Abstract
YM155, som inhiberer anti-apoptotiske protein Survivin, er kjent for å utøve anti-tumoreffekter i ulike kreftformer, inkludert prostata og lungekreft. Men det er få rapporter som beskriver den hemmende effekten av YM155 på menneskelige bukspyttkjertel kreft som sterkt uttrykker Survivin. Her, testet vi effektene av YM155 på en rekke forskjellige kreftcellelinjer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi fant at YM155 utøver en anti-proliferativ effekt i kreft i bukspyttkjertelen celler, indusering av celledød ved undertrykkelse av XIAP (X-bundet inhibitor av apoptose) samt Survivin uten at det påvirker den anti-apoptotiske proteiner Bcl-XL eller MCL-1. YM155 også hemmet tumorvekst
in vivo
, å redusere størrelsen på bukspyttkjertelkreft cellelinje MIAPaCa-2-xenografter med 77,1% på dag 31. Western-blot-analyser viste at det ytterligere YM155 downregulated phosphoinoside 3-kinase (PI3K) og ekspresjon reduserte nivået av fosforylert (aktivert) ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) og STAT3 (signal transduser og aktivator av transkripsjon 3) i PANC-1-celler. Interessant nok har vi funnet at også YM155 downregulated den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) i forskjellige kreftcellelinjer og indusert EGFR fosforylering og ubiquitinering av EGFR i PANC-1-celler. YM155 også beskjedent fremmet ubiquitinering av survivin og XIAP. Derfor virker YM155 gjennom modulering av EGFR og survivin uttrykk for deretter å redusere overlevelse. Vi foreslår at YM155 har potensial som et terapeutisk middel i behandlingen av kreft i bukspyttkjertelen
Citation:. Na Y-S, Yang S-J, Kim S-M, Jung K-A, Moon J-H, Shin J-S, et al. (2012) YM155 Induserer EGFR Suppression i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 7 (6): e38625. doi: 10,1371 /journal.pone.0038625
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 10 november 2011; Godkjent: 12 mai 2012; Publisert: 18 juni 2012
Copyright: © 2012 Na et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Korea Helse 21 R D Prosjekt, helse-, velferd og familieetaten, republikken Korea (A062254). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært aggressiv ondartet sykdom. Til tross for terapeutiske fremskritt, prognosen for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er svært dårlig. Den dårlig prognose av kreft i bukspyttkjertelen pasienter skyldes tendensen av denne kreftformen å respondere dårlig på kjemoterapi. Selv om nukleosid-analog gemcitabin er for tiden den standard kjemoterapeutiske middel som anvendes i kreft i bukspyttkjertelen, er dens overlevelse fordel utilfredsstillende og nye terapeutiske midler er et desperat behov for [1].
overekspresjon av Survivin, den minste (16,5 kDa) av inhibitoren av apoptose (IAP) familie av proteiner, er blitt rapportert å være viktig for utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen [2], [3]. Survivin inneholder et enkelt baculovirus IAP repeat (BIR) og samhandler med kromosompassasjer proteiner, NES (nestin), aurora kinase B, SMAC /DIABLO, CDK1 (cyclin-avhengig kinase 1), PKA (protein kinase A), XIAP og varme sjokkprotein (HSP) -90 [2], [3]. Survivin lokaliserer til cytoplasma, mitokondrier og kjerner, og uttrykkes ubikvitært i embryonale stadier, men ikke påvises i normale terminalt differensierte voksent vev [2], [3]. Patologisk er Survivin uttrykt i mange humane kreftformer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [2], [3]. Som Survivin er sterkt uttrykt i pankreatiske tumorvevet, men ikke i normale pankreatiske vev, er det et attraktivt mål for legemiddelutvikling mot kreft i bukspyttkjertel [4].
YM155, et lite molekyl inhibitor av Survivin utviklet av Astellas Pharma , Inc. som for tiden er under kliniske studier, undertrykker trans av survivin gjennom direkte binding til sin promoter [5]. YM155 er undersøkt i ulike kreftcelletyper, inkludert melanomer og lymfomer, samt prostata, lunge og bryst kreft [6]. Xenograft-modeller har også vist anticancer effekt av YM155 i kombinasjon med platinaforbindelser [7] eller docetaxel [8], så vel som monoterapi i [9].
