Abstract
Kreft cellemotilitet er et sentralt fenomen som regulerer invasjon og metastasering. Focal vedheft kinase (FAK) spiller en viktig rolle i cellulære heft og metastasering av ulike kreftformer. Forholdet mellom kosttilskudd av kalsium og tykktarmskreft har blitt grundig undersøkt. Imidlertid er effekten av kalsium (Ca
2+) tilskudd på kalpain-FAK-motilitet ikke klart forstått. Vi har søkt å identifisere mekanismen for FAK spalting gjennom Ca
2+ bundet laktat (CaLa), dens nedstrøms signalisering og rolle i motiliteten av humane tarmkreftceller. Vi har funnet at behandling av HCT116 og HT-29 celler med CaLa umiddelbart økte intracellulære Ca
2 + (ICA
2+) nivåer over en lengre tidsperiode. Ca
2+ tilstrømning indusert spaltning av FAK til en N-terminal FAK (FERM domenet) på en doseavhengig måte. Fosforylert FAK (p-FAK) ble også spaltet i dens p-N-terminal FAK. CaLa økt tykktarm kreft celler motilitet. Calpeptin, en kalpain inhibitor, reverseres effekten av CaLa på FAK og pFAK spalting i begge kreftcellelinjer. Den spaltede FAK translocates inn i kjernen og modulerer p53 stabilitet gjennom MDM2-forbundet ubiquitinering. CaLa-indusert Ca
2+ tilstrømningen økte bevegeligheten av tykktarm kreft celler ble formidlet av kalpain aktivitet gjennom FAK og pFAK protein destabilisering. I konklusjonen, disse resultatene tyder på at nøye vurdering kan gis på å bestemme kosttilskudd Ca
2 + tilskudd til pasient under behandling for metastatisk kreft
Citation. Sundaramoorthy P, Sim JJ, Jang YS, Mishra SK, Jeong KY, Mander P, et al. (2015) Modulation av intracellulære kalsiumnivåer av kalsium laktat Påvirker Colon Cancer cellemotilitet gjennom kalsiumavhengig kalpain. PLoS ONE 10 (1): e0116984. doi: 10,1371 /journal.pone.0116984
Academic Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, STORBRITANNIA
mottatt: 31 juli 2014; Godkjent: 17 desember 2014; Publisert: 28 januar 2015
Copyright: © 2015 Sundaramoorthy et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Gachon Institute of Pharmaceutical Sciences Research Fund 2013, Gachon University, Sør-Korea. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis, og står for over 600.000 dødsfall hvert år med økende forekomst. Kreftfremkallende induksjon i tykktarmen skjer gjennom en sekvens av hendelser som fører til metastaser som involverer ulike onkogene proteiner. Fokal adhesjonskinase (FAK) spiller en avgjørende rolle i tykktarmskreft progresjon og er en viktig onkogent protein som er involvert i cellevekst, overlevelse og motilitet [1,2]. Kalpain er en godt bevart cystein protease aktiveres ved økt intracellulær Ca
2 + (ICA
2 +). Det lokaliserer til samlings heft, og potensielt induserer spalting av fokale vedheft proteiner. Relativt, metastatiske svulster inneholde høyere nivåer av kalpain enn ikke-metastatiske svulster. Kalpain-mediert nedbrytning FAK er kritisk for motilitet i humane tarmkreftceller [3]. Det ser ut til at funksjonen av kalpain i celle adhesjon og motilitet begrenser deres evne til å spalte komponenter av brenn komplekser, som igjen kan øke vedheft omsetning og funksjonelt signifikant tumorprogresjon [4,5].
