Abstract
Serine proteasehemmere (Serpins) synes å være allestedsnærværende uttrykt i en rekke av arten og spiller viktige roller i dreibare fysiologiske prosesser slik som angiogenese, immunresponser, blodkoagulering og fibronolysis. Av disse ble plateepitelkarsinom antigen 1 (SCCA1), også kjent som en SERPINB3, først identifisert i plateepitelkarsinom vev fra livmorhalsen av kvinner. Imidlertid er det lite kjent om SERPINB3 ekspresjon i humane ovarialcancer (EOC). Derfor, i denne studien undersøkte vi den funksjonelle rollen
SERPINB3
genet i menneskets EOC hjelp kyllinger, det mest aktuelle dyremodell. I 136 kyllinger ble EOC funnet i 10 (7,4%).
SERPINB3
mRNA ble indusert i kreft, men ikke normale eggstokker av kyllinger (P 0,01), og det var rikelig bare i kjertel epitel av kreft eggstokkene av kyllinger. Videre flere microRNAs, spesielt
MIR-101, MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
ble oppdaget å påvirke
SERPINB3
uttrykk via sin 3′-UTR som tyder på at post-transkripsjonsregulerings påvirkninger
SERPINB3
uttrykk i kyllinger. SERPINB3 protein ble lokalisert hovedsakelig til kjertel epitel i kreft eggstokkene av kyllinger, og det var rikelig i kjernen av både kylling og menneske eggstokkreft cellelinjer. I 109 humane pasienter med EOC, 15 (13,8%), 66 (60,6%) og 28 (25,7%) pasienter som viste svak, moderat og sterk ekspresjon av SERPINB3 protein, respektivt. Sterk uttrykk for SERPINB3 protein var en prognostisk faktor for platina motstand (justert OR, odds ratio, 5,94; 95% konfidensintervall, 1.21-29.15), og for dårlig progresjonsfri overlevelse (PFS, justert HR, hazard ratio, 2,07; 95 % KI; konfidensintervall 1,03 til 4,41). Derfor kan SERPINB3 spille en viktig rolle i ovarial karsinogenese og være en ny biomarkør for å forutsi platina motstand og en dårlig prognose for overlevelse av pasienter med EOC
relasjon:. Lim W, Kim HS, Jeong W, SE Ahn Kim J Kim YB, et al. (2012) SERPINB3 i Chicken Modell for eggstokkreft: En prognostisk faktor for Platinum Resistance og overlevelse hos pasienter med ovarialcancer. PLoS ONE 7 (11): e49869. doi: 10,1371 /journal.pone.0049869
Redaktør: Wendong Huang, Beckman Research Institute of City of Hope, USA
mottatt: 16 april 2012; Godkjent: 15 oktober 2012; Publisert: 21.11.2012
Copyright: © 2012 Lim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av World Class University (WCU) program (R31-10056) og ved Basic Science Research program (2010-0013078) gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi, og også av en bevilgning fra Next-Generation BioGreen 21 Program (No. PJ008142) Rural Development Administration, republikken Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er 7
th ledende årsak til kreft dødsfall hos kvinner over hele verden [1], [2]. Den kliniske betydningen har vokst i større grad fordi det ikke finnes relevante symptomer og ingen effektive screening metoder for tidlig påvisning [3], noe som fører til International Federation of gynekolog (FIGO) Stages III-IV sykdom ved diagnosetidspunktet i over 75 % av pasientene med EOC [4]. Selv om tidlig stadium sykdom, vel differensiering, platina følsomhet og optimal cytoreduktiv kirurgi er blitt foreslått som gunstige prognostiske faktorer, men deres verdi i prognosen ikke er markert forbedret [5]. Derfor er tidlig deteksjon av EOC og prediksjon av prognose for pasienten å overleve ved hjelp av spesifikke biomarkører stadig mer anerkjent som en bedre tilnærming for å overvinne disse begrensningene. For dette formål har genetisk manipulerte gnagermodeller blitt utviklet for å belyse etiologi og patogenese av EOC. Men den kunstige arten av de induserte tumorer i mus som begrenser deres kliniske relevans [6], [7], [8]. I mellomtiden er det legging høne vel kjent som den eneste dyr som spontant utvikler svulster fra ovarie flate epitel, og legging høne er et unikt og egnet modell for å utvikle nye biomarkører og anti-kreft medikamenter for pasienter med EOC [6], [7 ], [9].
