Abstract
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som kan fungere som onkogener eller tumor suppressor gener i kreft hos mennesker. Emerging bevis viser at deregulering av miRNAs bidrar til human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). I denne studien, viste vi at uttrykket nivåer av MIR-132 ble dramatisk redusert i undersøkte NSCLC cellelinjer og prøver kliniske NSCLC vev. Deretter fant vi at innføringen av MIR-132 undertrykte betydelig migrasjon og invasjon av lunge kreftceller in vitro, noe som tyder på at MIR-132 kan være en roman tumor suppressor. Videre studier indikerte at EMT-relaterte transkripsjonsfaktor ZEB2 var en direkte målgener av MIR-132, dokumentert av den direkte binding av MIR-132 med 3 «ikke-translatert område (3» UTR) av ZEB2. Videre kan MIR-132 redusere ekspresjonen av ZEB2 ved nivået av mRNA og protein. Spesielt, EMT markør E-cadherin eller vimentin, en nedstrøms ZEB2, ble også nedregulert eller oppregulert på MIR-132 behandling. I tillegg, over-uttrykker eller stanse ZEB2 var i stand til å heve eller inhibere migrering og invasjon av lungekreftceller, parallelt med effekten av MIR-132 på lungekreftceller. I mellomtiden, knockdown av ZEB2 reversert forbedret migrasjon og invasjon mediert av anti-MIR-132. Disse resultatene indikerer at MIR-132 undertrykker migrasjon og invasjon av NSCLC cellene gjennom målretting ZEB2 involverer EMT prosessen. Dermed gir våre funn ny innsikt i mekanismen av NSCLC progresjon. Terapeutisk, kan MIR-132 fungerer som et potensielt mål i behandlingen av menneskelige lungekreft
Citation. Du J, Li Y, Fang N, Liu B, Zu L, Chang R, et al. (2014) MiR-132 Undertrykker Migrasjon og invasjon av lungekreft celler
via
Targeting EMT Regulator ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10,1371 /journal.pone.0091827
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan
mottatt: 19 september 2013; Godkjent: 15 februar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av midler fra sentralt prosjekt fra National Natural Science Foundation of China (No.81000950), National 863 Program (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), National 973 Program (No.2010CB529405), Tianjin Scientific Innovation System Program (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), Kina-Sverige Cooperative Foundation (No.09ZCZDSF04100), og stort prosjekt av Tianjin Sci-Tech Support Program (No.06YFSZSF05300). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er en av de vanligste årsakene til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis, og flertallet av lungekrefttilfellene er det ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som består av ca 80% av alle lungekrefttilfellene [1 ]. Pasienter som hadde NSCLC er ofte diagnostisert som et avansert stadium, lider av metastatically eller lokalt avansert sykdom, noe som gjør nesten 90% av lungekreftpasienter dør av metastaser [2]. Selv om stor innsats og progresjon er gjort i studiet av lungekreft i de siste tiårene, den molekylære mekanismen for lungekreft metastase fortsatt ukjent.
mikroRNA (miRNA) er en klasse av små, ikke-kodende RNA med ca 19-25 nukleotider. Den regulerer negativt genekspresjon på post-transkripsjon nivå ved å samhandle med 3-utranslaterte regioner (3′- UTR) av målet mRNA [3], [4]. Mirnas er fylogenetisk konservert og spille viktige roller i en rekke biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, apoptose, metabolisme, immunitet og tumor fremgang [5], [6]. Også økende bevis indikerer microRNAs kan modulere startfasen og progresjon og funksjon i tumor celle invasjon og metastase [7], [8], [9], [10]. Tidligere studier har dokumentert roller MIR-132 i regulering av differensiering av dopamin nevroner [11] og aktivere endotelet til rette for patologisk angiogenese [12]. I tumorigenesis, er det rapportert at nedregulering av MIR-132 bidrar til kreft i bukspyttkjertelen utvikling [13]. Men den potensielle rolle MIR-132 i lungekreft progresjon er fortsatt ikke dokumentert.