ICA
2 + ion er et viktig signalmolekyl som modulerer en rekke cellulære prosesser i kreft fysiologi, inkludert celle motilitet. ICA
2+ holdes ved en lav konsentrasjon (~ 100 nM) i forhold til det ekstracellulære frie Ca
2 + (1,2 mM) [6,7]. Lave nivåer av cytoplasma Ca
2 + opprettholdes gjennom aktiv utstrømming fra cellene via plasmamembranen Ca
2 + ATPase pumpe, mens sarcoendoplasmic retikulære Ca
2 + ATPase fjerner Ca
2+ av proton exchange . Andre Ca
2 + permeable kanaler som er lagret-opererte kalsiumkanaler, transient receptor potensielle (TRP) kanaler og kalsium utgivelsen aktivert kanal (CRAC) protein 1 er også involvert i Ica
2 + homeostase. Ombygging eller deregulering av ICA
2+ homeostase i kreftceller fører til endringer i kreft progresjon [8]. Kosttilskudd av Ca
2+ var kjent for å redusere risikoen for kolorektal adenom og kreft [9]. Men virkningen av Ca
2+ kosttilskudd forblir ukjent på kreftmetastase.
Normale celler har en lav konsentrasjon av ekstracellulær laktat i området mellom 0,5 og 2 mm, men konsentrasjonen for kreftceller kan være like høy som 30-40 mM [10]. Kreft celle overlevelse krever et alkalisk intracellulære miljø og syrlig ekstracellulære miljø [11,12]. Monokarboksylat transportører (MCT) hovedsakelig kontrollere bevegelsen av intracellulære og ekstracellulære melkesyre [13]. Forhøyede nivåer av MCT1 er påvist i bryst, tykktarm, mage, og livmorhalskreft. MCT4 uttrykket er sterkt forhøyet hos nyrekreft, livmorhals og prostata kreft [14]. MCT4 utgivelser laktat som svar på hypoksi, mens laktat opptak i oksygenkreftceller oppstår via MCT1 [15,16]. Laktat fungerer som et substrat for oksidativ metabolisme i oksygenkreftceller.
Basert på informasjonen på Ca
2 + kosttilskudd i metastatisk kreft, undersøkte vi bevegelighet av tykktarmskreftceller ved direkte eksponering av Ca
2+ bundet laktat (CaLa). Vi fokuserte på kalpain-FAK-celle veien for å forstå underliggende molekylære mekanismene for menneskelig tykktarmskreft cellemotilitet.
Materialer og metoder
cellekulturer
Alle cellelinjene var kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassa, Va). Human kolonkreft cellelinjer HCT116, HT-29, og DLD1were dyrket i RPMI1640 medium. Normal tykktarm cellelinje CCD-18Co ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin i en fuktig atmosfære ved 37 ° C inneholdende 5% CO
2.
Reagenser og antistoffer
Cala, FAK inhibitor (TAE226), kalpain inhibitor (Calpeptin), influensa-3AM ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Mo). Primære antistoffer som brukes for western blot analyse (FAK, pFAK, kalpain-2, p53, MDM2, pMDM2, α-tubulin, Lamin B, GADPH) og de tilsvarende sekundære antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (USA).
termodynamikk toverdige metallioner binding til melkesyre
for å måle bindings isotermer for interaksjon av den toverdige metallioner Ca
2+ til melkesyre, ble isotermisk titrering kalorimetri (ITC) eksperimenter utført ved hjelp av en Microcal 200 isotermisk titrering microcalorimeter (Microcal, Inc., Northampton, MA). Datainnsamling, analyse og plotting ble utført ved hjelp av Windows-baserte programvarepakke Origin (versjon 7.0, levert av Microcal). Den titrerende microcalorimeter inneholdt prøven og referanseceller holdt i en adiabatisk kabinett. Referansecellen ble fylt med destillert vann. Typiske titreringer involvert injisering av 1,5 ul 5 mM Ca
2 + ion (ved hjelp av en datamaskin-styrt injektor) inn i prøvecellen (fylt med 0,5 mM av melkesyre på pH-verdi 7,0). Prøvene ble injisert ved to-minutters intervaller for å sikre at titreringskurver hadde vendt tilbake til basislinjen før den neste injeksjon. Sprøyten rørehastigheten ble satt til 1000 rpm. Absorpsjon eller frigjøring av varme under hver injeksjon ble målt ved hjelp av kalori. Titrering isotermer for forpliktende samhandling omfattet differensial varme strømmer for de ulike injeksjoner. Disse verdier ble deretter integreres for å bestemme den entalpiendring forbundet med hver injeksjon. Varme endringer forårsaket ved injeksjon av hvert metallion i destillert vann var ubetydelig. Utvannings data ble trukket fra data og dårlig datapunkter ble fjernet. Dataene montering ble utført ved hjelp av Origin (versjon 7.0) og tilpasningsprosessen ble titrert til den beste passform bestemmes av chi-square minimering metoden ble oppnådd. Montering av bindings isotermer på denne måten gitt data om bindingskonstant (Ka), endring i entalpi (AH) og støkiometri av binding (n). Bindingen Gibbs fri energi (ΔG) ble beregnet fra entalpiendring (AH) og bindingskonstant (Ka) ved hjelp av ligningen: = ΔG RTlnKa = ΔHTΔS, hvor R er gasskonstanten og T er den absolutte temperatur i grader Kelvin [17]. I mellomtiden ble det støkiometri s (n) av de ulike interaksjoner bestemmes ut fra ett sett med sider modeller.