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som blir overuttrykt i en rekke kreftformer og har vært undersøkt i forbindelse med kreft prognose [10], [11], [12], er kjent for å være en viktig faktor i bukspyttkjertelkreft progresjon [13]. Binding av en ligand til EGFR fremmer konformasjonsendringer som induserer dimerisering reseptoren, noe som resulterer i autofosforylering tyrosin og reseptoraktivering. De aktiverte EGFR signaler gjennom fosforylerte tyrosinrester for å stimulere multiple veier, inkludert mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt, signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon (STAT), fosfolipase C, og Src /fokal vedheft kinase (SRC /FAK) veier. Aktivering av EGFR-signalering spiller en viktig rolle i å fremme spredning og overlevelse; omvendt, avbrudd av EGFR fremmer apoptose. EGFR-målrettet terapi, slik som erlotinib, har blitt utviklet for behandling av bukspyttkjertelkreft.
YM155 har vist antitumor aktivitet i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [14]. Videre, i brystkreftceller, Survivin uttrykk er blitt rapportert å være regulert av EGFR via PI3K /AKT veien, en annen viktig vei i bukspyttkjertel kreft [15]. Derfor virker det mulig å ha effekt av YM155 på EGFR og dens nedstrøms signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler fordi survivin er regulert med EGFR.
I denne studien har vi evaluert kreft effekter av YM155 i bukspyttkjertelen kreftcellelinjer og xenografter. I tillegg, undersøkte vi effekten av YM155 på EGFR, PI3K, ERK, og STAT3 uttrykk for å bestemme hvorvidt YM155 påvirker EGFR /PI3K /STAT3 veier. Vi undersøkte også effekten av YM155 på uttrykk for andre medlemmer av IAP familien beslektet med anti-apoptotiske og pro-apoptotiske proteiner i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer.
Resultater
Bukspyttkjertelkreftceller er følsomme for YM155
for å undersøke anti-proliferative kapasitet på YM155 i ulike kreftcellelinjer, målte vi IC
50 verdier for YM155 i bukspyttkjertelen, mage, og kolorektal kreft celler (tabell 1 og tabell S1) . IC
50 verdier for YM155 i bukspyttkjertelen, mage, og kolorektal kreft cellelinjer var 3,7 til 30,3, 1,4 til 140,8, og 8,7 til 370,0 nM. Dermed er YM155 effektiv i bukspyttkjertelen, mage, og kolorektal kreft celler.
For å bestemme effekten av survivin inhibitor YM155 på uttrykk for survivin og XIAP, et annet medlem av IAP familie, vi utførte Western blotting i bukspyttkjertelen og magekreft cellelinjer (fig. 1A og S1 fig.). Ved høye konsentrasjoner, YM155 betydelig redusert ekspresjon av Survivin i PANC-1, MIAPaCa-2, BxPC-3, KATOIII, og MKN45 cellelinjer. YM155 var spesielt mer potente i PANC-1-celler, hvor det reduserte ekspresjon av Survivin ved en lav konsentrasjon (10 nM). YM155 også hemmet uttrykk for XIAP i bukspyttkjertelen og magekreft cellelinjer, med unntak av MKN45 celler; i disse cellene, YM155 hadde noen merkbar effekt på XIAP nivåer. I tråd med tidligere observasjoner [9], [16], viste YM155 liten effekt på uttrykk for IAP, cIAP1 og cIAP2 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (fig. S2).
A, konsentrasjonsavhengig virkningene av en 24-timers behandling med YM155 på uttrykk for survivin og XIAP i PANC-en, MIAPaCa-2, og BxPC-3 celler ble bestemt ved Western blotting. B, Virkningen av YM155 på ekspresjon av XIAP ble sammenlignet med den for Survivin knockdown ved Western blotting. PANC-1 celler ble behandlet med YM155 i 24 timer eller transfektert med 40 nM siRNA (siSurvivin, siXIAP, og egge siRNA) i 48 timer. *, Uspesifikke. C, konsentrasjonsavhengig effekt av YM155 på uttrykk for anti-apoptotisk (BCL-XL og Mcl-1) og pro-apoptotiske (Bud og dårlige) proteiner ble undersøkt i PANC-en, MIAPaCa-2, og BxPC-3 celler .