ZEB2 /SIP1 er medlem av deltaEF-en familie på to-handed sink-finger faktorer og spille viktige roller i utvikling av en rekke kreftformer, slik som mage, ovarie, squamous og ikke-småcellet lungekarsinom [14], [15]. ZEB2 spesielt undertrykke uttrykket av E-cadherin gjennom binding til CACCT (G) motiv i E-cadherin arrangøren under epithelial- mesenchymale overgang (EMT) [16], [17]. Foruten E-cadherin, er andre gener som plakophilin 2 og ZO-3 som involverer epitel-celle-celle kryss også undertrykt av ZEB2 [18]. Nylig er ZEB2 rapportert å transcriptionally up-regulere vimentin
via
samarbeid med SP1 under EMT [19].
I denne studien, forsøkte vi å undersøke den antatte rollen MIR-132 i metastasering av NSCLC. Vi fant ut at MIR-132 er nedregulert i metastatisk lungekreft cellelinjer og prøver kliniske vev, noe som tyder på at MIR-132 kan fungere som en tumor suppressor. Vi identifiserte at EMT regulator ZEB2 er en direkte målgener av MIR-132. MiR-132 er i stand til å hemme EMT og metastasering av NSCLC cellene gjennom lammer funksjon ZEB2.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av etikk Committee of Tianjin Medical University, Kina og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle undersøkte pasienter.
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kliniske prøver
De undercellelinjer, høy metastatisk L9981 og lav metastatisk NL9980, ble isolert og etablert fra en human lunge stor celle karsinom-cellelinje [20]. Den høy metastatisk 95D og lav metastatisk 95C var underlinjer for menneskelig gigant-celle lungekreft cellelinje [21]. Den NSCLC cellelinje YTMLC-9 [22], [23] ble etablert i vårt institutt. Disse cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% kalveserum (Invitrogen, USA), 100 IU /ml penicillin og 100 IE /ml streptomycin. Den NSCLC cellelinje A549, kjøpt fra American Tissue Culture Collection (ATCC), dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /mL penicillin og 100 U /mL streptomycin. Disse cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. For transfections ble cellene dyrket til 70% samløpet og transfektert med plasmider ved hjelp Lipofectamine2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefaling.
Totalt 90 tilfeller av NSCLC prøver ble innhentet fra General Hospital i Tianjin Medical University. Alle 90 pasienter som ikke hadde fått strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Vevsprøver for anvendelse ble lagret i flytende nitrogen. TNM staging system av UICC (1997) ble brukt til å klassifisere prøvene og overlevelsestider som ble beregnet fra driften dag til døden via evaluering av tilbakefall og metastasering til siste oppfølgingsdato. Den oppfølging av de overlevende pasientene i gjennomsnitt 32.55 måneder og varierte fra 1 til 96 måneder. Studien er godkjent av sykehus etisk komité. Clinicopathological informasjon av pasientene om alder, tumorstørrelse, histologisk type differensiering, scene og lymfeknutemetastase ble hentet fra pasientjournaler, som ble oppsummert i tabell 1.
Revers-transkripsjon PCR (RT PCR), kvantitativ real-time Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR) og werstern blot analysen
Total RNA ekstrahert ved Mirvana Kit (Applied Biosystems, CA) ble omvendt transkribert til cDNA med stammen sløyfe revers transkripsjon primer for miRNA deteksjon. Revers transkripsjon av MIR-132 og internkontroll U6 ble utført ved hjelp av revers transkriptase M-MLV (Takara, Japan). Den qRT- PCR ble utført ved anvendelse av SYBR Premiks Ex Taq (Takara) ved å følge protokollen ved anvendelse av en forvarmet sanntids instrument (Invitrogen). Alle primere ble vist i tabell S1. Tre uavhengige eksperimenter ble utført for å analysere relative genekspresjon, og hver prøve ble testet i tre eksemplarer. Ct-verdiene ble anvendt for å beregne ekspresjon av RNA-nivåer. Mengden av target-genekspresjon (2
-ΔΔCt) ble normalisert ved hjelp av U6 referanse.
