitutivt aktiv STAT3, Src stimulerer også andre Stat3 uavhengig trasé [39]. – [42]. I kontrast er målgener aktiveres av STAT3-C er begrenset til direkte binding av det aktiverte protein til STAT3 konsensus-områder i DNA. Derfor, ved bruk av celler stabilt transfektert med enten v-Src eller STAT3-C tillot oss å kontrollere for klonale variasjoner, samt divergens i signalveier avhengig av mekanismen av STAT3 aktivering. Bruken av flere microarray replikerer i vår tilnærming ytterligere økning tillit til resultatene. Dette tillot oss å identifisere et sett av felles gener som mål for STAT3. Dataene ble ytterligere validert ved identifisering av flere tidligere karakteriserte Stat3-regulert gener, inkludert CCND1, p21 [22], VEGFA [17], og Mcl-1 [43]. Den mest betydelig overuttrykt (indusert) og under-uttrykte (fortrengte) gener er angitt i tabell 1 og tabell 2, respektivt. En mer omfattende liste, inkludert de 50 beste betydelig over uttrykt og under uttrykte gener er inkludert i tabellene S1 og S2.
Til dags dato, de fleste studier har undersøkt antatte STAT3 målgener som er oppregulert eller over til uttrykk når STAT3 er aktiv. STAT3 har vist seg å aktivere transkripsjonen av mange gener som er involvert i onkogenesen [8], celleoverlevelse [16], tumorprogresjon [23] og metastase [18]. STAT3 har også tidligere blitt vist å undertrykke transkripsjon av en håndfull av gener, inkludert p53 [44] og nitrogenoksid syntase [45] Det er imidlertid våre resultater viser at STAT3 er i stand til å undertrykke ekspresjon av et mye større antall gener. Denne nye oppdagelsen har potensial til å påvirke dypt biologien til celler som konstitutivt aktiv STAT3.
Et slikt gen som ser ut til å bli undertrykt ved STAT3 er den negativ vekstregulator Necdin. Fem Affymetrix probesets tilsvarer NDN er rangert på listen over de 12 beste mest betydelig undertrykt probesets (tabell 2), noe som tyder på at Necdin er betydelig undertrykt når STAT3 er konstitutivt aktiv. Dette viser at beregnings analyse av microarray data kan brukes til å identifisere potensielle STAT3 målgener for videre etterforskning.
Pathway Analysis avslører kjent og Novel Funksjoner av Stat3
Mikromatriser vurdere samtidige endringer i transkripsjonsnivåer på en individuell basis, noe som resulterer i en lang liste av gener som har betydelig endret transkripsjonsnivåer sammenlignet med kontrollceller. Men disse endringer i genekspresjon ikke forekomme som uavhengige hendelser i cellen, men blir styrt på en koordinert måte, og er ofte forbundet med hverandre. Pathway Analysis er en objektiv metode for å bestemme hvorvidt forskjellig uttrykte gener, og proteinene de koder, er beriket spesielt veier, som gir innblikk i den biologiske betydningen av de observerte endringene.
Vi utsettes listen over differensielt uttrykte gener felles mellom v-Src og STAT3-C uttrykker celler til MetaCore ™ Analysis Suite (GeneGO) og sammenlignet dem med kjente biologiske baner i metabasen ™ database. Ved hjelp av denne analysen var vi i stand til å identifisere kjente Stat3 trasé, inkludert JAK /STAT sti og Angiotensin /STAT veien. Dette gir støtte for bruk av slike analyser for å identifisere nye veier som kan også være regulert av STAT3.
Cell heft og cytoskeletal ombygging var blant de mest betydelig beriket trasé identifisert fra forskjellig uttrykte gener (Tabell 3). Rollen til STAT3 i cytoskeletal remodeling har tidligere blitt rapportert [46]. Funksjonell analyse av genene vi identifisert i cytoskeletal ombygging prosesser, indikerer at STAT3 regulerer gener som er involvert i protein fosforylering, signalisering (MAPKK og Ras veier), samt respons på hypoksi og cellemigrasjon.
også undersøkt genene reguleres av STAT3 i celleadhesjon og vist at proteiner involvert i celle-matrise-adhesjon og celle-celle-adhesjon, spesielt fokal adhesjonsdannelse, ble spesielt anriket når STAT3 er konstitutivt aktiv, så vel som flere gener i integrin celleadhesjon sti. Som sådan, viser vi at beregnings analyse av microarray data kan identifisere både kjente og nye veier regulert av STAT3.