Serpin peptidase hemmer, klade B, medlem 3 plakater (
SERPINB3
) er et medlem av Serpin super av proteasehemmere involvert i apoptose, immunrespons, blodkoagulering, cellemigrering og invasivitet av celler [10], [11]. Det er også kjent som plateepitelkarsinom antigen 1 (SCCA1) først oppdaget i plateepitelkarsinom livmorhalsen [12]. Hos mennesker blir genet for
SERPINB3
lokalisert på kromosom 18q21.3, og det hemmer papaine lignende lysosomal cysteinproteaser, cathepsin K (CTSK), CTSL og CTSS [10], [13]. Tidligere har vi identifisert
SERPINB3
i høns og funnet ut at den har moderat homologi til sin pattedyr protein orthologue (ca. 36-47%). Avian SERPINB3 er uttrykt i egglederen som respons på østrogen i en vevs- og cellespesifikk måte [14]. Likevel, lite er kjent om uttrykket og prognostisk verdi av
SERPINB3
i enten kyllinger eller mennesker med EOC.
microRNAs (mirnas) er små og ikke-kodende RNA av 18-23 nukleotider i lengde. De regulerer genuttrykk post-transcriptionally og er også i stand til å endre celle skjebne ved å kontrollere oversettelse av målet mRNA i ulike vev og celletyper. Derfor mirnas spille viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert virveldyr vekst, utvikling, differensiering og onkogenese ved å regulere genuttrykket [15], [16], [17]. Det er imidlertid ikke publisert resultatene av miRNA forskning knyttet med SERPINB3 i kyllinger. For å bestemme hvilken rolle SERPINB3 som en roman biomarkør for EOC, sammenlignet vi fordeling og lokalisering av SERPINB3 mellom normale og kreft eggstokkene av verpehøner, og da har vi utført en miRNA mål validering analyse for å undersøke post-transcriptional regulering av
SERPINB3
uttrykk. Etter at sammenlignet vi SERPINB3 uttrykk mellom normale og kreftceller av ovarier fra verpehøner, humane EOC-cellelinjer (OVCAR-3 og SKOV-3), og en human ovarial teratocarcinom cellelinje (PA-1). Til slutt undersøkte vi de diagnostiske og prognostiske verdier av SERPINB3 uttrykk hos pasienter med EOC.
Resultater
Expression og lokalisering av SERPINB3 mRNA og protein i Normal og Cancerous Eggstokkene av verpehøner
Sammenligninger av ekspresjon av
SERPINB3
mRNA mellom normale og kreft eggstokkene til verpehøner med RT-PCR avslørte at det var uttrykt i enn kreft eggstokkene (fig. 1A og 1B). Videre kvantitativ RT-PCR viste at
SERPINB3
mRNA ble indusert bare i kreft eggstokkene (
P
0,01; Fig. 1C). Disse resultatene tyder på at
SERPINB3
er en biomarkør for epitel-avledet eggstokkreft i verpehøner.
RT-PCR-analyse ble utført ved bruk av cDNA maler fra kylling
SERPINB3 Hotell og
GAPDH
-spesifikke primere. [A] Lanes 1 til 4 viser fire forskjellige normale eggstokker og N er negativ kontroll. [B] Lanes 1-10 viser 10 forskjellige kreft eggstokkene. [C] Kvantitativ RT-PCR-analyse ble utført ved bruk av cDNA maler fra normale og kreft eggstokkene av verpehøner (gjennomsnitt ± SEM; P 0,01).
