Abstract
I tidligere arbeid, viste vi at transkripsjonsfaktor Trim28 (Tripartite motiv innehold 28) spiller en tumor-suppressor rolle tidlig i trinns adenocarcinom i lungene på grunn av sin evne til å hemme transkripsjon av cellesyklus regulerende gener. Heri vi undersøke Trim28 rolle i epitel-til-mesenchymale overgang (EMT), som er sterkt implisert i kreft metastasering. Vi fant at Trim28 spiller en rolle i TGF-β-indusert EMT i ikke-småcellet lungecancerceller. Dempe Trim28 med hemmende RNA endrer uttrykk for mange EMT markører, for eksempel E-cadherin og N-cadherin, mens overekspresjon av Trim28 har en motsatt effekt. Trim28 ekspresjon indusert etter TGF-β behandling på både protein og mRNA-nivåer. Trim28 mangel svekker TGF-β-indusert EMT og reduserer cellemigrering og invasjon. Til slutt viser vi at uttrykket av Trim28 påvirker acetylering og metylering av histoner på E-cadherin og N-cadherin arrangører. Disse resultatene tyder på at Trim28 bidrar til EMT og kan være viktig for tumormetastase i lungekreft. Tatt sammen med vår tidligere arbeid disse resultatene tyder på en modell der Trim28 er en tumor suppressor tidlig i transformasjonsprosessen i lungekreft, men i senere stadier fungerer den som et onkogen
Citation. Chen L, Muñoz- Antonia T, Cress WD (2014) Trim28 Bidrar til EMT via Regulering av E-cadherin og N-cadherin i Lung Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (7): e101040. doi: 10,1371 /journal.pone.0101040
Redaktør: Olivier de Wever, Ghent University, Belgia
mottatt: 11. desember 2013, Godkjent: 03.06.2014; Publisert: 01.07.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Cancer Institute (CA119997 og CA163068) og Moffitt kreftsenter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) er karakterisert ved tap av celle-celle adhesjon og polaritet, nedregulering av epiteliale markører, og oppkjøpet av mesenchymale markører og fenotype [1]. Samle bevis fra undersøkelser på EMT har involvert mange signalveier, inkludert TGF-β, Notch, Wnt, EGF og FGF [2]. Blant disse induserer TGF-β EMT effektivt i en rekke modellcellelinjer og
in vivo product: [3]. I likhet med mange andre biologiske prosesser, er emt til slutt regulert transkripsjonelt ved et antall transkripsjonsfaktorer slik som Snail1, Snail2, ZEB1 og ZEB2 [4]. I tillegg har epigenetiske modifikatorer også vist seg å spille en rolle i reguleringen av EMT. For eksempler, induserer histondeacetylase SIRT1 EMT gjennom transkripsjonsfaktor ZEB1 mens histon metyltransferase SUV39H1 og G9a undertrykke E-cadherin uttrykk og indusere EMT i en snegle avhengig måte [5], [6], [7].
Trim28 er medlem av en evolutionally konservert familie av transkripsjons co-faktorer som har ulike funksjoner [8]; inkludert regulering av celleproliferasjon, DNA-reparasjon, differensiering og pluripotency [9], [10], [11], [12]. Trim28 er spesielt implisert i aktivering av EMT i fibroblaster [13] og cervikale kreftceller [14]. Avhengig av kontekst, kan Trim28 enten aktivere eller undertrykke transkripsjon gjennom forskjellige mekanismer [15], [16], [17], [18]. Trim28-mediert genet Slå har vist seg å innebære en forbindelse med histon metyltransferase SETDB1, histon deacetylase kompleks Nurd og rekruttering til promotorområdene via sekvensspesifikke transkripsjonsfaktorer [19], [20]. Dette komplekset undertrykker målgenet transkripsjon ved å endre histonmodifikasjonene på promotorer [8]. Når fosforylert på S824 har Trim28 vist seg å assosiere med transkripsjonsfaktor Oct3 /4 og aktivere Oct3 /4 målgener transkripsjon [12]. En annen mekanisme for Trim28-formidlet transkripsjonsaktivering er via rekrutteringen til bestemte responselementer, slik som glukokortikoid-responsive element (GRE), og Nur responselement (Nure), ved NGFI-B og C /EBPβ [17] hhv [18]. Nylige studier har antydet at Trim28 kan spille en rolle i kreftutvikling og metastasering [13], [14]. Spesielt er Trim28 uttrykk oppregulert i kreftvevet sammenlignet med normalt vev [9], [21], [22], [23]. I et søk etter brystkreft metastaseassosierte proteiner, ble Trim28 identifisert som en av 197 proteiner med forhøyet uttrykk med metastatisk vev [24].
