Abstract
Bakgrunn
Oral kreft, som er den fjerde vanligste mannlige kreft, er assosiert med miljøkreftfremkallende i Taiwan. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -C, en angiogen /lymphangiogenic faktor med høye uttrykk nivåer i tumorvev, spiller viktige roller i utviklingen av flere kreftformer. Denne studien er designet for å undersøke sammenslutninger av fem
VEGF-C
genet polymorfismer med mottakelighet for og clinicopathological kjennetegn ved muntlig plateepitelkarsinom.
Metodikk /hovedfunnene
Fem enkelt-nukleotid (SNP) i
VEGF-C
ble analysert ved en sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) i 470 mannlige pasienter med oral cancer og 426 kreftfrie kontroller. I denne studien fant vi at
VEGF-C
rs7664413 og rs2046463 polymorfismer var forbundet med oral-kreft mottakelighet, men ikke med noen clinicopathological parametere.
GGACA
eller
GACTG
haplotype av fem
VEGF-C
SNPs (rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413, og rs2046463) kombinert ble også knyttet til risikoen for oral kreft. Blant 611 mannlige røykere,
VEGF-C
polymorfi operatører som også tygget betel pund ble funnet å ha en 14,5 til 24,2 ganger risikoen for å få kreft i munnhulen i forhold til
VEGF-C
vill typen transportør som ikke tygger betel pund. Blant 461 mannlige betel-pund chewers,
VEGF-C
polymorfi transportører som også hadde røykt hadde 2,7 til 18,1 ganger risikoen for å få kreft i munnhulen i forhold til de som bar villtypen men ikke røykte.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at de to SNPs av
VEGF-C plakater (rs7664413 og rs2046463) og en av to haplotyper av fem SNPs kombinert har potensial prediktiv betydning i oral karsinogenese. Gene-miljø interaksjoner mellom
VEGF-C
polymorfismer, røyking og Betel-pund tygging kan endre ens mottakelighet for kreft i munnhulen
Citation. Chien MH, Liu YF, Hsin CH, Lin CH , Shih CH Yang SF, et al. (2013) Effekt av
VEGF-C
Gene Polymorfisme og miljøfaktorer på Oral Cancer Følsomhet i Taiwan. PLoS ONE 8 (4): e60283. doi: 10,1371 /journal.pone.0060283
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 11 januar 2013; Godkjent: 25 februar 2013; Publisert: 04.04.2013
Copyright: © 2013 Chien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forskningsmidler fra National Science Council, Taiwan (NSC 100-2632-B-040-001-My3) og et tilskudd fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital (gi no. 101swf03 Dr. Chien og Dr. Yang) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC), en felles ondartet kreft i hode- og nakkeregionen, er den fjerde vanligste mannlige kreft og den sjette største årsaken til kreftdød i Taiwan [1]. Utviklingen av OSCC er en flertrinnsprosess som krever akkumulering av flere genetiske forandringer, påvirket av en pasients genetisk predisposisjon og av miljømessige påvirkninger, inkludert alkohol- og tobakksforbruk, betel-pund tygging, kronisk betennelse, og viral infeksjon [1] – [6 ]. Ekspresjon av et gen som kan påvirkes av en enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) befinner seg innenfor promoter eller andre regulatoriske områder av genet, og produksjonen eller aktiviteten av dens translaterte protein blir ytterligere modulert. SNP’er, som er den vanligste typen av DNA-sekvensvariasjon, oppstår når et enkelt nukleotid i den delte sekvensen av et gen som er forskjellig mellom medlemmer av en art eller sammenkoblede kromosomer i et individ, og er antatt å være assosiert med utvikling av visse sykdommer [7]. Genotyping-relaterte SNP’er kan være en enkel og verdifull metode for å forutsi risikoen for og prognose av kreft. For å belyse den komplekse prosessen med kreftutvikling og forbedre det vitenskapelige grunnlaget for forebyggende tiltak, identifisere viktige gener knyttet til mottakelighet for OSCC bør være en prioritet og effektive metoder for å utføre.