Måling av ICA
2+ konsentrasjon
cytosolic gratis Ca
2+ ion-konsentrasjoner ble målt ved hjelp av en Confocal Laser-Scanning Microscope (Leica, Heidelberg, Tyskland). Cultured HCT116 og HT-29 celler ble lastet med 10 uM Fluo-3 /AM og 1 ul 25% Pluronic F-127 (oppløst i DMSO) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Når du har lagt fluorescens prober ble 2,5 mM Cala lagt og bildet ble kjøpt. Fluo-3 /AM var spent på 488 nm og slippes fluorescens ble målt ved 515 nm. Intracellulær Ca
2 + nivåer er uttrykt som F /F0 forholdstall, der F0 er den innledende fluorescens intensitet (Bilde J programvare analyse).
sårtilheling analysen
For sårheling analysen, ibidi kultur innsatsen består av to reservoarer adskilt av en 500 um tykk vegg, ble anvendt. Celler ble sådd ut i to-kammer (100 pl 4 x 10
5 celler /ml) ibidi kulturinnsats. Etter 24 timers inkubering, ble kammeret fjernet forsiktig å skape et gap på ~ 500 mikrometer. Cellene ble deretter tillatt å migrere inn i de blottet områdene i 6 timer. Det levende celle bildebehandling ble gjort ved hjelp av juli Br, Live celle analysator (NanoEnTek Inc, Sør-Korea).
Western blot analyse
Cellular lysatene ble utarbeidet og en lik mengde protein ble separert ved SDS PAGE og blottet på å polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner som beskrevet tidligere [18,19,20]. Spesifikke primære antistoffer, etterfulgt av HRP-konjugert sekundært antistoff ble anvendt for å påvise spesifikke proteiner ved bruk av ECL-system (AbClon) for signaldeteksjon.
Immunofluorescence Analysis
HCT116 og HT-29 celler ble behandlet med CaLa for 12 timer. Celler ble fiksert i 100% kald etanol i 20-30 min ved -20 ° C, permeabilisert med 0,3% Triton x100 i PBS i 15 minutter ved romtemperatur, og vasket i serie i PBS. Celler ble blokkert med 3% hesteserum i PBS i 1 time ved romtemperatur og vasket med PBS. Cellene ble deretter inkubert med FAK-antistoff (1: 800) med 3% hesteserum i PBS ved 4 ° C over natten. Cellene ble vasket med PBS og deretter inkubert med Alexa 488-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Celler ble deretter forseglet med monterings medier som inneholder DAPI (Vectashield, Vector Laboratories). Bilder ble tatt med konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM, Nikon A1 +, Japan).