I vårt tidligere arbeid [9], oppdaget vi at høy Trim28 (Intensjons motiv inneholder 28) proteiner nivåer korrelerer med lengre total overlevelse i lunge adenokarsinom pasienter tidlig-iscenesatt, men ikke i sen-iscenesatt pasienter. Denne observasjonen foreslått for oss at Trim28 kan spille dobbeltroller i lungekreft. Vi spekulert at rollen i senere stadier kan forholde seg til EMT [14]. For å teste denne hypotesen, undersøkte vi effekten av shRNAi-mediert Trim28 uttømming på EMT hos NSCLC cellelinjer (A549 og H358). Vi fant at Trim28 bidrar til TGF-β-indusert EMT, og at høy Trim28 favoriserer EMT som tyder på at Trim28 kan være en regulator av tumormetastase, spesielt i den senere stadium av lungekreft utvikling.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, plasmider og reagenser
Originale lungekreftcellelinjer ble hentet fra ATCC. A549 og H358-celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum. Trim28-mangel A549 celler (Trim28 shRNA), Trim28-dyktig A549 og på lignende måte avledede styrecellelinjer ble tidligere beskrevet [9]. H358-celler som stabilt uttrykker Trim28 shRNA ble valgt på 1 ug /ml puromycin. H358-celler som stabilt uttrykker Trim28 ble selektert i 500 ug /ml G418. Enkelt kloner ble screenet for Trim28 uttrykk. Tilsvar-avledede styrecellelinjer ble dannet ved anvendelse av tom-vektorer. PcDNA-FLAG-HA-TIF1β og PRL-TK ble beskrevet tidligere [9]. pCS2-Myc-Trim28 [25] og pGL3-E-cadherin [26] var de generøse gaver fra Ryan Potts (UT Southwestern) og Jia Fang (Moffitt Cancer Center), henholdsvis. TGF-β ble kjøpt fra R 90% sammenflytende. Tre strake sår var riper i hver brønn med steril 200 mL pipette tips. Cellene ble skyllet forsiktig med PBS og 2 ml media (uten FBS eller inneholdende 10% FBS) ble tilsatt. Bildene ble tatt ved 40x forstørrelse rett etter riper og igjen etter 24 timer og 48 timer. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer og alle forsøkene gjentatt tre ganger.
Invasion analyser
Invasion ble utført i BD BioCoat Matrigel invasjonen kammer (354480, BD Bioscences) etter produsentens anvisninger. Nærmere bestemt, ble A549-cellene resuspendert til 5 x 10
4 celler /ml og lastet inn i kammerinnsatser (kontrollinnsatser eller Matrigel-belagte innsatser). Celler ble inkubert ved 37 ° C i 22 timer, og cellene som hadde migrert ble vasket, fiksert med metanol, farget med 0,5% krystallfiolett og tellet i tre mikroskopiske felt. Den prosentvise invasjon ble beregnet ved å dividere den gjennomsnittlige antall celler som invaderer gjennom en Matrigel innsats ved det midlere antall celler som migrerer gjennom en styreinnsats. Invasjonen indeksen ble bestemt ved å sammenligne prosent invasjonen av Trim28 knockdown-celler med den prosent invasjonen av kontrollceller.
Tredimensjonal flercellet sfæroide kulturer
Tredimensjonal flercellede sfæroide kulturer ble opprettet på lignende måte som beskrevet [28]. I korthet ble cellene resuspendert i vekstmedium til en konsentrasjon på 5 x 10
6 celler /ml, 30 pl av cellesuspensjonen ble brukt til å lage en dråpe og 12 dråper ble lastet på lokket av en steril 10-cm vev kultur plate. Lokket ble forsiktig snudd og 20 ul vekstmedium ble tilsatt til hver dråpe før de ble plassert på en 10-cm vevkulturplate inneholdende 6 ml av vekstmedier og inkubert over natten. Den neste dag ble 20 ul av medium ble fjernet fra hver dråpe og 20 ul friskt medium uten TGF-β eller inneholdende TGF-β (sluttkonsentrasjon, 5 ng /ml) ble tilsatt. Celler ble inkubert i 72 timer og høstet for RNA-ekstraksjon.