Mange tidligere studier har vist at tumor-assosiert angiogenese og lymphangiogenesis spiller avgjørende roller i tumorprogresjon, og angiogene og lymphangiogenic aktiviteter er ofte korrelert med tumorvekst, regional lymfeknutemetastase-node, fjerntliggende metastaser, og prognosen for pasienter med ondartede svulster [8] – [10]. Den vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) familien av proteiner som modulerer mange endoteliale cellefunksjoner, spesielt involverer vaskulogenese og angiogenese [11]. VEGF-A, den første beskrevne medlemmer av VEGF-familien, induserer angiogenese ved å aktivere de tilhørende tyrosinkinase-reseptorer, VEGF-R1 og VEGF-R2, på endotelceller [11], [12]. Selv om VEGF-A spiller en avgjørende rolle i tumor angiogenese, ble VEGF-C karakterisert som en viktig faktor som fremmer lymphangiogenic kreft metastase [13] – [15]. VEGF-C er en ligand for både VEGF-R3 og VEGF-R2, men har en høyere affinitet for VEGF-R3 [12]. VEGF-R3 er hovedsakelig uttrykt av lymfatiske endotelceller. VEGF-C fører til fosforylering av VEGF-R3, fører til PI3K-avhengige Akt aktivering og proteinkinase C (PKC) -avhengig aktivering av p42 /P44 mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) reaksjonsveien, og dermed beskytte lymfatiske endotelceller fra apoptose og stimulere spredning og migrasjon
in vitro product: [16]. Videre ble det nylig vist at VEGF-R3 kan også drive angiogenese [17], [18]. Den angiogene VEGF-R3-signalet er hovedsakelig aktiv i innstillingen av angiogene invasjon av vev, slik som oppstår med svulster. VEGF-R3 potenserer effekten av VEGF-R2, og kan opprettholde angiogenese, selv i nærvær av VEGF-R2-inhibitorer [18]. Disse studiene fremhevet den betydelige biologiske rollen til VEGF-C /VEGF-R3 akse i vaskulære endotelceller
Tallrike studier har vist at VEGF-R3 er også uttrykt i en rekke humane maligniteter [19] -. [22 ], og dette fenomenet ble rapportert å være en mulig prediktiv faktor for å bestemme den kliniske metode, fordi det er korrelert med lymfeknute-metastaser eller dårlig prognose i pasienter med prostatacancer, endometrial karsinom, OSCC, og ikke-småcellet lungekarsinom [ ,,,0],20], [23] – [25]. Funksjonen og molekylære mekanisme av VEGF-C /VEGF-R3 akse i kreftceller, men er ikke godt forstått. Tidligere studier har vist at tyrosin-fosforylering av VEGF-R3 i kreftceller stimulerer celleproliferasjon i Kaposis sarkom, ondartet mesothelioma, leukemi, og magekreft [22], [26] – [28]. Andre og oss selv viste at aktivering av VEGF-C /VEGF-R3 signalering i kreftceller øker celle mobilitet og invasivitet og bidrar til å fremme kreftcelle metastase [20], [27], [29]. Disse funnene til sammen indikerer viktigheten av VEGF-C signalisering i tumorprogresjon (vekst, invasjon og metastasering) ved å handle direkte på kreftceller.
Konsekvenser av
VEGF-A
polymorfisme på menneskelig kreft mottakelighet er godt dokumentert [30] – [33], men rollene til
VEGF-C
genet SNPs og miljøkreftfremkallende i oral cancer mottakelighet og kliniske funksjoner forblir dårlig undersøkt. I denne undersøkelsen ble det en case-control studie utført på fem SNPs, som er plassert i intron eller nedstrøms av
VEGF-C
genet. Noen av disse SNPs ble rapportert å være korrelert med risikoen for svangerskapsforgiftning [34], osteonekrose i lårbenshodet [35], eller overlevelsen med ovariekreft [36]. I denne studien analyserte vi assosiasjoner mellom
VEGF-C
genet SNPs, miljø risikofaktorer og kreft i munnhulen mottakelighet. Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser dette tydelig signifikante assosiasjoner til
VEGF-C
polymorfismer med oral kreftutvikling.