Statistiske analyser
Alle dataene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av t-test og
P
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Melkesyre binder seg til kalsiumioner med høy affinitet
Vi har analysert de termodynamiske egenskapene til CaLa og forpliktende samspill mellom Ca
2+ og melkesyre ved isotermisk titrering kalorimetri (ITC). Representative ITC data relatert til bindingen av melkesyre til Ca
2 + ved pH 7,0 er vist i fig. 1. Ytterligere detaljer, inkludert de beregnede foreningen konstanter og entalpi og entropi av foreninger er oppført i Tabell 1. Resultatene viser at melkesyre binder seg til Ca
2+ med K
d 6,2 × 10
-5 M, en termodynamisk passende tilstand for å danne CaLa salt. Våre termodynamiske beregninger viste at en laktat molekyl binder seg til 0,361 Ca
2 + ioner, selv om to-laktat molekyl binder seg til en Ca
2 + ioner i teorien. ITC-data demonstrerer muligheten for at ekstracellulære melkesyre i form av laktat kan danne CaLa salt, som kan foreligge som en løselig form i henhold til den vandige løselighetsgrensen konsentrasjon (7,9 g /100 ml). Disse data antyder også at CaLa kan brukes til å administrere intracellulært kalsium, noe som kan dissosiere under varierende miljø.
Tre representative isotermer er vist illustrerer binding som en funksjon av pH ved 37 ° C. Øvre og nedre felter viser resultatene av kalorimetrisk titrering av 1,5 pl 5 mM Ca
2 + og 0,5 mM melkesyre blanding i 5 mM Tris-HCl ved pH 7,0. For hver titrering, er rådata vises i øvre panel og integrerte varme data er vist i nedre panel.
CaLa administrasjon økte ICA
2 + nivåer
Vi vurderte effekten av CaLa administrasjon på tykktarm kreft celler og analysert nivåene av dissosiert Ica
2+. HCT116 og HT-29 celler ble behandlet med 2,5 mM CaLa som viste en bemerkelsesverdig forskjell på 0 og 600 sekunder i begge cellelinjer. Den eksperimentelle validering ble gjort ved hjelp av ionomycin, en ionofor brukes til å heve ICA
2 + nivåer. Ionomycin (10 mm) drastisk økt ICA
2 + i de første sekundene, etterfulgt av en gradvis redusert i begge cellelinjene (fig. 2). Selv om ionomycin hevet ICA
2+ nivåer, disse resultatene tyder på at ionomycin er ikke stabil i tykktarmskreftcellelinjer. Men i HCT116 cellene, Cala gradvis økt ICA
2 + til sitt maksimale nivå på 480 sekunder og deretter flatet (Fig. 2A). HT-29 celler nådd maksimalt ICA
2+ konsentrasjon mellom 50 og 100 sekunder, og deretter plateaued (Fig. 2B). Disse resultatene antydet at CaLa økt ICA
2 + nivåer og vedlikeholdt disse nivåene for en lengre periode.
Cultured HCT116 (A) og HT-29 (B) celler ble behandlet med Fluo-3 AM fluorescens prober som beskrevet i materiale og metoder. Celler ble deretter inkubert med 2,5 mM CaLa og 10 uM Ionomycin i DMSO (kontroll). Bildet ble kjøpt til tidspunkt på 0 sekunder som innledende og 600 sekunder som maksimal hjelp Confocal Laser-Scanning Microscope (Leica, Heidelberg, Tyskland). Ca
2 + fluorescens bildet ble omgjort til fluorescens intensitet og plottet som indikert F /F0 (Bilde J programvare analyse). F0 er den første fluorescens intensitet.