Funksjoner av indusert Gener
For å bestemme den funksjonelle klassifisering av forskjellig uttrykt gener er identifisert av SAM, utførte vi Funksjonell merknad bruker verktøyet i DAVID Bioinformatikk Database (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [47], [48]. Et bredt spekter av mål-genene ble endret ved STAT3 aktivering, inklusive gener som er involvert i flere reaksjonsveier som regulerer biologiske og cellulære prosesser, protein lokalisering og transport, samt organ og systemutvikling (tabell 4). Gener innenfor disse kategoriene (tabell S3. «Affymetrix Probeset IDer kolonnen utvides til å liste opp alle probeset IDer) omfatter mange som er involvert i cellevekst og vedlikehold, slik som lipid, nukleotid og proteinsyntese, metabolisme og /eller lokalisering (inkludert VLDLR, APOL6, AK5, MTAP, UPP1, POP5, NUPL1, SEC61B, VDP) samt signaloverføring, som alle er pålagt å fremme cellevekst og spredning.
STAT3 har en godt karakterisert rolle i regulering av gen transkripsjon, men vi viser også via Functional Analysis, at STAT3 kontrollerer ekspresjonen av gener som er involvert i cellulære prosesser som kreves for å transportere proteinene og regulere deres subcellulær lokalisering. Dette støtter vår hypotese om at STAT3 koordinerer flere veier i cellen og avslører at STAT3 har omfattende effekter, kontrollere flere cellulære veier involvert i fundamentale biologiske prosesser. Våre resultater tyder på at STAT3 orkestrerer transkripsjon, oversettelse, transport og lokalisering fører til bred rekkende effekter på cellevekst, spredning og overlevelse.
I motsetning til tidligere studier av STAT3 målgener, vi demonstrert at STAT3 regulerer et mangfoldig utvalg av gener i både en positiv og negativ måte. De fleste gener reguleres av STAT3 som har blitt identifisert til å demonstrere økt uttrykk i cellene der STAT3 er aktivert. Men våre resultater viser også at STAT3 signalering fører til undertrykkelse av mange gener, inkludert Necdin, som kan dypt påvirke biologi celler husing konstitutivt aktiv STAT3.
konstitutivt Aktivert Stat3 Blocks Necdin mRNA uttrykk
Vi deretter satt ut for å verifisere beregningsanalyse og bekrefte om Necdin er faktisk en STAT3 target genet. NDN, genet som koder Necdin, en negativ vekst regulator [31] og medlem av MAGE familien av melanom-assosiert tumorantigener, ble identifisert som en kandidat STAT3 regulerte genet. Fem Affymetrix probesets tilsvarer NDN er rangert på listen over de 12 beste mest betydelig undertrykt probesets (tabell 2). Når sammenlignet med normale kontrollceller, analyse av mikroarray data viste at NDN ekspresjon ble gående undertrykket i de cellelinjer som uttrykker v-Src eller STAT3-C, noe som indikerer at NDN er en kandidat STAT3-regulert gen i begge disse cellelinjer (Fig . 1A). Figur 1B. bekrefter at NDN mRNA uttrykket er dramatisk nedregulert i v-Src og STAT3-C uttrykke celler som målt ved kvantitativ real-time PCR.