In situ
hybridisering analyse viste at
SERPINB3
mRNA var rikelig i kjertel epitel av kreft eggstokkene av verpehøner (fig. 2A), men var ikke påvises i stroma, blodkar eller immunceller av kreft eggstokkene. I samsvar med disse resultatene, ble SERPINB3 protein oppdaget hovedsakelig i cytoplasma av glandular Epitel i kreftceller, men ikke normale eggstokker av verpehøner (Fig. 2B). Disse resultatene indikerer at SERPINB3 er spesielt uttrykt bare i kjertel epitel av kreft eggstokkene av verpehøner.
[A]
In situ
hybridisering analyser av
SERPINB3
mRNA. Tverrsnitt av normale og kreft eggstokkene fra verpehøner ble hybridisert med sans eller anti-sense kylling
SERPINB3
Crna sonder. [B] Immunohistokjemisk ekspresjon av SERPINB3 protein: For negativ kontroll ble det primære antistoff substituert med renset, ikke-immun mus-IgG. F, hårsekken; GE, kjertel epitel; S, stroma;
Scale bar
representerer 200 mikrometer (de første søyle paneler og forstand) eller 50 mikrometer (det andre søyle paneler).
Post-transcriptional Regulering av microRNAs påvirker SERPINB3
For å undersøke muligheten for at
SERPINB3
uttrykk er regulert på post-transkripsjonsnivået ved mirnas, utførte vi en miRNA mål validering analysen. Analyse av potensielle miRNA bindingssteder innenfor 3′-UTR for
SERPINB3
bruker en miRNA mål prediksjon database (miRDB; https://mirdb.org/miRDB/) viste tre antatte bindingssete for
MIR -101, MIR-1668 Hotell og
MIR-1681 plakater (figur 3A). Derfor fant vi ut om disse tre mirnas påvirket
SERPINB3
uttrykk via sin 3′-UTR. Et fragment av det
SERPINB3
3′-UTR husing bindingsseter for mirnas ble klonet nedstrøms for grønt fluorescerende protein (GFP) leserammen, og dermed skape et fluorescerende reporter for funksjon av 3′-UTR-regionen. I tillegg SERPINB3 3′-UTR mutanter inkludert muterte bindingssteder for
MIR-101
,
MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
ble også generert av punkt mutasjon i for å bekrefte den modulering av EGFP-ekspresjon ved hver miRNA (figur 3B). Etter ko-transfeksjon av eGFP-
SERPINB3
3′-UTR og DsRed-miRNA, intensiteten av GFP uttrykk og prosentandelen av GFP-uttrykkende celler ble analysert ved fluorescens mikroskopi og FACS (figur 3C og 3D). I nærvær av
MIR-101, MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
, intensiteten og prosentandel av GFP-uttrykke celler (44,8% i kontroll vs. 27,5% i
MIR-101
, 24,2% i
MIR-1668
, 14,8% i
MIR-1681
) ble redusert (p 0,01). Men da det var co-transfeksjon av eGFP-
SERPINB3
3′-UTR mutanter, intensiteten og prosentandel av GFP-uttrykke celler ble ikke endret (14,8% i kontroll vs. 16,1% i
MIR -101
, 13,5% i
MIR-1668
, 14,3% i
MIR-1681
) som en kontroll (figur 3D). Disse resultatene tyder på at disse tre mirnas direkte binde til
SERPINB3
transkripsjon og etter transcriptionally regulere
SERPINB3
genuttrykk.
[A] Diagram av
speil 101, MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
bindingsseter i
SERPINB3
3′-UTR. [B] Expression vektorkart for EGFP med
SERPINB3
3′-UTR og mutert
SERPINB3
3′-UTR og Ds-Red med hver miRNA. Villtype (WT) og mutanter av 3′-UTR av
SERPINB3
transkript ble subklonet mellom EGFP-genet og polyA hale for å generere fusjonskonstruksjon av GFP transkriptet følgende miRNA målet 3′ UTR (pcDNA-EGFP-3’UTR) (øvre og midtre panelet) og miRNA uttrykket vektor er designet til å co-express DsRed og hver miRNA (pcDNA-DsRed-miRNA) (nederst panel). [C] Etter co-transfeksjon av pcDNA-EGFP-3’UTR for
SERPINB3
transkripsjon og pcDNA-DsRed-miRNA for
MIR-101, MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
ble fluorescens signaler om GFP og DsRed påvises ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. [D] Graden av inhibering av EGFP ekspresjon fra miRNA modulering ble beregnet ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Solid barer representerer WT av
SERPINB3
3′-UTR og tomme linjer viser mutant av
SERPINB3
3′-UTR for hver miRNA. Feilfelt indikere standard feil av tre eksemplarer analyser. Stjernene angir statistisk signifikante forskjeller mellom WT vs. mutanter (*** P 0,001).