CaLa modulert FAK stabilitet
Nyere studier indikerer at overekspresjon av onkogen FAK er assosiert med kreftutvikling av ulike humane kreftceller [21,22]. ICA
2 + aktiverer kalpain, noe som forringer FAK og forbedrer bevegeligheten av kreftceller [3,4,5,9]. Etter å ha observert at CaLa øker ICA
2 + nivåer i tykktarmskreftcellelinjer, undersøkte vi effekten av CaLa på FAK-stabiliteten i disse cellene. Vi undersøkte uttrykk for FAK og pFAK i normal kolon (CCD-18Co) og tykktarmskreft cellelinjer (Fig. 3A). Resultatene viste at CCD-18Co-celler har nominell ekspresjon av FAK og således lavere nivåer av pFAK i forhold til tykktarmskreftcellelinjer som uttrykker høye nivåer av FAK og pFAK. Hver tykktarmskreft cellelinje viste forskjellige uttrykk nivåer av FAK og pFAK. CCD-18Co celler viste et normalt nivå av pFAK. HT-29 og DLD-1 celler viste høyere pFAK i forhold til HCT116. Derfor fokuserte vi på HCT116 og HT-29 cellelinjer for videre studier knyttet til FAK protein stabilitet. I tillegg, utførte vi en doseavhengig analyse for effekten av CaLa på HCT116 og HT-29-celler (fig. 3B). Cellene ble behandlet med forskjellig konsentrasjon av CaLa for 12 timer og FAK cleavage ble vurdert. Den fulle lengde av FAK og pFAK er et 125 kDa. CaLa spaltet FAK til et 90 kDa-protein N-FAK (FERM domene) med økende konsentrasjoner som har den høyeste aktivitet ved 2,5 mM. Tilsvarende pFAK ble spaltet i dens p-N-FAK i en doseavhengig måte med optimal aktivitet ved 2,5 mM CaLa (Fig. 3B). Disse resultatene indikerer at CaLa destabiliserer FAK og pFAK og forårsaker spalting av begge proteiner i tykktarmskreftceller.
(A) FAK uttrykk ble analysert i normal tykktarm epitelisk cellelinje CCD-18Co og forskjellige tykktarmskreft cellelinjer ( HCT116, HT-29 og DLD1). HCT116 og HT-29 (B) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CaLa i 12 timer. Western blotting utføres fra cellelysatene viste at CaLa indusert FAK og pFAK cleavage på en doseavhengig måte.
FAK destabilisering gjennom CAPLAIN aktivitet ved Cala
Nyere studier indikerer at FAK og dens fosforylert skjema er viktig for fokale vedheft omsetning. FAK spaltes av kalpain, en Ca
2 + avhengig protease, som spiller en avgjørende rolle i fokale vedheft dynamikken i bevegelige celler [4]. Kalpain er involvert i flere viktige aspekter ved kreft celle adhesjon, migrering og metastasering [23]. Siden CaLa økt Ca
2 + strøm og kløyvde FAK, så vi bestemt virkningene av CaLa på kalpain i HCT116 og HT-29 celler (Fig. 4). Resultatene viser at CaLa forårsaket tidsavhengig spaltning av FAK og pFAK proteiner, men det var ingen effekt på nivåer på kalpain-2 i begge cellelinjer. For å bekrefte resultatene, brukte vi calpeptin, en rho kinase aktivator og hemmer kalpain som er en del av en familie av kalsiumavhengige cystein proteaser. Calpeptin (20 mm) snudd effektene av CaLa på FAK og pFAK spalting i begge cellelinjene uten effekter på kalpain-2 protein nivåer (Fig. 4). Disse dataene antyder at CaLa økt Ca
2 + tilstrømningen og kalpain aktivitet, men ikke dens protein nivåer. Det er kjent at spaltede FAK medierer degradering av p53 ved nukleær translokasjon av N-FAK. Celler ble behandlet med CaLa viste redusert nivå av p53, som ble reversert ved calpeptin. Calpeptin hemmet kalpain-2, hindrer den fra å spalte FAK, demping av p53 degradering. Disse resultatene fastslo at CaLa-indusert FAK spaltning forbedret p53-degradering og kalpain-2-aktivitet, men uten virkning på kalpain-proteinnivåer.
HCT116 og HT-29 celler ble behandlet med 2,5 mM CaLa i kombinasjon med kalpain inhibitor ( calpetin 20 uM) i den angitte tidsavhengig måte. Western blot data viser at kalpain inhibitor, calpeptin, redusert FAK og pFAK cleavage samt p53 degradering.