A. Microarray analyse av Necdin mRNA uttrykk nivåer. RNA fra Balb /c-3T3-celler som stabilt uttrykker enten pMvSrc eller pRc-STAT3-C ble isolert, behandlet og hybridisert til Affymetrix Mouse Genome 430 2,0 GeneChips. For å kontrollere for både biologisk og eksperimentell variasjon, for hver cellelinje, ble cellene høstet fra tre etterfølgende passeringer. Ved hver passering, ble fem 10 cm plater av eksponentielt voksende celler samles for RNA ekstraksjon og RNA hybridisert til en enkelt Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Genechip. Arrays ble skannet og fluorescens ble målt med Affymetrix GeneArray 3000 Genechip skanner og bildet behandles ved hjelp av (GCOS) versjon 1.1 Genechip kjøreprogramvare for å produsere CEL filer som inneholder probe-nivå data for hver Genechip. Alle microarray eksperimenter ble utført på triplikate uavhengige eksperimenter, og resultatene er presentert for hver sonde angitt som gjennomsnitt gangers endring i RNA-ekspresjon. Data for to forskjellige probesets er presentert. Den signalintensiteten av foreldre Balb /c-3T3-celler ble satt til 100%. B. Real-time PCR-analyse. RNA prøver som brukes for microarray analyse ble målt for Necdin mRNA uttrykk ved hjelp Real-time PCR med gen-spesifikke primere og fluorescerende-merket probe (Taqman® genekspresjon Analyser, Applied Biosystems). RNA uttrykk ble normalisert til 18S rRNA. n = 3 uavhengige eksperimenter. C. Western. NIH3T3-celler som stabilt uttrykker v-Src ble sådd ut (2,5 x 10
5) i 6 cm vevskulturplater i komplett medium 24 timer før transfeksjon. Cellene ble så transfektert med enten 125 nM kontroll siRNA eller 100 nM eller 125 nM STAT3 siRNA. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble totalt protein høstes og like mengder av totalt protein (100 ug) ble applisert på en 10% SDS-polyakrylamidgel, elektroforese og immunoblottet for Necdin (polyklonalt, Abcam ab18554), fosforylert STAT3 (p-STAT3, Cell Signaling 9131), total STAT3 (Santa Cruz, sc-482) og anti-aktin (monoklonalt, Sigma A-4551) proteiner.
undertrykkelse av Necdin mRNA uttrykk er STAT3 Dependent
NIH-3T3-celler som stabilt uttrykker v-Src uttrykker høye nivåer av aktiv STAT3. Disse v-Src 3T3 celler ble behandlet med enten kontroll siRNA eller to forskjellige doser av STAT3-spesifikke siRNA. Celler behandlet med kontroll siRNA opprettholde høye nivåer av STAT3 og har lave nivåer av Necdin ekspresjon (Fig. 1C, kolonne 1). Som forventet, STAT3 siRNA effektivt inhiberer ekspresjon av total STAT3 (fig. 1C, kolonnene 2 og 3). I disse cellene ekspresjon av STAT3 protein ble inhibert på en doseavhengig måte, og Necdin ekspresjon ble gjenopprettet på en måte som samsvarer med STAT3 knockdown i denne cellelinje. Disse resultatene tyder på at undertrykkelse av Necdin er avhengig aktivert STAT3.
Aktivert STAT3 binder seg til Necdin Arrangøren
in vitro
For å avgjøre om STAT3 regulerer Necdin transkripsjon direkte, vi analysert sekvensen til mus NDN promotoren [32] for potensiell STAT3 bindingsseter. Stat3 konsensus nettsteder har blitt definert som palindromic sekvenser med felles sekvensen 5′-TT (N
4-6) AA-3 «[49]. Vår analyse identifisert flere kandidat STAT3 bindingssteder i hele 1500 basepar oppstrøms for transkripsjonsstartsetet. Dobbelt-trådede oligonukleotid-prober ble samlet for alle potensielle bindingsseter og testet i en konkurranse EMSA (fig. 2A) for deres evne til å konkurrere for binding av STAT3 mot en høy affinitet variant av STAT3 bindingssetet i c-
fos
promoter (hSIE) [50]. Oligonukleotidet inneholdende det antatte bindingssetet i posisjon -558 i forhold til transkripsjons-initierings-setet ble identifisert som å være i stand til å konkurrere mest effektivt med hSIE probe (fig. 2A, spor 9). Videre ble det undersøkt muligheten av økende mengder av ikke-radioaktive NDN /-558 oligonukleotid til å konkurrere med radioaktivt merket hSIE probe for binding av aktiverte STAT3. Som vist i figur 2B, et høyt molart overskudd av umerket NDN /-558 er i stand til å konkurrere med
32P-hSIE for STAT3 binding.