for å finne ut om YM155-indusert nedregulering av XIAP uttrykk skyldes redusert uttrykk for survivin, vi slått ned survivin i PANC-en med siRNA (siSurvivin) og vurderes XIAP uttrykk ved Western blotting (fig . 1B). Nivået av XIAP protein ble redusert til en større grad etter eksponering for 10 nM YM155 enn i celler transfektert med siSurvivin, noe som tyder på at den YM155-induserte reduksjon i XIAP nivåer forekommer ikke gjennom nedregulering av Survivin. Survivin har blitt rapportert å ha bindingssteder for XIAP [2]. For å undersøke effekten av YM155 på survivin-XIAP interaksjoner, immunopresipitert vi Survivin og deretter undersøkt immunpresipitatene ved Western blotting med et antistoff mot XIAP (Fig. S3). Behandling av PANC-1-celler med 100 nM YM155 i 6 timer hadde ingen effekt på nivåene av Survivin eller XIAP, men har litt inhibere interaksjonen av Survivin med XIAP, noe som tyder på at YM155 påvirker monteringen av Survivin-XIAP kompleks til en viss grad .
Vi undersøkte også effekten av YM155 på uttrykk for anti-apoptotiske og pro-apoptotiske proteiner i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (fig. 1C). Det var ingen endring i BCL-XL eller Mcl-1-nivåer etter behandling med YM155. YM155 induserte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i Bud, p-Bad, og dårlige nivåene i de fleste bukspyttkjertelen kreft cellelinjer; unntaket var Bud, som var upåvirket i BxPC-3 celler.
YM155 induserer nedregulering av PI3K, p-ERK, og p-STAT3
Fordi YM155 trykt XIAP uttrykk, undersøkte vi om YM155 påvirket uttrykk for andre signalkomponenter i kreft i bukspyttkjertelen celler. Behandling av HER2-overuttrykkende MCF7 celler med PI3K-inhibitor LY294002 eller ERK1 /2 inhibitor U0126 har blitt rapportert til å nedregulere Survivin [17]. En STAT3 inhibitor har også blitt rapportert å undertrykke Survivin uttrykk [18]. På grunnlag av disse rapportene, undersøkte vi effekten av YM155 på PI3K, ERK, og STAT3 i PANC-1-celler (fig. 2), som vi har funnet å være den mest YM155-følsomme av de pankreatiske cellelinjene som ble testet. Behandling av disse cellene med YM155 ved konsentrasjoner på 10 nM og nedsatt ovenfor PI3K (fig. 2A), p-ERK (Fig. 2B), og (2C fig.) P-STAT3 nivåer sammenlignet med de i siSurvivin-behandlede celler. Den PI3K-inhibitor LY294002 og MEK1 /2 inhibitoren AZD6244 ble anvendt som kontroller for å analysere nivåene av PI3K, fosforylert ERK og Survivin. Vi undersøkte også effekten av YM155 på ekspresjonen av det PI3K familiemedlemmer p110α, p110β, klasse III, P85, og p-P85 i PANC-1, MIAPaCa-2, og BxPC-3-celler, og fant at alle ble redusert med 100 nM YM155 i alle tre cellelinjer (fig. S4). Videre fosforylering av Akt, som er en nedstrøms effektor av PI3K, ble også redusert med YM155 (100 nM) i disse bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Akt er kjent for å fremme celleoverlevelse ved fosforylering av Bad [19], [20]. Derfor er en reduksjon i den fosforylerte form av Akt induserer en reduksjon i p-Bad, som vist i figur 1C, som resulterer i celledød.
A, ble nivåer av PI3K og Survivin analysert ved Western blotting etter behandling med YM155 eller 30 mikrometer LY294002 (kontroll) i 24 timer, og 48 timer etter transfeksjon med 40 nM siRNA. B, ble nivåer av fosforylert ERK og ekspresjon av Survivin bestemt ved Western blotting etter behandling i 24 timer med YM155 eller 500 ng av AZD6244 og 48 timer etter transfeksjon av 40 nM siRNA. C, nivåer av fosforylert STAT3 og uttrykk for survivin ble analysert ved Western blotting etter en 24-timers behandling med YM155 og 48 timer etter transfeksjon av 40 nM siRNA.