Immunofluorescensanalyse Påvisning av SERPINB3 Protein i kylling og menneskelig eggstokkreft celler
Å sammenligne uttrykk mønstre av SERPINB3 protein mellom kylling og menneske eggstokkreft celler, gjennomførte vi immunfluorescens analyse. SERPINB3 protein sjelden ble detektert i normale celler, men rik på kjernen av eggstokkreft celler av verpehøner (Fig. 4A). Tilsvarende SERPINB3 protein var rikelig i kjernen av tre humane ovarie cancer-cellelinjer, OVCAR-3, SKOV-3 og PA-1-celler (Fig. 4B).
[A] SERPINB3 protein ble påvist i sjelden normale celler, men rik på kjernen av kylling eggstokkreft celler. [B] SERPINB3 protein ble uttrykt i kjernen av human OVCAR-3, SKOV-3 og PA-1-celler. Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Alle bildene ble tatt med 40X objektiv forstørrelse.
SERPINB3 Protein Expression er assosiert med Platinum Resistance og overlevelse hos pasienter med ovarialcancer
Totalt 109 pasienter med en median alder på 52 år (range, 23-82 år) ble inkludert i studien. Blant alle pasienter, 38 (34,9%) var i FIGO stadium I, 20 (18,3%) i trinn II, og 51 (46,8%) i stadium III. Tumor klasse var G1 i 21 (19,3%), G2 i 41 (37,6%) og G3 i 47 pasienter (43,1%). Histologisk ble 62 tumorer (57%) diagnosen serøs karsinom, 17 (15,6%) med mucinous karsinom, 12 (11%) med klar cellecarcinom, 9 (8,3%) med endometrioid karsinom, 4 (3,6%) med udifferensiert karsinom og 3 (2,7%) med endometrioid og klarcellet karsinom, og 2 (1,8%) med serøs og klarcellet karsinom. Optimal cytoreduserende kirurgi ble utført på 65 pasienter (59,6%), mens 44 (40,4%) gjennomgikk suboptimal cytoreduserende kirurgi. Nitti pasienter (82,6%) fikk adjuvant kjemoterapi etter operasjonen, og 84 (93,3%) fikk paclitaxel /carboplatin mens paclitaxel /cisplatin ble administrert til 6 (6,7%) pasienter. Resultater av immunhistokjemi analyse viste at SERPINB3 protein ble detektert hovedsakelig i kjertel epitel som for legging høne modell, og 15 (13,8%), 66 (60,6%) og 28 (25,7%) av pasientene hadde svak, moderat og sterk ekspresjon av SERPINB3 protein in ovarian kjertel epitel, henholdsvis (fig. 5).
(a og a «) Svak, (b og b») moderat og (c og c «) sterk ekspresjon av SERPINB3 protein ble påvist hos kvinner med epitelial eggstokkreft. Det var enten ikke uttrykk for meget svakt uttrykk for SERPINB3 i normale eggstokker, mens SERPINB3 protine var lett synlig i kreft eggstokkene fra kvinner. Den negative kontrollen som ble brukt var mus IgG istedenfor primært antistoff.
Scale bar
representerer 200 mikrometer (de første horisontale paneler og IgG) eller 50 mikrometer (de andre horisontale paneler).