Statistisk analyse
Eksperimenter ble utført in triplo og presentert som gjennomsnitt +/- SD. Dataene ble analysert ved tosidige Student
t
-test for signifikans.
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant og representert med stjerner i tallene.
Resultater
Trim28 mangel endrer uttrykk for EMT markører
Å ta rollen som Trim28 i A549 og H358 ikke-småcellet lungekreft cellelinjer, kontroll og Trim28 manglende celler ble utviklet ved hjelp av ikke-tie shRNA som en kontroll og shRNA targeting Trim28. Først utnyttet vi en e cadherin antistoff og konfokalmikroskopi til bilde E-cadherin uttrykk i kontroll A549 celler og i Trim28-mangel A549s. Fig. 1A viser at kontroll A549-celler uttrykker relativt lave nivåer av E cadherin, mens Trim28-manglende celler som uttrykker en stor del av E cadherin lokalisert i plasmamembranen. Nivåer av β-tubulin var upåvirket av Trim28-mangel. Real-time PCR ble brukt til å undersøke uttrykket av flere EMT markører i kontroll og Trim28-mangel A549s og H358-celler. Som vist på fig. 1B, E-cadherin mRNA er økt mens N-cadherin og Snail2 ble redusert i Trim28 knockdown celler. I H358-celler (Fig. 1B nederst) E-cadherin er økt mens Fibronektin, Snail1, Snail2, og Twist1 er redusert i Trim28 knockdown celler. Western blot bekreftet at Trim28 knockdown resulterte i en økning i E-cadherin uttrykk og en reduksjon av N-cadherin ekspresjon på proteinnivå (fig. 1C). Reduksjonen av N-cadherin-proteinet var også tydelig ved konfokal mikroskopi (se figur S1). De respektive positive korrelasjoner mellom Trim28 uttrykk og N-cadherin uttrykk og den negative korrelasjonen mellom Trim28 uttrykk og E-cadherin uttrykk er også tydelig når en serie av umanipulerte cellelinjer er undersøkt ved Western blotting (se figur S2).
En
, kontroll og Trim28 knockdown A549 celler ble farget (som beskrevet under «Eksperimentelle metoder») og undersøkt ved hjelp confocal immunfluorescens mikroskopi, som følger: E-cadherin (grønn, topp panel), β-tubulin ( grønn, nedre panel), og DAPI (blå). Fusjonerte bilder er i bunnen av hvert panel.
B
, RNA ekstrakter av kontroll og Trim28 knockdown A549 og H358-celler ble utsatt for real-time PCR for å bestemme uttrykket av målgener som angitt.
Stjernene
representerer betydelige
p
verdier *:
p
0,05.
C
, markører uttrykk for EMT E-cadherin og N-cadherin ble målt i kontroll og Trim28 knockdown A549 og H358 celler ved western blotting.
Trim28 overekspresjon endrer uttrykk for EMT markører
Siden tidligere arbeid har rapportert at Trim28 kan fungere som en transkripsjons co-faktor [16], [17], spurte vi om Trim28 kan regulere aktiviteten av E-cadherin promoter ved hjelp av en luciferase reporter konstruere drevet av E-cadherin-promoteren. Empty pcDNA vektor eller pCS2-Myc-Trim28 plasmider ble transfektert inn i A549 og H358-celler sammen med en E-cadherin promoter-drevet luciferase reporter og en transfeksjon kontroll reporter (PRL-TK Renilla Luciferase). Fig. 2A viser at E-cadherin-promoteren er betydelig undertrykt av Trim28 overekspresjon i begge cellelinjer. For å adressere et større antall markører A549 og H358-celler som stabilt uttrykker Trim28 ble utledet sammen med styreledninger tilsvar-avledet ved hjelp av tom vektor. Som forventet, Trim28 overekspresjon gir reduserte E-cadherin ekspresjonsnivåer, mens N-cadherin-nivåene ble øket (fig. 2B). Lignende resultater (fig. 2C) ble oppnådd på mRNA-nivå anvendelse av sanntids-PCR. Sammen er disse data tyder på at Trim28 kan fremme EMT i lunge kreft cellelinjer.
En
, A549 og H358 ble transfektert i tre eksemplarer med E-cadherin promoter luciferase reporter, PRL-TK reporter, og ekspresjonsplasmider som angitt i figuren. Cellene ble høstet 48 timer etter transfeksjon for bestemmelse av luciferase-nivåer.
B
, kontroll (pcDNA3) og Flag-Trim28 stabilt uttrykt A549 og H358-celler ble analysert for E-cadherin og N-cadherin nivåer ved western blotting.