A. Konkurranse EMSA. Oligonukleotider for sanse og antisense tråder av alle mulige Stat3-bindingsseter i Necdin promoter ble glødet og brukes til å konkurrere om STAT3 binding med
32P-merket hSIE oligonukleotid bruker 5 ug kjerneekstrakt fra Balb /c-3T3 celler stabilt transfektert med v-Src som en kilde for aktivert STAT3. En kandidat STAT3 DNA-bindingssetet på mus Necdin promoteren ble identifisert (posisjon -558 i forhold til initieringssetet for translasjon). Den høye affinitet STAT3 bindende oligonukleotid, ble hSIE anvendt som positiv kontroll. * «, Supershifting» ble oppnådd ved anvendelse av anti-STAT3 antistoff tilsatt til reaksjonsblandingen for å bekrefte tilstedeværelse av STAT3 i komplekset. B. Konkurranse EMSA. 3T3 v-Src kjerneekstrakt ble inkubert med enten
32P-merket dobbelttrådet hSIE oligonukleotid (felt 1 og 2) eller med umerket villtype NDN /-558 oligonukleotid i et 10- til 10
3-fold molart overskudd (baner 3-5) før du legger
32P-merket hSIE oligonukleotid, for å konkurrere med hSIE for STAT3 bindende. SS, supershift med anti-STAT3 antistoffer. C. EMSA. 3T3 v-Src kjerneekstrakt ble inkubert med følgende
32P-merkede dobbelt-trådede oligonukleotider: hSIE (kolonnene 1 og 2), NDN /-558 (banene 3 og 4), med og uten anti-STAT3 antistoffer. D. Chromatin immunoprecipitation analysen (chip). Balb /3T3 v-Src-celler som uttrykker konstitutivt aktiv STAT3 ble anvendt for brikken. I korthet, etter tverrbinding histoner til DNA ved hjelp av formaldehyd i 10 minutter, ble cellene samlet og ultralydbehandlet for å skjære DNA til en midlere lengde på 200-1000 bp. En porsjon av dette materiale ble anvendt som en positiv kontroll for PCR (Input). Den gjenværende prøve ble inkubert med enten anti-IgG eller anti-STAT3 antistoff over natten og deretter immunopresipitert ved hjelp av protein A-agarose. Den histon-DNA komplekset var omvendt tverrbundet etter flere vasketrinn, og prøvene ble utsatt for PCR med bestemte primere rundt kandidaten STAT3-bindingssetet i posisjon -558 i NDN promoter.
En dobbeltkjedet
32P-radioaktivt merket DNA-oligonukleotid som tilsvarer den NDN /-558 sekvens identifisert i NDN promoteren ble deretter benyttet i en EMSA for å detektere STAT3 DNA-binding. Den NDN sonde, så vel som den positive kontroll-proben, hSIE, ble inkubert med 5 ug atom ekstrakt fra v-Src 3T3 celler og underkastet innfødt gelelektroforese. Som vist i figur 2C, bindes aktivert STAT3 til høyaffinitets-sekvensen i hSIE oligonukleotid (spor 1), så vel som til den sekvens avledet fra NDN promoter (felt 3). For å bekrefte at STAT3 er inneholdt i den proteinkomplekset bindes til oligonukleotidene, atom ekstraktet ble pre-inkubert med anti-STAT3 antistoff før tilsetning av det radioaktivt merkede probe ( «supershifted» bånd, baner 2 og 4). NDN /-558 viser en svakere STAT3 DNA-bindende aktivitet sammenlignet med kunstig høy affinitet STAT3 bindende element hSIE og tilsetning av anti-STAT3 antistoff delvis blokkerer binding av den radioaktive probe. Dette kan resultere hvis antistoffet gjenkjennelsessetet, og DNA-bindende domene i STAT3 var i umiddelbar nærhet, slik at antistoffet til delvis hindre binding av STAT3 til proben.