Median tid til oppfølging var 69,2 måneder (range , 2-88 måneder), og 70 pasienter (77,8%) viste platina følsomhet mens 20 (22,2%) viste platina motstand. Sterk uttrykk for SERPINB3 protein var hyppigere hos pasienter med platinamotstands (n = 11, 55%) enn i de med platina følsomhet (n = 17, 24,3%) (
P
= 0,01). Sterk uttrykk for SERPINB3 protein var også en uavhengig prognostisk faktor for platina motstand etter justeringer ved hjelp klinikken-patologiske faktorer (justert OR, odds ratio, 5,94; 95% CI, 1,21 til 29,15) (tabell 1). Sterk uttrykk for SERPINB3 var assosiert med kortere PFS enn svak eller moderat uttrykk (gjennomsnittlig PFS var 25,7 vs. 47,8 måneder;
P
= 0,03) til tross for ingen forskjell i OS (gjennomsnittlig OS, total overlevelse, 49,5 vs . 60,9 måneder;
P
0,05). Videre SERPINB3 var en dårlig prognostisk faktor for PFS (progresjonsfri overlevelse) ved hjelp av multivariat Cox proporsjonal fareanalyse (justert HR, hazard ratio, 2,07; 95% KI; konfidensintervall 1,03 til 4,41, tabell 2), mens det var ingen prognostisk faktor verdi for OS unntatt suboptimal cytoreduksjon (justert HR 6,83, 95% KI, 2,34 til 20,02).
Diskusjoner
legging høne er en velkjent modell for undersøkelse av eggstokkreft kreftutvikling og for utvikling av kreftlegemidler for kvinner på grunn av likheten i spontant oppstår karsinom fra epitelovarialcancer celler [18]. Histologi, metastase og stadier av EOC i verpehøner er lik de hos mennesker som indikerer muligheten for å bruke legge høne modell for undersøkelse av eggstokkkreft [6]. Videre er det flere biomarkører, inkludert CA-125, blir ofte uttrykt og brukes for å påvise tidlig stadium sykdom og overvåking av terapeutisk respons hos kvinner med EOC og de er kryssreaktive med biomarkører for EOC i verpehøner [18], [19].
generelt er en rekke komplekse kjertler arkitekturer vanligvis funnet i forskjellige karsinomer som oppstår i ulike organer som mage, bronkie, gladder, prostata, testikkel og eggstokk på grunn av den allestedsnærværende natur av kjertler. Spesielt i eggstokkene av både luftfarten og pattedyrarter, disse kjertelstrukturer er hovedsakelig i endometrioid-type svulster med flere egenskaper som kjernekraft atypia, cribriform foci og atresi av stromale follikler. I tillegg kjertlene i adenokarsinomer hos kvinner består av et enkelt lag av epitelceller som gjennomgår mitose og skarpe luminal marginer [6]. Våre foreløpige resultater viste også at kjertel arkitektur i primær eggstokk epithelial karsinom av verpehøner er sammensatt av en labyrint av kjertler eller lacelike papillær folding med store plieomorphic kjerner inneholder mitotiske tall som tidligere rapportert [6]. Den nåværende studie for å finne en ny prognostisk biomarkør for pasienter med EOC ved å legge høne modell identifisert høy uttrykk for
SERPINB3
genet i kjertel epitel av kreft eggstokkene sammenlignet med normale eggstokker fra høner. Resultatene tyder på at SERPINB3 kan være forbundet med eggstokkreft karsinogenese via aktivering av transkripsjonsfaktorer eller hemming av apoptose. Våre resultater viser også at
SERPINB3
genuttrykk er post-transcriptionally regulert av flere mirnas kritiske til utviklingen av kylling eggstokkreft kreftutvikling. Videre ble sterkt uttrykk for SERPINB3 protein relatert til platina motstand og kortere progresjonsfri overlevelse hos pasienter med EOC. Disse funnene støtter vårt hypotese at SERPINB3 spiller en rolle i tumorutvikling og spredning fra ovarier epitelceller.