Spaltet FAK translocates i kjernen
Undersøkelser viste at translokasjon av atom FAK forfremmet celleoverlevelse gjennom økt p53 degradering under forhold med cellulært stress [24,25]. CaLa indusert spaltning av FAK inn i et 90-kDa-proteinet, som ble translokert til kjernen. Fig. 5 representerer den western blot analyse fra hel, cytoplasmatisk, og atom fraksjoner av celler behandlet med CaLa, og deres immunocytochemistry. Hele cellelysat og cytoplasmiske fraksjon av begge cellelinjene som ble behandlet med CaLa viste FAK og spaltet FAK. Kjernefysiske fraksjoner av ubehandlede celler hadde lave nivåer av FAK men behandling med CaLa øket FAK og spaltet FAK-nivåer i atom fraksjoner (fig. 5A). De nukleære trans N-FAK i HCT116 og HT-29 (fig. 5 B og C) ble visualisert etter inkubasjon med anti-FAK primært antistoff, etterfulgt av farging med Alexa 488-konjugert sekundært antistoff. Den konfokal mikroskopi av kontrollceller viste DAPI farget kjerner uten Alexa-488-farget FAK. Men confocal avbildning av CaLa-behandlede celler viste translokasjon av Alexa-488 farget N-FAK inn DAPI farget kjerner. Disse resultatene indikerer klart at 2,5 mM CaLa spaltes i full lengde FAK at translokert til kjernen.
translokasjon av N-FAK ble analysert ved hjelp av western blot (A) og immunocytokjemi (B-C). HCT116 og HT-29-celler ble frø i et 8-brønners kammer og behandlet med 2,5 mM CaLa i 12 timer. Trans ble analysert ved konfokal mikroskopi. VI, helcelle utvinning; CE, cytoplasma utvinning; NE, kjernekraft utvinning; translocated N-FAK er angitt med en pil. Skala:. 2,5 mikrometer
CaLa økt bevegelighet av tykktarm kreft celler
Siden FAK er kjent for å spille en avgjørende rolle i adhesjon, migrasjon, spredning og differensiering i kreftceller [ ,,,0],1,2] studerte vi effekten av CaLa på disse cellulære eiendommer i tykktarm kreft celler. Vi utførte sårheling assay i HCT116-celler behandlet med CaLa alene eller i kombinasjon med calpeptin (fig. 6). Resultatene viser at CaLa (2,5 mM) økte motiliteten i HCT116-celler. Calpeptin alene synes ikke å endre motilitet. Interessant nok var det vist at anvendelse av calpeptin (20 uM) i kombinasjon med CaLa redusert effekt av CaLa og inhiberte cellevandring (Fig. 6 A-B). Videre observerte vi at TAE226 (FAK-hemmer) betydelig redusert cellen motilitet. Disse resultatene tyder på at Ca
2 + tilstrømningen formidler FAK nedbrytning gjennom kalpain aktivitet. TAE226 viste antitumoreffekter i tykktarmskreftceller. Den reduserte størrelse av spres tumorer og forlenget overlevelse i tumorbærende mus [26]. For å bekrefte våre observasjoner, utførte vi en komparativ analyse av FAK og pFAK nivåer i HCT116 og HT-29 ved bruk av TAE226 (Fig. 6C). TAE226 (2,5 mm) hemmet pFAK uttrykk i en tidsavhengig måte hemmet ikke total FAK. CaLa-indusert FAK og pFAK cleavage økt bevegelighet i forhold til TAE226, som undertrykkes pFAK aktivitet og redusert kreftcelle motilitet.