Binding av STAT3 til NDN promotoren
in vivo
for å finne ut om STAT3 kunne binde Necdin promoter i intakte celler, ble kromatin immunoutfellingsstudier analyser (chip) utført i 3T3 v-Src celler ved hjelp av et antistoff spesifikt for STAT3. Som vist i figur 2D, PCR ga Necdin promotor-DNA-immunopresipitert med et anti-STAT3 antistoff i området ved -558 antatte STAT3-bindingssete, men ikke på et styringssted på NDN promoteren. Spesifisiteten til denne bindingsinteraksjonen er demonstrert ved mangel på signal genereres når et kontrollantistoff benyttes (anti-kanin-IgG). Disse dataene gir bevis for at STAT3 kan direkte binde Necdin arrangøren i intakte 3T3 v-Src celler.
Siden både EMSA og chip analyser tyder på at STAT3 har evnen til å binde til NDN arrangøren både
i vitro
og
in vivo
, gir dette ytterligere bevis på at kontroll av ekspresjon ved NDN STAT3 skjer gjennom en direkte binding hendelse på promoteren og det genregulering skjer først og fremst på nivået av transkripsjon.
Necdin Expression er undertrykt i human melanomceller
Vi neste undersøkt om nedregulering av Necdin skjedde i humane tumorceller med aktivert STAT3. Ekspresjon av Necdin tidligere er blitt vist å bli undertrykt i melanomceller [51] så vi undersøkt hvorvidt dette var en korrelasjon med STAT3 aktivitet.
STAT3 fosforylering, STAT3 DNA-bindende aktivitet og total STAT3 nivåer har vist seg å økning i A375-melanomceller i en tetthetsavhengig måte i fravær av ligand [52]. A375-celler ble sådd ut på å øke densiteten og tillatt å vokse i 72 timer. Atom ekstrakter ble utarbeidet og analysert av EMSA. Figur 3A viser at DNA-binding av STAT3 øker med celletetthet som forventet. Vi deretter analysert totalt protein ved Western blot for Necdin ekspresjon. Figur 3B viser at ekspresjon av total STAT3 og STAT3 fosforylering er oppregulert i en tetthetsavhengig måte. Omvendt, som STAT3 aktiverings øker, Necdin ekspresjon nedregulert på proteinnivået
A375 celler ble platet ved forskjellige tettheter (figur 3A og 3B.:. 1, 2,5, 5 eller 7,5 x 10
5-celler; figur 3C:. 10 5
og 10
6-celler) i 10 cm plater og dyrket i 72 timer. Nukleære ekstrakter og totalt protein ble oppsamlet. A. EMSA. Nukleære ekstrakter fra A375 celler ble inkubert med STAT3-spesifikk hSIE
32P-merket dobbelttrådet oligonukleotid. B. Western blot. Total proteinekstrakter ble høstet fra A375-celler belagt med forskjellige tettheter og like mengder av totalt protein (100 ug) ble applisert på en 10% SDS-polyakrylamidgel, elektroforese og immunoblottet for Necdin, fosforylert STAT3 (p-STAT3) og total STAT3 proteiner . C. Western blot. A375 celler ble sådd ut i to forskjellige tettheter (10
5 og 10
6 celler) og lov til å følge over natten. Platene sådd ut ved 10
6-celler ble deretter behandlet med enten DMSO eller CPA-7 (20 pmol /l) og alle cellene ble dyrket i ytterligere 48 timer. Totalt protein ble høstet og analysert ved hjelp av Western blot. For densitometry, ble bildene digitalt skannet og optisk tetthet av bandene ble kvantifisert ved hjelp av Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) og normalisert å kontrollere. Forholdet mellom pSTAT3 til total STAT3 ble beregnet for de enkelte baner.
For å bekrefte at undertrykkelsen av Necdin uttrykk er STAT3 avhengig, ble A375 celler belagt med høy tetthet, og lov til å følge over natten før de blir behandlet med enten DMSO eller en STAT3-inhibitor CPA-7 (20 pmol /l) i 24 t [53]. Western blot-analyse viser at når A375-celler blir sådd ut ved lav tetthet (10
5-celler), er Necdin uttrykk høy, mens aktiverte STAT3 nivået er lavt (fig. 3C, kolonne 1). -Celler sådd ut i høy tetthet (10
6-celler), (Fig. 3C, spor 3) viser høyere nivåer av p-STAT3 og redusert ekspresjon av Necdin. Behandling av høy tetthet A375-celler med CPA-7 i 24 timer inhiberes STAT3 aktivering (fig. 3C, kolonne 2), og Necdin nivåene i disse cellene er gjenopprettet til høye nivåer, kan sammenlignes med celler utplatet med lav tetthet.