Plasmidkonstruksjoner
Genomisk sekvens av humant MIR-132, inkludert rundt 200 bp-flankerende sekvens, ble amplifisert fra human genom, og deretter satt inn i BamHI /EcoRI-sete av pcDNA3.1 vektoren (Invitrogen), benevnt som pcDNA3.1-MIR-132. Full-lengde 3’untranslated region (3’UTR) av ZEB2 ble amplifisert fra humant genomisk DNA, og ble klonet inn i nedstrøms for ildflue luciferase-kodende region av pMIR-GLOTM Luciferase-vektor (Promega, USA). Den recombined vektor ble kåret som pMIR-ZEB2. Mutasjoner av MIR-132 bindingsseter ble introdusert av seterettet mutagenese og resulterte vektoren ble kåret pMIR-ZEB2-Mut. Primere som brukes til konstruksjonene ble oppført i tabell S1. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
Antistoffer og sirnas
Primære antistoffer som brukes i Western blot var kanin anti-ZEB2 (Santa Cruz, USA), anti-E-cadherin (Santa Cruz) , anti-vimentin (Santa Cruz) og muse anti-β-aktin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). β-aktin ble benyttet for normalisering. De små interfererende RNA (siRNA) rettet mot menneskelig ZEB2 mRNA, negativ kontroll siRNA (siControl), MIR-132 inhibitor (anti-MIR-132), og inhibitor negativ kontroll (anti-MIR-NC) ble kjøpt fra Ruibobio (Guangzhou, Kina ). Alle oligonukleotidsekvenser er oppført i tabell S1.
Cell migrasjon og invasjon Analyser
sårtilheling analysen ble utført for å analysere cellemigrasjon som beskrevet tidligere [24]. Boyden kammer analyser ble anvendt for å undersøke celle invasjon evne. -Celler ble transfektert med 1 jjg pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-MIR-132 vektoren. Seksten timer senere ble transfekterte celler trypsinisert og resuspendert. 1,0 x 10
5-celler i 300 ul kulturmedium ble plassert i de øvre kamre (Millipore). De nedre kamre ble fylt med 500 pl komplett medium med 10% FBS. Etter inkubering i 12 timer ved 37 ° C, ble ikke-invaderende celler fjernes fra toppen av kammeret med en bomullspinne. Vandrende celler på den nedre overflate av innsatsene ble fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett, og fem tilfeldig felt for hvert innskudd ble tellet ved 100 x forstørrelse.
luciferasereportergenet Assay
adherente celler ble sådd på 24-brønners plater og ko-transfektert med 200 ng av pMIR-ZEB2 eller pMIR-ZEB2-Mut vektor og 80 ng av pcDNA3.1-MIR-132 vektoren eller pcDNA 3.1 tomme vektorer, og PRL-TK plasmid (Promega, Madison, WI) som er anvendt som intern normalisering. Cellene ble høstet etter 36 timer og lysert ved hjelp av lyseringsbuffer (Promega). Luciferasereportergenet analysen ble gjennomført ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger.
Statistical Analysis
Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Statistisk signifikans ble vurdert ved å sammenligne middelverdier (± SD) ved hjelp av en student
t-
test for uavhengige grupper og ble antatt for
p
0,05 (*) og
p
. 0,01 (**)
Resultater
MiR-132 er ofte nedregulert med sterkt metastatisk lungekreft celler og vevsprøver
Vi evaluerte uttrykket av MIR-132 ved QRT-PCR i flere NSCLC cellelinjer med forskjellige metastaserende kapasitet. Vi fant at MIR-132 nivåer fremviste et varierende mønster i disse cellelinjene. Spesielt, uttrykket av MIR-132 i svært metastatisk L9981 og 95D celler ble dramatisk redusert, i forhold til at det i de tilsvarende dårlig metastatiske NL9980 eller 95C cellelinjer, henholdsvis (figur 1A). Videre, vi har oppdaget Mir-132 uttrykk i 45 paret klinisk primær lungekreft vev og metastatisk prøver lymfeknute kreft vev. Sammenlignet med sine primære kolleger, lymfe metastatisk vevsprøver næret en betydelig lavere Mir-132 nivåer (figur 1B,
P
0,001, student
t
-test). Også analysen på clinicopathological funksjoner hos pasienter med NSCLC viste at uttrykket av MIR-132 hadde en signifikant sammenheng med lymfeknute status (tabell 1,
P
= 0,011). Disse data indikerer at den reduserte ekspresjon av mir-132 er en hyppig hendelse i høyt metastatisk NSCLC-celler og vev, noe som kan være involvert i metastasen av humane lungekreftceller.