C
, RNA ekstrakter av kontroll og Trim28 stabilt uttrykt A549 og H358-celler ble utsatt for real-time PCR. Uttrykket av målgener ble bestemt.
Stjernene
representerer betydelige
p
verdier *:
p
0,05
Trim28 uttrykk er indusert av TGF-β
Det er kjent at Trim28 ekspresjon og TGF-β signale både økt i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft [9], [23], [29]. For å finne ut om disse observasjonene er koblet i lungekreft, benyttet vi to ikke-småcellet lungekreft cellelinjer som gjennomgår EMT på TGF-β behandling som modeller [30], [31]. Som det fremgår av figur 3A, er Trim28 proteinnivåer økes ved TGF-β behandling i begge cellelinjer. Selv om basalnivået av Trim28 var meget lav i Trim28 knockdown-celler, ble dets ekspresjon likevel indusert etter TGF-β inkubasjon. Real-time PCR viste tilsvarende resultat i mRNA nivåer (Figur 3B).
A Hotell og
B
, A549 og H358 stabilt uttrykker ikke-tie shRNA og Trim28 shRNA ble behandlet med TGF-β (2 ng /ml) i 3 til 10 dager. Helcellelysater og RNA-ekstrakter ble underkastet Western-blotting ved å bruke de angitte antistoffer (A) og real-time PCR (B).
Stjernene
representerer betydelige
p
verdier *:
p
0,05
Trim28 deltar i TGF-β-indusert EMT
TGF-beta behandlede celler vil gjennomgå EMT som kan være preget av morfologiske celleforandringer fra steinliknende til spindel-lignende form [32]. For å bestemme hvorvidt Trim28 er nødvendig for TGF-β-indusert EMT, behandlet vi kontroll- og Trim28 knockdown-celler med TGF-β (2 ng /ml) og observerte den morfologiske endring over tid. Fig. 4A viser at oppkjøpet av mesenchymale morfologi i kontroll H358 indusert av TGF-β ikke ble observert i Trim28 knockdown celler under samme tilstand sterkt antyder at Trim28 er involvert i TGF-β-indusert EMT. Ved hjelp av real-time PCR, undersøkte vi mRNA nivået av E-cadherin og andre kjente mesenchymale markører i A549-kontroll og Trim KD celler etter TGF-β behandling. Selv i Trim28 knockdown celler enkelte mesenchymale gener viser liten oppregulering, den robuste induksjon av mesenchymale markører N-cadherin, fibronektin, vimentin, og Twist1 forårsaket av TGF-β behandling ble betydelig svekket (Fig.4B). Western blot resultater (Fig.4C) bekrefter at TGF-β er i stand til å redusere E-cadherin og up-regulere N-cadherin uttrykk i kontrollceller, men den unnlater å gjøre det i Trim28 knockdown celler.
En
, kontroll og Trim28 knockdown celler ble behandlet med TGF-β eller ubehandlet. Celler ble fotografert ved 40 × forstørrelse.
B
, RNA ble ekstrahert fra kontroll og Trim28 knockdown A549 celler behandlet med TGF-β som ovenfor eller venstre ubehandlet. Real-time PCR ble utført og uttrykk for målgener ble bestemt.
C
, kontroll og Trim28 knockdown A549 og H358-celler ble behandlet med TGF-β (2 ng /ml) til morfologi forandringer ble ikke observert eller ubehandlet. Hele cellelysater ble utsatt for western blotting ved hjelp av antistoffer som angitt.
Nedbryting av Trim28 reduserer celle migrasjon og invasjon
Rollen Trim28 i celle migrasjon og invasjon ble evaluert av wound- helbredende analysen og Matrigel-baserte transwell invasjon assay. I våre tidligere studier, har vi funnet at Trim28 påvirker celleproliferasjon i A549-celler, men ikke signifikant i H358-celler (upubliserte data og [9]). Heri vi brukte kulturmedium med eller uten FBS for å utelukke bidrag av celleproliferasjon ved bestemmelse av migreringen av A549-celler. Trim28 knockdown-celler viste mindre lukking av sår enn kontrollcellene (Fig.5A og 5B) med eller uten serum. I tillegg viste det Matrigel baserte transwell invasjonen analysen at Trim28 knockdown hemmet celle invasjon av A549 celler (Fig.5C).