Materialer og metoder
Fag og Prøvetaking
i 2007-2011, rekrutterte vi 470 mannlige pasienter (gjennomsnittsalder 54,0 ± 11,3 år) på Chung Shan Medical University Hospital i Taichung, Changhua Christian Hospital og Show Chwan Memorial Hospital i Changhua, Taiwan som en sak gruppe. For kontrollgruppen, tilfeldig valgte vi 426 ikke-kreft individer (gjennomsnittsalder på 50,5 ± 13,9 år) som besøkte de samme sykehusene og dermed var fra samme geografiske område. For begge tilfeller og kontroller, brukte vi et spørreskjema for å få eksponering informasjon om betel-pund tygging, tobakksbruk og alkoholforbruk. Medisinsk informasjon av tilfellene, inkludert TNM klinisk staging, primærtumor størrelse, spredning til lymfeknuter, og histologisk klasse, ble hentet fra deres journaler. Oral-kreftpasienter ble klinisk iscenesatt på tidspunktet for sin diagnose i henhold til TNM staging system av amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC). Tumor differensiering ble undersøkt av en patolog henhold til AJCC klassifisering. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board of Chung Shan Medical University Hospital og informert skriftlig samtykke til å delta i studien ble innhentet fra hver enkelt.
Valg av VEGF-C Polymorfisme
I dbSNP database, har over 60 SNPs blitt dokumentert i intron eller nedstrøms for
VEGF-C
genet regionen. For å få tilstrekkelig kraft for å vurdere potensialet foreningen, undersøkte vi rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 og rs2046463, de med mindre allelfrekvensene ≥ 5%. Videre disse SNPs av
VEGF-C
genet ble valgt i denne studien siden disse SNP ble funnet i kreftpasienter.
Genomisk DNA Extraction
Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp QIAamp DNA blod mini-sett (Qiagen, Valencia, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Vi oppløste DNA i TE-buffer (10 mM Tris ved pH 7,8 og 1 mM EDTA) og deretter kvantifisert ved å måle den optiske tetthet ved 260 nm. Den endelige forberedelser ble lagret ved -20 ° C og brukes til å lage maler for polymerase chain reaction (PCR).
Real-time PCR
alleliske diskriminering av rs3775194, rs11947611, rs1485766 , rs7664413 og rs2046463 polymorfismer av
VEGF-C
genet ble vurdert med ABI StepOne ™ real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og analysert ved hjelp av SDS v3.0 programvare (Applied Biosystems), med TaqMan-analysen. FAM-primere som brukes for analyse av rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413 og rs2046463 gener polymorfismer ble utformet som FAM-5’ATTTAGCACTATTAACTTCAAG; FAM-5′-TTACTTTTGAGAATGTCA; FAM-5′-CTTTTTGATTGCAGTGTTA; FAM-5′-CTTTACTATACTTTACTTGG og FAM-5’TTTAGCACACGGTTTAGT, henholdsvis. Sluttvolumet for hver reaksjon ble 5 ul, inneholdende 2,5 ul TaqMan genotyping Master Mix, 0,125 mL TaqMan probe blanding, og 10 ng genomisk DNA. Den real-time PCR inkludert et innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min.
Statistiske analyser
Forskjeller mellom grupper ble betraktet som signifikant hvis
p
verdier var 0,05. Hardy-Weinberg likevekt (HWE) ble vurdert ved hjelp av en godhet-of-fit
Χ
2
-test for biallelic markører. Mann-Whitney
U
-test og Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne forskjeller i demografiske karakteristiske fordelinger mellom friske kontrollgruppen og oral-kreftpasienter. De justerte odds ratio (AORs) og 95% konfidensintervall (CIS) av foreningen av genotypefrekvensene med risiko og clinicopathological karakteristika ble beregnet ved hjelp av flere logistikk regresjonsmodeller etter kontroll for andre kovariatene. Vi analyserte alle data med Statistiske Analytic System (SAS Institute, Cary, NC, USA) programvare (vers. 9.1, 2005) for Windows.