(A) De relative mRNA-nivåer av MIR-132 ble oppdaget av QRT-PCR og normalisert mot en endogen kontroll (U6 RNA) i flere lungekreft cellelinjer med distinkte metastatisk evne. Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter (**
P
0,01, Student
t Anmeldelser – test). (B) QRT-PCR analyse av Mir-132 uttrykk i 45 par av primære NSCLC vev og deres tilhørende lymfeknutemetastaser. MiR-132 uttrykk i de to typer vev ble sammenlignet ved hjelp av Wilcoxon signed-rank test (***
P
0,001, Student
t Anmeldelser – test).
MiR-132 er stand til å hemme Migrasjon og invasjon av NSCLC celler in vitro
Deretter testet vi den funksjonelle betydningen av MIR-132 i NSCLC celler. Sårheling analyse viste at ektopisk ekspresjon av MIR-132 i L9981 eller A549 lungekreftceller i betydelig grad hemmet cellemigrering, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2A). I tillegg utførte vi Boyden kammeret analysen å undersøke effekten av MIR-132 på celle invasjon. Som vist i figur 2B og 2C, når transfektert med pcDNA3.1-MIR-132 plasmider, invasjonen evne til A549-celler som oppviste en over-tre gangers økning, sammenlignet med kontrollgruppen. Men cellene viste en økt invasjon ved behandling av MIR-132 inhibitor (figur 2B, 2C). I tillegg ble det parallelle resultater observert i 95D og L9981 cellelinjer (figur 2C). Til sammen dataene sterkt at MIR-132 er i stand til å undertrykke migrasjon og invasjon av NSCLC celler
in vitro
.
(A) sårtilheling eller ble brukt til å oppdaget migrasjon evnen til L9981 og A549-celler, respektivt. (B, C) Boyden kammer analysen ble anvendt for å undersøke den invasjon evne til 95D, L9981, og A549-celler, respektivt. Resultatene var fra tre uavhengige forsøk (*
P
0,05, **
P
0,01, Student
t Anmeldelser – test). Den vandrende celle nummer i hver gruppe ble normalisert til kontrollen. Cellene ble transfektert med pcDNA3.1 (NC) eller pcDNA3.1-MIR-132 (MIR-132) konstruerer, og MIR-132 inhibitor (anti-MIR-132) eller hemmer kontroll (anti-MIR-NC). Trekk A549 celler i nedre kammer fra en eksperiment ble vist i B.