Selv om den funksjonelle rollen til
SERPINB3
genet i EOC biologi er ikke kjent, resultatene av den foreliggende studien viser tydelig at
SERPINB3
er assosiert med kjertel morphogenesis påvirker eggstokkene carcinogenesen både høner og kvinner med EOC. Hos både kvinner og høner, er SERPINB3 uttrykt i kjertel epitel, men det er lite eller ingen SERPINB3 ekspresjon i andre vev og celler, inkludert stromaceller og blodkar i eggstokken. Disse funnene tyder på at SERPINB3 protein kan aktivere transkripsjonsfaktorer eller hemme apoptose fører til utvikling av EOC i verpehøner og kvinner. I tidligere studier, ble SERPINB3 funnet å regulere programmert celledød ved ulike mekanismer i ulike kreftformer og dens overuttrykk var karakteristisk for kreftceller av epitelial opprinnelse. I tillegg demper SERPINB3 apoptose mediert av anti-kreft narkotika for NK-celler og ved å hemme cytokrom c utgivelse fra mitokondriene [20], [21], [22] Videre kjertel morphogenesis forbundet med
SERPINB3
kan bidra til epitelial-mesenchymale overgang, noe som kan deregulere vedheft prosess for å tillate metastaser og øke invasivitet potensialet av tumorceller hos kvinner [23].
Sterk uttrykk for SERPINB3 var også assosiert med platina motstand og kortere PFS hos pasienter med EOC. Mekanismen ansvarlig for utvikling av chemoresistance og en potensiell rolle for SERPINB3 er ikke fastslått i EOC. Ikke desto mindre, dysfunksjonell permeabiliseringen Lysosomers bidrar til utvikling av chemoresistance i eggstokkreft celler [24], og SERPINB3 gir resistens mot medikament-indusert apoptose ved inhibering av lysosomale proteaser katepsinaktivitet i kreftceller [25]. Dermed kan SERPINB3 bidra til platina motstand etter kjemoterapi-indusert lysosomal destabilisering. Selv om sterk ekspresjon av SERPINB3 var assosiert med kortere PFS, er det mulig at platinamotstands forbundet med SERPINB3 fører til kortere PFS. Dette understøttes av en tidligere studie hvor SERPINB3 uttrykk ble funnet å være assosiert med dårlig overlevelse hos pasienter med brystkreft [26].
SERPINB3 eller SCCA1 har blitt undersøkt i ulike typer plateepitelkarsinom [27 ], [28], [29], [30], men det har bare vært foreslått som et prognostisk for brystkreft og lunge adenokarsinom [26], [31]. Så vidt vi vet, resultatene av denne studien er betydelig i å være den første til å etablere sannsynligheten for en funksjonell rolle for SERPINB3 i EOC av verpehøner. Disse resultatene validere legging høne som modell for forskning på menneskelig EOC. Videre resultatene sterkt at SERPINB3 har viktige funksjoner i utviklingen av EOC i verpehøner og at det er en roman biomarkør for å forutsi platina motstand og dårlig PFS hos pasienter med EOC. Vår hypotese at SERPINB3 har en spesiell rolle i utviklingen av menneskets EOC krever videre evaluering i klinisk prospektive studier.
Materialer og metoder
forsøksdyr og Animal Care og Bruk
eksperimentell bruk av kyllinger i denne studien ble godkjent av Institute of Laboratory Animal Resources, Seoul National University. Hvit Livorno (WL) verpehøner ble forvaltet i henhold til vedtatte standarder for drift av universitetet Animal Farm, Seoul National University, Korea. Alle høner hadde fri
ad libitum
tilgang på fôr og vann.
vevsprøver i Chicken Modell
En total 136 verpehøner (88 over 36 måneder og 48 over 24 måneder av alder), som hadde sluttet å legge egg, ble avlivet for biopsi og samling av kreft (n = 10) eggstokkene. Som en kontroll, normal (n = 5) eggstokkene ble oppsamlet fra egg-leggende høner av samme alder. Vi undersøkte kreft stadier i 10 høner med kreft eggstokkene basert på karakteristiske trekk kylling eggstokkreft [6]. Tre høner hadde Stage III EOC som ovarietumorceller hadde spredning til mage-tarmkanalen og leveren overflaten med rikelig ascites i bukhulen. I fem høner, hadde sine svulster spredning til fjerntliggende organer som lever parenchyma, lunge, mage-tarmkanalen og oviduct med rikelig ascites som er en indikasjon på Stage IV EOC. De to andre høner ikke har svulster i andre organer; derfor ble deres ovarietumorer klassifisert som stadium I EOC. Undergrupper av disse prøvene ble fiksert i 4% paraformaldehyde for videre analyser. Etter 24 timer ble løst vev endret til 70% etanol i 24 timer og deretter dehydrert og innebygd i Paraplast-Plus (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Høner med EOC ble klassifisert basert på deres cellulære subtyper og mønstre for cellulær differensiering med henvisning til menneske eggstokkene ondartede krefttyper [6].