YM155 nedregulerer EGFR uttrykk
Fordi YM155 nedregulerer PI3K, p-ERK, og p-STAT3, som er nedstrømsmediatorer av EGFR-signalisering [21], [22], [23], analyserte vi hvorvidt YM155 påvirker ekspresjon av EGFR (fig. 3). Som forventet, behandling med EGF økt EGFR fosforylering. Interessant er imidlertid nivåene av p-EGFR så vel som total EGFR i PANC-1-celler ble signifikant redusert etter eksponering for YM155 i nærvær av EGF (fig. 3A). Disse resultatene tyder på at YM155 redusert p-EGFR-nivåer via en reduksjon i EGFR-nivåer. Cetuximab, anvendt som en positiv kontroll, også nedsatt p-EGFR i nærvær av EGF. En ytterligere analyse av virkningene av YM155 på EGFR-ekspresjon i forskjellige cancercellelinjer viste at YM155 induserte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i EGFR-nivåer i bukspyttkjertelen (PANC-1, MIAPaCa-2, og BxPC-3), kolorektal (HCT116), prostata (PC3), og lunge (H460) kreft cellelinjer; Lignende effekter ble observert i KATOIII magekreftcellene, men ikke i MKN45 magecancerceller (Fig. 3B og S5 fig.).
A, PANC-1-celler ble stimulert med 100 ng /ml EGF i 10 minutter før inkubering med eller uten YM155 i 6 timer. Cetuximab (CTX; 100 ng /ml i 1 time) ble anvendt som en kontroll. Nivåer av fosforylert (Y1068) EGFR og total EGFR ble analysert ved Western blotting. B, YM155 redusert ekspresjon av EGFR i en konsentrasjonsavhengig måte i PANC-1, MIAPaCa-2 (beskjæres blot, full-lengde blotter er presentert i figur S5a.), Og BxPC-3-celler. Forholdet mellom EGFR:actin uttrykk sammenlignet med kontrollgruppen er vist for hvert kjørefelt (ved hjelp av Multi-Gauge v2.3 programvare). C, Survivin og EGFR uttrykk ble påvist i subcellulære fraksjoner av PANC-1 celler ved Western blotting. Cytoplasmatisk (cytomegalovirus) og kjernefysiske (NU) fraksjoner ble isolert etter eksponering for YM155 i 24 timer. Aldolase (cytoplasma) og H3 (kjernekraft) fungerte som markører for renheten av subcellulære fraksjoner. Totalt lysatene (totalt) ble analysert samtidig. D, YM155 (10 nM) indusert atom EGFR akkumulering. PANC-1 celler ble farget med anti-EGFR, anti-Alexa Fluor 488, og DAPI etter YM155 behandling. Skala barer:. 10 mikrometer
Vi undersøkte effekten av YM155 på survivin og EGFR lokalisering ved å undersøke subcellulære fraksjonsnivå (Fig. 3C); YM155 redusert Survivin nivåer i både cytoplasmatiske og kjernefysiske fraksjoner av PANC-1 celler. EGFR nivåene ble redusert i den cytoplasmiske fraksjon, men EGFR akkumulert i atomfraksjonen. Den kjernefysiske EGFR opphopning indusert ved 10 nM YM155 ble bekreftet ved konfokal mikroskopi (fig. 3D). Fordi YM155 (10 nM) hadde ingen effekt på EGFR-nivåer i alt lysater, kan denne tilstanden gjenspeile nukleær translokasjon av EGFR. Sammen er disse dataene indikerer at YM155 reduserer nivåene av cytoplasma og kjernekraft Survivin, og foreslår at YM155 fremmer EGFR atomtrans.