IL-6 undertrykker Necdin-ekspresjon i humane prostata kreft celler
IL-6 virker som en autokrin vekstfaktor på prostatakreft [54] og har vært knyttet til utviklingen av svulster [55]. IL-6-signalene overføres via JAK-reaksjonsveien fra STAT-reseptorer på celleoverflaten til målgener i kjernen, som omfatter fosforylering og aktivering av STAT3 [56]. Vi har derfor undersøkt om aktivering av STAT3 via IL-6 stimulering førte til undertrykkelse av Necdin uttrykk i prostatakreftcellelinjer DU145 og PC3. Disse cellelinjene havn lave nivåer av konstitutivt aktiv STAT3 [57], [58], som kan bli ytterligere indusert ved stimulering med IL-6. Celler ble serumsultede i 3 timer før behandling med IL-6 (10 nmol /L) i 12 eller 24 timer. Totalt protein ble fremstilt og analysert ved hjelp av Western blot. Figur 4A viser at IL-6 stimulering resulterte i økt STAT3 aktivitet inne i cellene, og viste tilsvarende nedregulering av ekspresjon Necdin på IL-6 stimulering, i begge cellelinjer. Dette bekrefter at IL-6 er i stand til å undertrykke Necdin uttrykk via STAT3 i prostatakreftceller.
A. Western blot. Totalt protein fra DU145 og PC3-celler behandlet med IL-6 (10 nmol /l) i 12 eller 24 timer ble analysert ved hjelp av Western blot. B. Totalt protein ble høstet fra MDA-MB-468, MDA-MB-231 og MCF-7 celler og utsatt for Western blot-analyse. C. MCF-7-celler ble sådd ut og tillatt å holde seg over natten før den ble transient transfektert med kontroll (GFP), pMvSrc eller pRc /CMV-STAT3-C-plasmider ved hjelp av Lipofectamine Plus. Totalt protein ble oppsamlet ved 48 timer etter transfeksjon og utsatt for Western blot-analyse. For densitometry, ble bildene digitalt skannet og optisk tetthet av bandene ble kvantifisert ved hjelp av Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) og normalisert å kontrollere.
Necdin Expression korrelerer med STAT3 aktivitet i Human Breast Cancer celler
Siden EGFR og Src signalveier bidra til STAT3 aktivering i bryst kreft [15], [34], vi evaluert Necdin uttrykk nivåer i humane brystkreftcellelinjer med ulike nivåer av endogen STAT3 aktivitet. Figur 4B viser at p-STAT3 proteinnivåer var høy i MDA-MB-468-celler, noe lavere i MDA-MB-231 og meget lav i MCF-7-celler. Necdin protein uttrykk omvendt korrelert med p-Stat3 nivåer, blir uttrykt på et lavt nivå i MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler, men viste mye høyere uttrykk i MCF-7 celler.
For å teste hypotesen om at konstitutivt aktivert STAT3 har en kausal rolle i å undertrykke Necdin uttrykk i tumorceller, undersøkte vi om forbigående aktivering av STAT3 signale kunne nedregulerer Necdin uttrykk. MCF7-celler som uttrykker høye nivåer av Necdin (figur 4C, spor 1 . 4), men når transient transfektert med v-Src eller STAT3-C i 48 timer blir Necdin protein ekspresjon hemmet. Dette viser at selv en forbigående 2-ganger økning i STAT3 aktivering i disse cellene er tilstrekkelig til å effektivt undertrykke uttrykket av Necdin. (Fig 4C, spor 3 . 6)
Diskusjoner
transkripsjons profilen til en celle som uttrykker konstitutivt aktiv STAT3 er spådd å bli veldig annerledes i forhold til en celle der STAT3 er under streng regulering. Vår første hypotese var at STAT3 fremmer omfattende endringer i globale genuttrykksmønster, inkludert både direkte og indirekte mål. Vi tok en bred tilnærming ved å studere globale genuttrykk endringer ved hjelp av microarray analyse i celler som uttrykker konstitutivt-aktivert STAT3.