RNA Isolation
Totalt cellulært RNA ble isolert fra frosne vev ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens anbefalinger. Mengden og kvaliteten av total RNA ble bestemt av spektrometri og denaturering agarosegelelektroforese, henholdsvis.
Semi-kvantitativ RT-PCR analyse
uttrykk for
SERPINB3
mRNA i normale og cancerøse eggstokkene til høner ble bedømt ved bruk av semikvantitativ RT-PCR, som beskrevet tidligere [32]. Komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert fra total cellulær RNA (2 ug) med tilfeldig heksamer (Invitrogen, Carlsbad, California) og oligo (DT) primere og AccuPower® RT premiks (Bioneer, Daejeon, Korea). CDNA ble fortynnet (1:10) i sterilt vann før bruk i PCR. Etter PCR, ble like mengder av reaksjonsproduktet analysert ved bruk av en 1% agarosegel, og PCR-produkter ble visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging.
Kvantitativ RT-PCR-analyse
genekspresjon nivåer ble målt ved anvendelse av SYBR® Grønn (Sigma, St. Louis, MO, USA) og en StepOnePlus ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). [33]
GAPDH
genet ble samtidig analysert som en kontroll og brukes til normalisering på kontoen for variasjon i lasting. Hver målet genet og
GAPDH
ble analysert i tre eksemplarer. ROX fargestoff (Invitrogen) ble anvendt som en negativ kontroll for fluorescensmålinger. Sekvens-spesifikke produkter ble identifisert ved å generere et smeltekurve hvor den C
T verdi som er representert syklusen nummeret som et fluorescerende signal var statistisk større enn bakgrunnen, og relativ genekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av to
-ΔΔCT metode [34]. For kontrollen, den relative kvantifisering av genekspresjon var normalisert til C
T for styre eggstokk.
in situ hybridisering Analyse
for hybridiseringsprober, PCR-produkter ble samlet og var gel-ekstrahert og deretter klonet inn i pGEM-T vektor (Promega) som tidligere beskrevet [35]. Etter verifikasjon av sekvensene, ble plasmider som inneholder de riktige gensekvenser forsterket med T7- og SP6-spesifikke primere deretter digoxigenin (DIG) -merkede RNA-prober ble transkribert ved hjelp av en DIG RNA merking kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Etter hybridisering og blokkering, ble seksjonene inkubert over natten med sau anti-DIG-antistoff konjugert til alkalisk fosfatase (Roche). Signalet ble visualisert ved eksponering for en oppløsning inneholdende 0,4 mM 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat, 0,4 mM nitro tetrazolium, og 2 mM levamisol (Sigma).
mikroRNA Target Validation Assay
3′-UTR av
SERPINB3
ble klonet og bekreftet ved sekvensering. 3′-UTR ble subklonet mellom EGFP genet og bovint veksthormon (bGH) poly-A hale i pcDNA3eGFP (Clontech, Mountain View, CA) for å generere EGFP-miRNA mål 3′-UTR (pcDNA-EGFP-3 «-UTR) fusjonskonstruksjonene. I tillegg ble mutanter av SERPINB3 3»-UTR for hver miRNA generert ved punktmutasjon, og deretter klonet inn i den samme type plasmider. For den doble fluorescens reporteren analysen, fusjonskonstruksjonene som inneholder DsRed genet og enten
MIR-101
,
MIR-1668 Hotell og
MIR-1681
ble laget for å være co -expressed under kontroll av CMV-promoteren (pcDNA-DsRed-miRNA). Den pcDNA-EGFP-3′-UTR og pcDNA-DsRed-miRNA (4 ug) ble ko-transfektert inn i 293ft celler ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden. Når DsRed-miRNA uttrykkes og binder seg til målstedet på den 3′-UTR nedstrøms av GFP-transkript, avtar grønn fluorescens intensitet på grunn av nedbrytning av GFP-transkript. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble dual fluorescens påvist ved fluorescens mikroskopi og beregnes ved FACSCalibur strømningscytometri (BD Biosciences). For flowcytometri, cellene ble fiksert i 4% paraformaldehyde og analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre stjerners Inc., Ashland, Oregon).