YM155, som hemmer Survivin promoter aktivitet, induserer nedbrytning av EGFR, XIAP, og Survivin
for å avgjøre om EGFR er målet for YM155 handling, undersøkte vi effekten av YM155 på PANC-en celle levedyktighet etter siRNA-mediert knockdown av EGFR (fig. S6a). Western blotting viste at siSurvivin og siEGFR effektivt slått ned Survivin og EGFR, henholdsvis, slik som vist ved Western blotting, og prosentandelene av levedyktige celler var tilnærmet 66% og 75%, respektivt. Tillegg av YM155 redusert celle levedyktighet i survivin- eller EGFR-knockdown celler til en viss grad ligner den som ble observert i kontrollceller transfektert med egge siRNA. YM155 virker som en transkripsjonen inhibitor av Survivin, redusere Survivin promoteraktivitet i en konsentrasjonsavhengig måte i PANC-1-celler (Fig. S6B). På grunn av dette hemming av survivin transkripsjon, kan YM155 iverksettes lite påvirket av knockdown av survivin. Ved forlengelse, tilsvarende reduksjoner i celle levedyktighet ved YM155 observert i EGFR-knockdown og kontroll (kryptert siRNA) celler kan skyldes en reduksjon i survivin nivå ved YM155.
For å avgjøre om redusert nivå av EGFR etter YM155 behandling var på grunn av redusert produksjon eller økt nedbrytning, analyserte vi transkripsjonsnivåer ved hjelp av sanntids-RT-PCR (fig. 4A) og vurderes virkningen av YM155 på proteindegradering ved hjelp av proteinsynteseinhibitor cykloheksamid (fig. 4B) i PANC- 1 celler. Som forventet basert på dets hemmende effekt på Survivin promoteren, redusert YM155 Survivin transkripsjonsnivåer. Imidlertid ble XIAP transkripsjonsnivåer økes, en effekt som kan være en kompenserende reaksjon på reduksjonen i XIAP proteinnivåer. Nemlig å beskytte seg mot apoptose, celler kan oppregulere XIAP, kan en annen IAP protein, når Survivin uttrykk er redusert, men nedbrytning av XIAP protein ved YM155 føre til økt XIAP transkripsjon som en kompenserende mekanisme. EGFR transkripsjonsnivåer ble økt med 10 nM YM155 men ble redusert med 100 nM YM155. En analyse av endringer i proteinnivåer over tid i fravær av proteinsyntese (dvs. i nærvær av cykloheksimid) viste at Survivin, EGFR, og XIAP ble nedbrutt hurtigere i PANC-1-celler behandlet med YM155 enn i kontroll (cyclohexamide- only) celler. Virkningene av 100 nM YM155 på ekspresjon av Survivin, EGFR, og XIAP i PANC-1-celler over tid ble undersøkt (fig. S7). Den 8 t behandling betydelig redusert de Survivin nivåer. Derfor Survivin kan være en utløser for påfølgende apoptose. Sammen er disse analysene viser at YM155 redusert produksjon av survivin og EGFR (høy dose, 100 nM) og forbedret nedbrytningen av survivin, XIAP, og EGFR.
A, Etter behandling av Panc-1 celler med YM155 for 24 timer, survivin, ble EGFR, og XIAP mRNA nivåer fastsatt ved bruk av real-time RT-PCR. B, Survivin, EGFR, og XIAP nivåer i PANC-1-celler etter behandling med 50 pg /ml cykloheksimid (CHX) i fravær eller nærvær av 100 nM YM155 for de angitte perioder ble undersøkt ved Western blotting. Forholdet mellom Survivin, EGFR, eller XIAP:actin ekspresjon sammenlignet med kontrollgruppen er vist for hver kjørebane. *, Uspesifikke.
YM155 induserer EGFR fosforylering, og ubiquitinering av EGFR
For å avgjøre om YM155 effekter på EGFR, XIAP, og Survivin degradering var proteasome-, lysosome-, eller caspase -avhengig, utførte vi Western blotting i PANC-1-celler etter behandling med proteasominhibitor MG132, lysosomet inhibitor klorokin, eller den kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK (fig. 5A). Tilsetning av klorokin til YM155-behandlede PANC-1-celler avstumpet reduksjonen av EGFR, XIAP, og Survivin nivåer, mens MG132 og Z-VAD-FMK var ineffektiv, noe som tyder på at den kortere halveringstiden for disse proteinene i nærvær av YM155 var relatert til økt lysosomal degradering. Lignende resultater ble observert i MIAPaCa-2-celler (Fig. S8). Vi neste fastslått hvorvidt YM155-indusert, ble lysosome avhengig nedbrytning forbundet med ubiquitinering av EGFR, XIAP, og Survivin (Fig. 5B). Immunoutfellingsstudier eksperimenter viste en klar økning i ubiquitinmolekyler EGFR etter behandling med YM155 (100 nM) i 6 timer, og en beskjeden økning i survivin og XIAP ubiquitinering. Derfor YM155 induserer ubiquitinering av EGFR, Survivin, og XIAP.