Resultater
Den statistiske analyser av demografiske karakteristika vises i tabell 1. Det var signifikante forskjeller i fordelingen av betel-pund tygging (
p
0,001), alkoholforbruk (
p
0,001), og tobakksbruk (
p
0,001) mellom kontrollpersoner og OSCC pasienter mannlige. For å redusere faren for interferens av miljøfaktorer, ble AORs med 95% konfigurasjons anslått av flere logis regresjonsmodeller etter kontroll for andre kovariater i hver sammenligning.
I vår rekruttert kontrollgruppen, frekvensene
VEGF-C
rs3775194 (
p
= 0,844, χ
2 verdi: 0,039), rs11947611 (
p
= 0,148, χ
2 verdi: 2,090) , rs1485766 (
p
= 0,566, χ
2 verdi: 0,329), rs7664413 (
p
= 0,115, χ
2 verdi: 2,478), og rs2046463 (
p
= 0,115, χ
2 verdi: 2,478) var i Hardy-Weinberg likevekt, henholdsvis. Den rekonstruerte koblingsulikevekt (LD) tomt på fem SNPs er vist i figur 1. Vi bestemt en observerte haploblock der rs7664413 og rs2046463 viste 100% koblingsulikevekt i vår studie. Genotype fordelinger og sammenhenger mellom kreft i munnhulen og
VEGF-C
genet polymorfismer er vist i tabell 2. Alleler med høyest fordeling frekvens for rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413, og rs2046463 gener av
VEGF-C
i begge våre rekruttert oral-kreftpasienter og friske kontrollhannhenholdsvis var homozygote for G /G, heterozygote for A /G, heterozygote for C /A, homozygote for C /C, og homozygote for A /A. Korrigert for flere variabler, var det ingen signifikant forskjell i å ha kreft i munnhulen hos personer med rs3775194, rs11947611, og rs1485766 polymorfismer av
VEGF-C
genet i forhold til villtype (WT) individer. Men personer med
VEGF-C
polymorfe rs7664413 TT genotyper viste signifikant (
p
0,05) høyere risiko for 2.541- (95% KI = 1.071~6.027), for å ha OSCC sammenlignet med deres tilsvarende WT homozygote. Videre et lignende resultat ble også observert hos pasienter med
VEGF-C
polymorfe rs2046463 (tabell 2).
Den ene observerte haploblock, og den parvise LD tiltaket D «.
samspilleffekter mellom miljørisikofaktorer og genetisk polymorfisme av
VEGF-C
er vist i tabell 3 og 4. Blant 611 røykere, personer med minst en C allel av rs3775194, en G allel av rs11947611, en A allel av rs1485766, eller en T-allelet av rs7664413, og betel-nut-chewing vane hadde respektive risikoene for 14,501 ganger (95% KI: 6.899~30.479), 19.030- (95% KI : 9.239~39.197), 15.676- (95% KI: 7.413~33.150), og 24.220- (95% KI: 11.601~50.566) for å ha kreft i munnhulen. Personer med enten minst en C allel av rs3775194, en G allel av rs11947611, en A-allelet av rs1485766 eller en T-allelet av rs7664413 eller som tygges mutter hadde respektive risikoene for 11.688- (95% CI: 6.534~20.907), 2,827 – (95% KI: 1.491~5.360), 2.670- (95% KI: 1.302~5.473), og 7,241 ganger (95% KI: 3.981~13.172) for å ha kreft i munnhulen i forhold til personer med WT homozygote som ikke tygge mutter (tabell 3). Tilsvarende blant 461 betel-pund forbrukere, pasienter med
VEGF-C
polymorfe rs3775194, rs11947611 eller rs7664413, gener og som røykte hadde tilsvarende risiko for 2.695- (95% CI: 1.270~10.750), 8.066- ( 95% KI: 2.250~28.913), og 18.100 ganger (95% KI: 5.427~60.369) for å ha kreft i munnhulen i forhold til betel-pund chewers med WT-genet som ikke røyker (tabell 4). I lys av de ovennevnte resultatene, foreslår vi at
VEGF-C
genet polymorfismer ha en sterk innvirkning på oral-kreft mottakelighet betel-nøtt og /eller røyking forbrukere.