Cell kultur
Totalt fem cellelinjer, inkludert tre human ovarian epitelial cancer og to primære kylling ovarie-celler, ble anvendt i denne studien. Humane ovarie cancer-cellelinjer (OVCAR-3, SKOV-3, og PA-1) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og dyrket i henhold til leverandørens anvisninger. To forskjellige kylling eggstokkreft overflaten epitelceller (normale og kreftceller) ble isolert og dyrket som beskrevet tidligere med noen endringer [36], [37].
immunfluorescens mikroskopi for påvisning av SERPINB3 Aktivering
eggstokkreft celler og normale eggstokk-celler oppnådd fra verpehøner, og tre humane ovarie cancer-cellelinjer, OVCAR-3, SKOV-3 og PA-1, ble undersøkt for SERPINB3 uttrykk mønstre ved immunofluorescens-mikroskopi som beskrevet tidligere. Hver type celle ble sådd ut på Lab-Tek kammer lysbilder (Nalge Nunc International, Rochester, New York). Etter 24 timer ble cellene fiksert med -20 ° C metanol og immunofluorescens-farging ble utført ved anvendelse av et anti-humant SERPINB3 monoklonalt antistoff (katalog nummer: ab55733; Abcam plc, Cambridge, UK). Cellene ble deretter inkubert med Alexa Fluor 488 kanin anti-geite-IgG sekundært antistoff (A21222, Invitrogen). Lysbilder ble overlappet med DAPI før bildene ble tatt med en Zeiss confocal mikroskop LSM710 (Carl Zeiss) utstyrt med et digitalt mikroskop kamera AxioCam og Zen 2009 programvare.
Menneskestudiepopulasjonen
Kliniske data ble hentet fra en database med pasienter med EOC mellom juni 2003 og mars 2009. Godkjennelse av Institutional Review Board of Seoul National University Bundang Hospital ble innhentet på forhånd for denne studien. Kriteriene var som følger for pasientene: de ble diagnostisert med EOC; de ble behandlet med maksimal cytoreduserende kirurgi etterfulgt av adjuvant taxan og platina-basert kjemoterapi hvis indisert; de hadde Eastern Cooperative Oncology Group funksjonsstatus 0-2; og de hadde ingen underliggende sykdom som påvirker overlevelse. _ENREF_4Optimal Cytoreduserende kirurgi ble definert som en resttumor ≤1 cm, mens suboptimal cytoreduktive kirurgi ble definert som en resttumor 1 cm i maksimal diameter. Alle pasienter med unntak av de med lav risiko tidlig stadium sykdommen som FIGO stadium IA eller IB med karakteren 1 eller 2 sykdom fikk adjuvant kjemoterapi ved hjelp av paclitaxel (175 mg /m
2) /karboplatin (AUC 5,0) eller paclitaxel (175 mg /m
2) /cisplatin (75 mg /m
2) i 1-2 uker etter operasjonen, og kjemoterapi ble gjentatt hver 3. uke i 6 sykluser. Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble definert som tiden er gått fra datoen for fullføring av primær adjuvant kjemoterapi til datoen for klinisk bevist forverring. Total overlevelse (OS) ble beregnet fra datoen for iscenesettelse laparotomi til datoen for kreftrelaterte dødsfall eller slutten av studien. Platinamotstands ble definert som respons på platinabasert kjemoterapi med et minimum behandlingsfritt intervall på mindre enn 6 måneder, mens platina følsomhet ble definert som respons på platinabasert kjemoterapi med et minimum behandlingsfritt intervall som er større enn eller lik