A, YM155 indusert lysosomal degradering av EGFR, XIAP, og Survivin i PANC-1 celler. PANC-1-cellene ble behandlet med 100 nM YM155 (YM), 10 uM MG-132 (MG), 50 uM klorokin (CQ), eller 30 pM Z-VAD-FMK (Z-VAD) uten eller med YM155 i 24 timer . Ekspresjonsproduktene prosenter av EGFR, XIAP, eller Survivin til aktin sammenlignet med kontrollgruppen er vist for hver kjørebane. ctrl, kontroll; M + Y, MG-132 + YM155; C + Y, klorokin + YM155; Z + Y, Z-VAD-FMK + YM155. B, PANC-1-celler behandlet med 100 nM YM155 i 6 timer ble immunoutfelt (IP) med antistoffer mot EGFR, Survivin eller XIAP, og analysert ved hjelp av Western blotting for ubiquitin. C, Tids løpet av EGFR fosforylering på Y1045 i Panc-1 celler etter behandling med YM155 (100 nM) blir vist.
Y1045-fosforylert form av EGFR er kjent for å samhandle med E3 ubiquitin-protein ligase c-CBL, som retter seg mot EGFR til lysosomet for påfølgende degradering [24]. Fordi YM155 indusert EGFR ubiquitinering, undersøkte vi fosforyleringen av EGFR som en funksjon av tiden etter behandling med YM155 ved sentret for pY1045-EGFR ved hjelp av Western blotting (fig. 5C). Disse eksperimentene viste en klar nedgang i pY1045-EGFR etter eksponering for YM155 i 105 minutter eller mer. Disse resultatene tyder på at YM155 modulerer Y1045-phosporylation av EGFR.
YM155 utstilt anti-tumor effekter mot kreft i bukspyttkjertelen
in vivo
For å evaluere anti-tumor effekter av YM155 på bukspyttkjertelkreft
in vivo
, benyttet vi en MIAPaCa-2 bukspyttkjertelcellelinje xenograft tumormodell, måle tumorvolumet og kroppsvekt (fig. 6A og 6B). I MIAPaCa-2 xenografter, ble tumorvekst hemmet av 77,1% på dag 31 etter behandling med kontinuerlig infusjon av YM155 (p 0,001, YM155 vs. kjøretøy). Kroppsvekt var ikke signifikant forskjellig mellom ubehandlede og YM155-behandlede grupper. YM155-behandlede gruppen på dag 31 hadde mindre tumor vekter enn bilens-behandlede dyr (Fig. 6C). YM155 indusert nedregulering av EGFR, Survivin, og XIAP uttrykk i xenograft tumorer (fig. 6D). Disse resultatene indikerer at YM155 utøver en signifikant anti-tumor effekt mot kreft i bukspyttkjertelen
in vivo
.
Effekter av YM155 på tumorvekst (A) og kroppsvekt (B)
in vivo
ble evaluert i MIAPaCa-2-xenotransplantater (kjøretøy, n = 6; YM155, n = 8). Tumorvolumet ble bestemt ved de indikerte tidspunkter etter begynnelsen av behandlingen. YM155 ble administrert ved dose på 50 mg /kg.