Sårtilheling analysen ble utført i HCT116 cellene. Celler ble behandlet med CaLa, og sårheling egenskap ble analysert fra 0 til 6 timer etter sår (A), og gjennomsnittsverdier for viklet området ble analysert ved hjelp av flere linjer graf (B). HCT116 og HT-29 celler ble behandlet med 2,5 mM av CaLa i tidsavhengig måte induserte FAK og pFAK spaltning (C). pFAK inhibitor (TAE226 2,5 mm) redusert pFAK nivåer som oppdages av western blot.
kløyvet-FAK mediert p53 degradering gjennom MDM2 avhengig ubiquitinering
Tidligere studier indikerer at strukturen av FERM -FAK kan translocate til kjernen og modulere p53 protein stabilitet gjennom MDM2 [25]. Derfor, undersøkte vi mekanismen for p53 nedregulering av CaLa. CaLa alene indusert spalting av FAK og pFAK. Behandling av MG132 med CaLa paradoksalt utvinnes FAK og pFAK cleavage (Fig. 7). Behandling av celler med CaLa hemmet p53-nivåer samtidig MG132 utvinnes nivåene av p53. Behandling av MG132 i kombinasjon med CaLa gjenvunnet effekten av CaLa på p53 proteosomal degradering. I tillegg observerte vi at MDM2 og PMDM2 proteinnivåer ikke ble endret etter behandlinger med CaLa, MG132 eller begge deler. Dermed disse resultatene tyder på at MG132 utvinnes p53 fra CaLa gjennom MDM2-assosiert ubiquitinering.
HCT116 og HT-29 celler ble behandlet med 2,5 mM CaLa i kombinasjon med en inhibitor proteasomal (MG132 10 uM) i 10 timer. Western blot ble utført fra cellelysatene og proteiner ble detektert som beskrevet i metodene.
Diskusjoner
Denne studien viser at kalsium laktat-indusert Ca
2+ tilstrømningen øker bevegeligheten av tykktarmskreft celler gjennom destabilisering av FAK og pFAK proteiner. Denne studien viser effekten av ICA
2+ på kalpain-FAK-cellemotilitet veien. CaLa-mediert spalting av FAK og pFAK ble voldgift gjennom kalpain aktivitet, noe som økte bevegeligheten av tykktarmskreftceller. Den spaltede FAK translokert til kjernen og økt p53-degradering samt kalpain aktivitet. Virkningen av ekstracellulære laktat ble rapportert i flere studier om motiliteten av kreftceller. En stor forskjell mellom denne studien og tidligere studier på laktat er kjemisk enhet.
monokarboksylat transportører (MCT) vanligvis formidler laktat tilstrømning og utstrømning og at forhøyede nivåer av MCT1 er påvist i mange kreftformer, inkludert tykktarmskreft [16]. Laktat utgivelse i hypoksiske celler er mediert gjennom MCT4, mens laktat opptak i oksygentumorceller medieres via MCT1 [15,16]. Det ser ut til at CaLa selv blir transportert inn i cytoplasma, og dermed øker Ica
2 + og laktatkonsentrasjon sammentreffet observert. Imidlertid er den spesifikke transportmekanismen ikke identifisert. De foreliggende resultatene viste at lav konsentrasjon av CaLa mediert FAK-avhengige bevegelighet i tykktarm kreft celler. Tidligere studier indikerte at natriumlaktat ble anvendt i konsentrasjoner så høye som 20 mM [10]. Denne høye serien ble observert i ondartede og metastatiske svulster i store størrelser. Høye konsentrasjoner av laktat i tumorer ble korrelert med en høy forekomst av fjern metastase og andre maligne atferd av kreftceller [27]. Derfor brukte vi lave konsentrasjoner av laktat for å unngå kreft metastasering. Ved å behandle cellene med lave konsentrasjoner av CaLa, Ca
2+ innstrømning økes og opprettholdes i et lengre tidsrom, noe som økte kalpain aktivitet. Den intracellulære tiol protease kalpain katalyserer begrenset proteolyse av forskjellige fokal adhesjon strukturelle proteiner og signal enzymer i adherente celler. Calpainer er involvert i flere viktige aspekter ved migrasjon, inkludert heft og spredning. Farmakologisk hemming av calpainer redusert integrin-mediert celle migrasjon [23]. Nyere studier gir ytterligere støtte for calpain som en viktig modulator av cellemotilitet gjennom sin evne til å regulere fokal adhesjon dynamikk. Kalpain-mediert nedbrytning FAK er kritisk for motilitet i humane tarmkreftceller [3]. Høye nivåer av FAK-ekspresjon har blitt assosiert med øket invasivitet i maligne svulster. Men mekanismene for FAK aktivering, cleavage, og deregulering av bevegelighet, er ikke klart. Signaleringshendelser nedstrøms av FAK aktivering og spaltning kan bidra til motiliteten av humane tykktarm carcinoma-celler.