MiR-132 Hemmer Direkte uttrykk for ZEB2 gjennom sin 3’UTR og Regulerer EMT av NSCLC Cells
for å oppdage den molekylære mekanismen som MIR-132 undertrykker metastasering av lungekreft celler, spådde vi de antatte målgener av MIR-132 i humane celler ved hjelp av verktøyet
Miranda
,
PicTar
og
TargetScans
. Blant de antatte kandidatene, ZEB2 var av interesse i denne studien, med tanke på de viktige rollene ZEB2 i utvikling av kreft hos mennesker [14], [15]. For å teste hvorvidt MIR-132 direkte rettet mot ZEB2 (figur 3A), villtype eller mutant 3 «UTR-sekvens av ZEB2 ble klonet inn pMIR reporter vektor, henholdsvis, som vist i figur 3B. Luciferaseaktiviteten av pMIR- ZEB2 3 «UTR-wt-konstruksjonen var betydelig redusert ved over-ekspresjon av MIR-132 i NL9980 celler, mens dens motstykke mutanten var ikke (figur 3C). Av notatet, ble mRNA eller protein nivåer av ZEB2 i L9981 eller 95D celler dramatisk redusert ved MIR-132, henholdsvis (figur 3D, 3E og 3F). Det er rapportert at ZEB2 er en vital EMT induser gjennom undertrykke E-cadherin eller induserende vimentin-ekspresjon i humane kreft [16], [19]. For ytterligere å bekrefte at ZEB2 fungerer som et mål på MIR-132, ser vi effekten av MIR-132 på de to nedstrøms effektorer av ZEB2 av Western blot. Som vist på figur 3E og 3F, EMT maker E-cadherin eller vimentin var dramatisk oppregulert eller nedregulert ved overekspresjon av MIR-132 i både L9981 og 95D celler. Samlet utgjør disse dataene indikerer at MIR-132 direkte hemmer ZEB2 uttrykk
via
målretting sin 3 «UTR og induserer EMT av NSCLC celler.
(A) Mir-132 bindingssetet spådde i den 3’UTR av ZEB2 mRNA. (B) Mutant ble generert ved frø-regionen i ZEB2 3 «UTR som angitt ved understreking. En 3 «UTR-fragment av ZEB2 mRNA inneholdende villtype eller mutant av den MIR-132 bindende sekvens ble klonet inn i nedstrøms av luciferasegenet i pMIR vektor. (C) L9981 celler ble transfektert med pMIR reporter vektorer som inneholder enten villtype eller mutant ZEB2 3’UTR (angitt som pMIR-ZEB2-3 «UTR-wt og pMIR-ZEB2-3» UTR-mut) med enten pcDNA3.1 (angitt som NC) eller pcDNA3.1-MIR-132 vektor (indikert som MIR-132). Luciferase-aktiviteten ble bestemt 48 timer etter transfeksjon. (D) ZEB2 mRNA ble oppdaget av QRT-PCR i cellelinjer transfektert med pcDNA3.1 (angitt som NC) eller pcDNA3.1-MIR-132 vektor (indikert som MIR-132). (E, F) Protein nivåene av ZEB2, E-cadherin eller vimentin ble undersøkt ved Western blot i celler transfektert med forskjellige plasmider. Figur F viser de relative grå verdier av hvert bånd (normalisert til p-aktin). Protein band fra tre uavhengige Western blot analyser ble kvantifisert ved hjelp Antall Én programvare (Bio-Rad, USA). Data er rapportert som gjennomsnitt ± SD (**
P
0,01, Student
t Anmeldelser – test).
ZEB2 Bidrar til Mir-132- Trykt migrasjon og invasjon av NSCLC Cells
Deretter undersøkte vi mRNA eller protein uttrykk for ZEB2 i flere NSCLC celler, samt 45 tilfeller av primær lungekreft vev og metastatisk lymfeknute vev. Dataene viste at proteinnivået av ZEB2 i høyt metastatisk L9981 eller 95D-celler var markert opp-regulert, sammenlignet med dårlig metastatisk NL9980 eller 95C-celler, respektivt (figur 4A). Dessuten ble det samme resultat om mRNA-nivåene av ZEB2 observert i pasienter med metastatisk lymfeknute vev, sammenlignet med de primære lungekreft vev (Figur 4B). Av notatet, vises uttrykk for ZEB2 en omvendt korrelasjon med MIR-132-nivå i NSCLC vev (Figur 4C). Deretter undersøkte vi om ZEB2 er medvirkende til migrasjon og invasjon av NSCLC celler. Ektopisk ekspresjon av ZEB2 i NL9980 eller 95C-celler i betydelig grad forbedret celle invasjon (figur 4D), imidlertid, tie ZEB2 ved sirnas i L9981-celler resulterte i redusert migrering og invasjon Evnen som celler (figur 4E, 4F), avsløre sine positive roller i bidraget fra NSCLC celle migrasjon og invasjon. I mellomtiden ble transfektere eller lyddemping effektivitet av ZEB2 i cellene påvises ved Western blot (Figur 4D og 4F,
lavere
). Da vi åpnet om den funksjonelle effekten av MIR-132 på NSCLC celler var avhengig ZEB2. Som vist i figur 4G og 4H, innføring av anti-MIR-132 i NL9980 celler førte til en økning av celle migrasjon og invasjon, mens stillhet ZEB2 av siRNAs delvis avskaffet ekstrautstyr. Parallelt ble proteinnivået av ZEB2 bekreftet ved Western blot (Figur 4 H,
lavere
). Sammen er disse resultatene antydet at ZEB2 fungerer som et mål for MIR-132, som er ansvarlig for MIR-132-medierte regulering av migrering og invasjon av NSCLC-celler.