En
, kontroll og Trim28 knockdown H358-celler ble utsatt for sår -healing analysen. Celler ble fotografert rett etter bunnen av, og 24 timer og 48 timer etter scratch.
B
, kontroll og Trim28 knockdown A549-celler ble utsatt for sårheling assay i fravær eller nærvær av serum. Celler ble fotografert rett etter scratch og 24 timer senere.
C
, kontroll og Trim28 knockdown celler ble sådd ut i tre eksemplarer på toppen brønnene av Matrigel-belagte eller ikke-belagte kamre. Etter 18 timer ble celler som hadde invadert gjennom Matrigel lag fiksert og farget. Prosentandelen av invaderende celler er vist i søylediagrammet.
Stjernene
representerer betydelige
p
verdier *:
p
0,05.
D
, kontroll og Trim28 knockdown A549-celler ble dyrket i en tre-dimensjonal modell og behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 72 timer. RNA ble ekstrahert fra cellene og utsatt for real-time PCR. Ekspresjon av målgener ble bestemt.
Tredimensjonal cellekulturer er blitt vist å gjennomgå EMT mer effektivt enn monolagsceller [28]. For å undersøke om Trim28 knockdown undertrykker EMT i en tredimensjonal modell, seeded vi kontroll og Trim28 knockdown A549 celler på lokket av p100 kultur skål og fikk dem til å danne hengende dråper som beskrevet i
Materialer og metoder
. Etter 72 timer i nærvær av TGF-β, ble cellene høstet og RNA ekstrahert for real-time PCR-analyse av EMT markører. Fig. 4B viser at etter TGF-β behandling ekspresjonen av vimentin, Snail1, og Snail2 i kontroll A549 cellene endret seg mer dramatisk (6 til 10 ganger) i 3D-modellen (fig. 5D) enn de i monolag (1,5 til 2,5 ganger). Men disse EMT markørene var ikke oppregulert i Trim28 knockdown celler etter TGF-β behandling. Sammen utgjør disse resultatene støtter våre funn at Trim28 er en regulator av EMT.
Trim28 endrer histone 3 modifikasjoner på E-cadherin og N-cadherin arrangører
Trim28 har vist seg å regulere genekspresjon gjennom modifikasjon av histoner av target gen arrangører [8]. Kjente partnere av Trim28 inkluderer SETDB1 [19], en histone 3 lysin 9-spesifikke metyltransferase og histone deacetylases som HDAC1 [8]. I vårt tidligere arbeid, fant vi at Trim28 knockdown øker histone 3 lysin 9 acetylering på visse mål arrangører [9]. Heri, utforsket vi enten Trim28 påvirker histone 3 forbehold i E-cadherin og N-cadherin arrangører. Chip-analyser ble ansatt og IgG, acetyl-H3K9, dimetyl-H3K9, og trimetyl-H3K9 antistoffer ble brukt. Som vist på fig. 6A, i Trim28 manglende celler, øket acetylering, mens metyleringen er redusert på histon-3 lysin 9 av E-cadherin-promoteren sammenlignet med kontroll shRNA celler. En motsatt effekt på N-cadherin ble observert i de samme cellene.
En
, Chip analyser ble utført i kontroll og Trim28 knockdown A549 celler. Kvantitativ PCR ble utført for å undersøke belegg av IgG, acetylert histon 3 K9, dimethylated histon 3 K9, og trimetylert histon 3 K9 på E-cadherin og N-cadherin arrangører. B, Chip analyser ble utført i kontroll og Trim28 stabilt uttrykt A549 celler. Kvantitativ PCR ble utført for å undersøke belegg av IgG, acetylert histon 3 K9, dimethylated histon 3 K9, og trimetylert histon 3 K9 på E-cadherin og N-cadherin arrangører.
I tillegg til å demonstrere enten Trim28 overekspresjon kan påvirke E-cadherin og N-cadherin arrangører, brukte vi pcDNA3 kontroll og Trim28-dyktige A549 celler og utført ChIP analysen. På fig. 6B, i motsetning til resultatene observert i Trim28 knockdown-celler, er det acetylering av histon H3K9 redusert og metylering er økt i Trim28-dyktige celler. På N-cadherin-promoteren, blir acetylering av histon-3 H3K9 økt og metylering er redusert. Til sammen disse resultatene tyder på at Trim28 endrer E-cadherin og N-cadherin uttrykk (i hvert fall delvis) av histone modifikasjon som i sin tur regulerer deres transkripsjon.