CaLa kan modulere den vandrende potensialet av oksygenerte tumorceller, som eksisterer rundt tumorkarene. I tumorvev, ble vaskulariteten begrenset til å levere oksygen og næringsstoffer slik som glukose og glutamin. Hypoksiske svulster å være dårlig differensiert men hypoksi spiller en direkte rolle i opprettholdelsen av kreft stamceller [29]. Hypoksiske tumorer har en tendens til å produsere en laktat-gradient, som brukes av oksygenerte tumorceller gjennom MCT1 mediert transport, slik at de hypoksiske tumorceller kan utnytte glukose. Dette fenomenet er kjent som inter laktat shuttle. Følgelig kan det antas at det i det ekstracellulære miljøet rundt hypoksiske celler gradvis akkumuleres laktat i sin frie form. Imidlertid oksygenerte celler ble levert av calcium ved blodtilførselen, ble laktat importert via MCT1, senke den ekstracellulære laktatkonsentrasjonen og dens mikromiljøet inneholder mindre laktat og for det meste bundet til kalsium [31]. Våre resultater antyder at oksygen cellene er mindre bevegelige sammenlignet med hypoksiske celler og at metastase innebærer hypoksiske celler i stedet for oksygen celler. Eksistensen og mengden av CaLa i et ekstracellulært svulstens mikromiljø kan være en avgjørende faktor for metastasering gjennom modulering av FAK. I tillegg kan CaLa muligens styre cellemotilitet og energiomsetning. Svulsten suppressor protein p53 forebygger kreft progresjon gjennom en rekke mekanismer, inkludert apoptose og cellesyklus arrest. Et godt karakterisert sammenheng mellom metabolisme og genetisk regulering av p53, hvor p53 regulerer cellenes energibalanse mellom glykolyse og oksidativ fosforylering [30,31]. Tilsvarende viser våre resultater at CaLa kan forårsake proteosomal degradering av p53 (Fig. 4) gjennom kjernefysisk translokasjon av FERM-FAK og MDM2-mediert ubiquitinering (Fig. 7).
Den aktuelle studien undersøkte effekten av supplerende Ca
2+ på de molekylære mekanismene for metastatisk kreft i tykktarmen. Betydningen av CaLa i modulering av tykktarmskreft cellefysiologi er ikke begrenset til grunnleggende studier, men har også en innvirkning på klinisk ernæringsmessige utfall. Ca
2 + spiller ulike roller i kreft progresjon, inkludert økt apoptose eller hemme spredning i tykktarmen. Videre Ca
2+ binding til gallesalter, økte i høyt fettinntak, har vært assosiert med tykktarmkreft [28]. CaLa-indusert FAK cleavage og forbedret cellemotilitet av HCT116 cellene skaper en antakelse om at metastaserende tykktarmskreftpasienter trenger mer forsiktig når de vurderer Ca
2 + kosttilskudd. Fordi ekstracellulært kalsium kan ionisert med laktat, fører det til Ca
2 + tilstrømning forårsaker økt FAK cleavage og kreft cellemotilitet.
Konklusjoner
Denne studien belyser at CaLa økt bevegelighet av tykktarmskreftceller av kalpain aktivitet gjennom destabilizations av FAK og pFAK proteiner. Konsentrasjonen og kjemisk enhet av CaLa kan være medvirkende faktor for tykktarmskreft cellemotilitet. Derfor våre resultater tyder på at motilitet effekter på colon cancer kan være knyttet til bruk av Ca
2+ kosttilskudd. Selv en lav konsentrasjon av Ca
2+ kan føre til økt celle motilitet.