(A) Ekspresjon av ZEB2 ble undersøkt ved Western blot i NSCLC celler. (B) De relative mRNA-nivåer av ZEB2 ble påvist i 45 sammenkoblede NSCLC-primær tumor vev og deres lymfeknutemetastase motstykker. ZEB2 uttrykk i de vev ble sammenlignet ved hjelp av Wilcoxon signed-rank test (***
P
0,001, Students t- test). (C) Inverse sammenheng mellom MIR-132 og ZEB2 uttrykk i NSCLC vev. ZEB2 ekspresjon ble analysert ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH. Mir-132 uttrykk ble oppdaget av QRT-PCR-analyse og normalisert til U6 uttrykk. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Pearsons korrelasjonskoeffisient (r = -0,68, ***
P
0,001). (D) Den celle invasjon ble påvist ved Boyden kammer analyse i NL9980 eller 95C-celler transfektert med pCMV eller pCMV-vektorer ZEB2, respektivt. (E, F) Effekten av ZEB2 knockdown på cellemigrasjon eller invasjon ble bedømt ved sårheling eller Boyden kammer assay, henholdsvis (**
P
0,01, Student «s
t
– test). I tillegg ble taushet effektiviteten av ZEB2 av siRNA undersøkt med Western blot. (G, H) for sårheling eller Boyden kammer analyse ble anvendt for å detektere overførings eller invasjon evne NL9980 celler med forskjellige behandlinger, henholdsvis (*
P
0,05, **
P
0,01, Student
t Anmeldelser – test). I tillegg ble taushet effektiviteten av ZEB2 av siRNA undersøkt med Western blot.
Diskusjoner
Vår gruppe har vært fokus på den molekylære mekanismen for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) utvikling de siste årene, spesielt viet til etterforskningen av NSCLC metastaser. Mirnas er involvert i patogenesen NSCLC og deres ekspresjon profilene har blitt brukt til å klassifisere kreft [25], [26], [27]. Derfor forventet vi at dyregulation av metastaserelaterte microRNAs kan lette avansert fremdriften av NSCLC. Miao LJ,
et
,
al.
Fant at Mir-449c kan hemme invasjonen av NSCLC celler ved å målrette c-myc mRNA [28]. Også Boning Liu,
et al.
Rapporterte at Mir-26a kan fremme metastasering av lungekreft celler gjennom aktivering AKT ved å målrette PTEN [29]. MiR-132, som følge av MIR-212/132 klynge [30], har dokumentert roller i markedsføringen av kreft i bukspyttkjertelen utvikling
via
aktivere AKT signalveien [31]. Men potensialet funksjonen til dette mikroRNA i human NSCLC progresjon har noen rapporter. I denne studien, er vi interessert i den potensielle rolle MIR-132 i den metastaser fra NSCLC celler.