Vi ytterligere utforsket haplotyper å evaluere den kombinerte effekten av de fem polymorfismer på oral-kreft mottakelighet. Fordelings frekvenser av
VEGF-C
rs3775194, rs11947611, rs1485766, ble rs7664413, og rs2046463 haplotyper i våre rekruttert individer analysert. Det var fem haplotyper med frekvenser på 5% blant alle tilfeller, er den vanligste haplotype i kontrollen var GACCA (35,2%), og det ble derfor valgt som en referanse. Sammenlignet med referanse, to
VEGF-C
haplotyper, GGACA og GACTG, signifikant (
p
0,001) økte risikoen for OSCC av 1.568- (95% CI: 1.201~2.046 ) og 1,819 ganger (95% KI:. 1.352~2.448), henholdsvis (tabell 5)
for å klargjøre rollen som
VEGF-C
genet polymorfismer i oral- kreft clinicopathologic status, slik som TNM klinisk staging, primær tumor størrelse, lymfe-node engasjement, og histologisk grad, fordelingen frekvensen av klinisk status og
VEGF-C
genotypefrekvensene i oral-kreftpasienter ble estimert. Det ble ikke observert noen signifikant sammenheng mellom rs7664413 gen polymorfismer og clinicopathologic status (tabell 6).
Diskusjoner
Alkoholforbruket, tobakksrøyking, og Betel-pund tygging er de viktigste kjente etiologiske faktorer for kreft i munnhulen. I denne studien ble høyere forholdstall observert av personer som hadde tygget betel pund og konsumert alkohol og tobakk i gruppen av OSCC pasienter (78,9%, 62,8% og 87,0%, henholdsvis) enn kontrollpersonene (21,1%, 43,4%, og 47,4%, henholdsvis), noe som indikerer at alkohol og tobakk og betel-pund tygging er sterkt assosiert med økt risiko for kreft i munnhulen. Det er godt dokumentert at langsiktig tobakk og betel-pund forbruk bidrar til kreft i munnhulen [3], [4]. Betel-pund bestanddeler kan øke protein nivåer av c-Fos og c-Jun proto-onkogener [37]. Tobakksforbruket øker også betydelig uttrykk for hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1 [38] og henholdsvis VEGF-C [39] i muntlig og livmorhalskreft,. Eksponering for miljøkreftfremkallende kanskje delvis innebære dannelsen eller patogenesen av kreft i munnhulen, men økende bevis indikerer at genomisk endringer gradvis endre cellulære fenotyper og kanskje mer betydelig føre cellene til å utvikle seg fra preneoplastiske scenen til kreft [40]. Det ble rapportert at munnslimhinnen av individer med
murine dobbel minutt 2 (MDM2)
SNP 309 GG genotype er mer utsatt for miljøkreftfremkallende eksponering og resultater i tidligere angrep av tumordannelse [41]. En lengre alleliske polymorfisme av GT dinucleotide i
heme oxygenase (HO) -1
promoter og en funksjonell polymorfisme i
nukleær faktor kappa B1 (NFKB1)
promoter er begge knyttet til risiko betel-pund-relaterte OSCC [42], [43]. Polymorfismer av flere gener ble identifisert som å være forbundet med risiko for oral cancer [44], [45]. Det er klart at genetiske komponenter kan spille en sentral rolle i kreftutvikling.