Diskusjoner
Vi har vist at Trim28 kan påvirke den post-translasjonell modifikasjon av histon-3 på E-cadherin og N-cadherin promotorer. På dette punktet vi ikke har belyst de spesifikke mekanismene som er involvert. Trim28 kan formidle disse endringene direkte eller indirekte. Den direkte mekanismen ville innebære Trim28 og Trim28-forbundet histone modifikatorer blir rekruttert til cadherin arrangører av EMT-regulerer transkripsjonsfaktorer. Trim28 har vist seg å binde og regulere mange transkripsjonsfaktorer på denne måte [16], [19], [33]. Vi har imidlertid utformet primere rettet mot -2 kb til +0,5 kb av E-cadherin og N-cadherin arrangører og ikke klarte å oppdage en Trim28 bindende region av Chip analyse (upubliserte observasjoner). En annen mulighet er at Trim28 regulerer ekspresjonen av EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer som kan ytterligere regulerer EMT gener. De transkripsjonsfaktorer som kan ligge direkte på E-cadherin promoter inkluderer Snail1, Snail2, ZEB1, ZEB2, Twist1 og FOXC2 [4]. I vår studie fant vi at uttrykket av mange transkripsjonsfaktorer endres med Trim28 overekspresjon eller mangel som gir bevis for å støtte muligheten. Videre undersøkelser vil utforske denne mekanismen.
Det mest bemerkelsesverdige del av vårt arbeid er beskrevet her er at Trim28 påvirker TGF-β-indusert EMT i lungekreft gjennom transcriptional regulering av flere epitel og mesenchymale markører. Muse betinget knockout studier har klart indikerte at Trim28 og tilhørende familiemedlem kan oppføre seg som tumor suppressors [34]; Men andre studier indikerer at Trim28 har forhøyede nivåer og onkogene effekter i en rekke kreftformer [21], [35]. Vi foreslår modellen vist i fig. 7 for å forklare den doble rollen Trim28 i lungekreft utvikling og metastasering. Vi hypotese at Trim28, gjennom regulering av flere alternative reaksjonsveier kan ha både tumor-undertrykkende og onkogene aktivitet mye som TGF-β signalveien er kjent for å spille en rolle kompleks tumorigenesis. På den ene siden, TGF-β1 regulerer negativt cellesyklus og tjener som en tumor suppressor i normale og pre-malignment vev. På den annen side, TGF-β, utskilles av tumorceller, fremmer tumorinvasjon og metastase [36]. Vi foreslår at Trim28 bidrar vesentlig til TGF-β evne til å holde cellevekst og for TGF-β1 å indusere EMT. Disse muligheter er ikke gjensidig utelukkende, og dette nettverket kan være enda mer komplisert når stadier og typer av kreft er vurdert. Som vist i figur 7, i normalt vev og tidlig stadium kreftformer, er Trim28 ansvarlig for celle-syklusregulering gjennom E2F-transkripsjonsfaktorer og HDACs; Derfor viser Trim28 en anti-proliferativ funksjon og virker som en tumor suppressor. I sent stadium eller metastatisk kreft, høyt nivå av Trim28 bidra til EMT gjennom transkripsjonen regulering av epithelial og mesenkymale gener, som et resultat av celler med høy grad av Trim28 tendens til å ha en mer invasive og metastatisk natur. Denne modellen er støttet av rapporter i litteraturen [13], [24] og våre funn [9]. Våre resultater kan kaste lys mot å forstå de doble rollen som TGF-β signalering i tumorer.
Denne modellen forklarer dette arbeidet og vårt tidligere arbeid demonstrere en tumor suppressor rolle for Trim28 [9].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Trim28 mangel reduserer uttrykk for N -cadherin.
C
-regulering og Trim28 knockdown A549 celler ble farget (som beskrevet under «Eksperimentelle metoder») og undersøkt ved hjelp confocal immunfluorescens mikroskopi, som følger: N-cadherin (grønn, topp panel), β-tubulin (grønn, bunnpanel), og DAPI (blå). Sammenslåtte bilder er nederst
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101040.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Trim28 uttrykk viser negativ korrelasjon med E cadherin uttrykk og positiv korrelasjon med N-cadherin uttrykk i en rekke ikke-småcellet lungekreft linjer. A, helcellelysater ble underkastet Western-blotting ved å bruke de angitte antistoffer. B, bandet intensiteter ble kvantifisert og plottet på en log skala. Sammenhenger er ikke statistisk signifikante
doi:. 10,1371 /journal.pone.0101040.s002 plakater (TIF)