I denne studien fant vi at MIR-132 var ofte nedregulert i svært metastatisk NSCLC cellelinjer og vevsprøver. Dermed antok vi at MIR-132 kan være en roman tumor suppressor miRNA og dens dyregulation kan innebære avanserte fremdriften av kreft hos mennesker. Dessuten, i den innledende tumorgenese, Shuyu Zhang og kollega funnet at MIR-132 som utøves på lave nivåer i primærsvulster i bukspyttkjertelen, og kan være assosiert med tidlig utvikling av human kreft i bukspyttkjertelen [13]. Men den potensielle rolle MIR-132 i den tidlige utviklingen av NSCLC må fortsatt undersøkes nærmere. For mekanismen involverer MIR-132 nedregulering, Shuyu Zhang,
et al.
Rapporterte at hyper-metylering i promotorområdet var ansvarlig for redusert uttrykk av MIR-132 [13]. Følgelig spekulerte vi at dette DNA modifikasjon kan føre til endring av MIR-132 uttrykk i menneskelig NSCLC.
Deretter undersøkte vi funksjonen til MIR-132 i NSCLC. Våre data viser at gjeninnføring av 132 dramatisk trykt cellen migrasjon og invasjon av NSCLC celler
in vitro
. Derfor våre data antydet at redusert uttrykk av MIR-132 kan bidra til metastasering av kreft celler og dermed legge til rette for avansert utvikling av kreft hos mennesker som NSCLC. Vi har videre karakterisert ZEB2 som et funksjonelt mål på MIR-132 ved luciferasereportergenet analyser, RT-PCR og Western blot-analyse, henholdsvis. ZEB2 /SIP1, som et medlem av deltaEF-en familie på to-handed sink-finger faktorer, ofte uttrykt i en rekke menneskelige kreft, inkludert bukspyttkjertelen [31], bryst [32], mage [33], [34 ], nedsatt [35], hode og nakke [36], gliom [37], hepatocellulær [38], eggstokkene [39], plateepitel og ikke-småcellet karsinom [14], [15]. Den viktige rollen som transkripsjonsfaktor ZEB2 har vært sterkt understreket i en rekke papirer, på grunn av sin funksjon å indusere epithelial- mesenchymale overgang (EMT) og lette metastase av kreftceller [37], [40], [41]. For eksempel, Nam EH,
et al
. rapportert at ZEB2 kan indusere EMT og invasjon av menneskelige kreftceller
via
spesifikt undertrykker uttrykk for E-cateherin og opp regulerende vimentin uttrykk [42]. I tillegg Cong N og hans kollega fant at nedregulert mikroRNA-200 familien var i stand til å fremme EMT gjennom Wnt /β-catenin veien ved å målrette E-cadherin repressors ZEB1 /ZEB2 i adenokarsinom i ventrikkel [33]. I denne studien fant vi at ZEB2 hadde ofte høy uttrykk i metastatisk NSCLC celler og kliniske lymfeknute vev. Og ZEB2 var ansvarlig for MIR-132-modulert migrasjon og invasjon av NSCLC celler. Spesielt, observerte vi at E-cadherin eller vimentin, nedstrøms effektor av ZEB2, ble også nedregulert eller oppregulert ved MIR-132, noe som indikerer at MIR-132 kan utøve funksjoner i migrasjon og invasjon av NSCLC cellene gjennom moduler EMT. Disse
in vitro
data underforståtte nødvendig bidrag svekket MIR-132 for å fremme celle metastaser i kreft. Nyere studier avdekket en mesenchymal- epitel overgang (MET) i metastaser som tillot etablering av kreftceller i et avsidesliggende område [43]. Men den potensielle rolle MIR-132 i denne prosessen må fortsatt bli nærmere belyst.
I sammendraget, vi undersøkte rollen MIR-132 i NSCLC utvikling. Våre funn tyder på at Mir-132 kan være en roman tumor suppressor miRNA. MiR-132 blokkerer migrasjon og invasjon av NSCLC celler gjennom målretting EMT regulator ZEB2. Våre data gir ny innsikt i mekanismen ansvarlig for utviklingen av menneskets NSCLC. I tillegg kan MIR-132 fungerer som en potensiell terapeutisk kandidat i behandling av NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primere som brukes i papir var oppført
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091827.s001 plakater (DOC)