VEGF-C er ofte identifisert i tumorvev i hode og hals plateepitelkarsinom, og den brede uttrykk for VEGF-C /VEGFR-3 aksen i hode og nakke plateepitelkarsinom antyder engasjement i tumor lymphangiogenesis og angiogenese, fremme tumorvekst, og spredning av kreftceller [46]. Dataene i tabell 2 viser at personer med
VEGF-C
polymorfe rs7664413 TT eller rs2046463 GG genotype har høyere risiko for OSCC forhold til WT genotype. Selv om den funksjonelle betydningen av disse to SNPs ikke har blitt testet eksperimentelt, er en forening med risiko for kreft i munnhulen foreslått basert på plasseringen av de analyserte varianter. Men i visse gener, kan en SNP som oppstår i koding, promoter, eller regulatorisk region har funksjonelle konsekvenser.
rs7664413 SNP ble plassert på intron 5 flanke region (-33 nt oppstrøms) av
VEGF-C
genet. Mange alternative spleise cis-regulerte elementer er lokalisert i denne region [47]. Vi fant videre at rs7664413 SNP ble plassert i en sekvens av en antatt exonic spleise lyddemper (Dess, [TAAGGTATA]). PESSs er cis-regulatoriske elementer som hemmer bruk av tilstøtende spleiseseter ved å handle gjennom samhandling med medlemmer av den heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein (hnRNP) familie og ofte bidrar til alternativ spleising (AS). PESSs regulere AS ved å rekruttere faktorer som direkte forstyrrer skjøting maskiner [48]. For eksempel binder hnRNP I /PTB mange exonic spleise lyddempere og ser ut til å blokkere tilgangen til skjøting maskiner gjennom protein multimerization [49]. Andre bevis støtter denne observasjonen om to spleisevarianter (ENST00000280193 og ENST00000507638) rapportert i Ensemble database (vers. GRCh37). En koder for det funksjonelle VEGF-C-protein (NM_005429, 420 aminosyrer), men den andre behandler bare transkripter (CF128431, uten proteinproduksjon, EST hentet fra kondrosarkom lungemetastase-cellelinjer). Disse data tyder på at rs7664413 SNP kan påvirke
VEGF-C
mRNA spleising. Imidlertid er videre spesielt utformet studier for å verifisere effekter og underliggende mekanisme av polymorfe rs7664413 på pre-messenger RNA-spleising.
rs2046463 SNP ble plassert nedstrøms for
VEGF-C
genet, men Ikke langt unna rs7664413 (nedstrøms 5008 nt). Som figur 1 viser, bestemt vi en LD haploblock konstituert av rs7664413 og rs2046463, som sannsynligvis representerer avhengige genetiske signaler som påvirker risikoen for OSCC, mens andre SNPs er utenfor haploblock. Imidlertid må den detaljerte underliggende mekanisme som skal verifiseres av en annen godt utformet eksperiment.
Tolkninger av denne studien er begrenset fordi informasjon om visse oral-kreft risikofaktorer, som marihuana (cannabis) røyking, medisinske nikotinbruk og arvelighet og familiære risiko, var ikke tilgjengelig for de rekruttert eksemplarer, og denne begrensningen kan begrense justering av disse muligens konfunderende faktorer. I denne studien, men de viktigste risikofaktorene for kreft i munnhulen, alkohol og tobakk og betel-pund tygging, ble justert for for å anslå effekten av genet polymorfismer på clinicopathological utvikling av OSCC. I en fremtidig studie, øker prøvenummeret og ta flere OSCC risikofaktorer i betraktning i analysen kan nettopp validere disse funnene.
I sammendraget,
VEGF-C
polymorfe rs7664413 TT eller rs2046463 GG genotype kan øke risikoen for OSCC.
GGACA
eller
GACTG
haplotype av fem
VEGF-C
SNPs (rs3775194, rs11947611, rs1485766, rs7664413, og rs2046463) kombinert viste også en høy risiko tilknytning OSCC. Våre resultater tyder på at
VEGF-C
rs7664413 og rs2046463 polymorfe genotyper og haplotype
GGACA
eller
GACTG
av de fem
VEGF-C
SNPs beskrevet ovenfor kan bidra til å forutsi mottakelighet for OSCC.