in vivo
eksperimentell plan YM155 er indikert på bunnen av hver graf. Dag 0 angir det tidspunkt ved hvilket subkutane tumorer nådde en størrelse på 100 mm
3 og administrering av YM155 ble startet. Statistiske analyser av effektene av YM155 på tumorstørrelse ble utført ved hjelp av Mann-Whitney tester (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, YM155 vs. kjøretøy). C, er gjennomsnittlig tumor størrelser avbildet for hver gruppe på dag 31. D, Immunhistokjemisk analyser i xenografttumorer på dag 31 etter YM155 behandlingen ble utført ved hjelp av antistoffer mot EGFR, Survivin, og XIAP og farget med H . E
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi effekten av survivin inhibitor YM155 på survivin, XIAP, og EGFR uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. Våre data viser at YM155 påvirker ekspresjon av både EGFR og Survivin og derved reduserer overlevelse. Selv om tidligere studier har antydet at YM155 spesifikt blokkerer survivin uttrykk i prostatakreftceller og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler uten å påvirke andre proteiner [9], [16], våre data fra bukspyttkjertelen og magekreftceller unntatt MKN45 celler foreslå noe annet. Men, som dens virkninger i prostata kreft eller NSCLC celler, YM155 effekter på XIAP uttrykk i MKN45 celler ble nesten ikke oppdaget. En slik celle-type differensial uttrykk for noen proteiner kan reflektere celle linjer konkrete reaksjoner fra bukspyttkjertelen eller magekreftceller til YM155. I tråd med tidligere observasjoner, fant vi at PANC-1 celler var mest utsatt for YM155 blant bukspyttkjertelkreft cellelinjer [6]. PANC-1 celler er kjent for å uttrykke høyere survivin mRNA nivåer enn de andre to bukspyttkjertelkreft cellelinjer [25]. Buck et al. rapporterte at EGFR-ekspresjonsnivået er høyere i PANC-1-celler enn i MiaPaCa-2-celler [25]. PANC-1-celler som uttrykker høye nivåer av total og aktivert AKT har blitt rapportert å utvise signifikant cellesyklus og apoptose når PI3K /AKT hemmes, i sammenligning med de andre to bukspyttkjertelcancercellelinjer [26], [27]. PI3K /AKT er regulert av EGFR [28]. Derfor kan effekten av YM155 på EGFR i PANC-1-celler være forbundet med AKT. I tillegg kan den høye uttrykk for survivin og EGFR være cytoprotective og korrelerer med YM155 mottakelighet. Det er imidlertid videre studier for å undersøke hvorvidt følsomhet av celler til YM155 er forbundet med celle-linjer spesifikke endringer i gener så som EGFR eller Survivin. I denne studien har vi vist at YM155 hemmer tumorvekst i MIAPaCa-2 xenografter Derfor er kombinasjonen av YM155 med gemcitabin er også verdig etterforskning i bukspyttkjertelkreft.
YM155 gjennomgår for tiden kliniske studier [29]. Fase II-studier av YM155 foreslo aktivitet og toleranse hos pasienter med føflekkreft og avansert ildfast ikke-småcellet lungekreft [30], [31]. De YM155 doser som ble testet i prekliniske stadier ved bestemmelse av den maksimalt tolererte dose (MTD) eller farmakokinetiske studier er gjeldende for de kliniske omgivelser. En klinisk studie kan utformes på bakgrunn av
in vitro Hotell og
in vivo
effekt av YM155. Basert på våre prekliniske data, er YM155 verdt å undersøke nærmere hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
I vår studie YM155 ikke endre BCL-XL eller Mcl-1-nivå. Resultatene for BCL-XL var i tråd med tidligere observasjoner [9], mens de for Mcl-en var i kontrast med de av en tidligere rapport [32]. Tang et al. rapporterte at YM155 nedregulerer Mcl-1 i forskjellige cancercelletyper, men ikke i bukspyttkjertelen kreftceller. Dette kan gjenspeile cellelinje-spesifikke responser av kreft i bukspyttkjertelen celler til YM155. Mens YM155 induserte en konsentrasjonsavhengig reduksjon i Bud, p-Bad, og dårlige nivåer i de fleste bukspyttkjertelkreft cellelinjer, Bud var upåvirket i BxPC-3 celler. Disse resultatene indikerer at YM155 påvirker apoptotiske proteiner nivåer, et resultat som står i motsetning til tidligere rapporter [9].
Forrige undersøkelse viste at en fosforylering av EGFR ble indusert ved ioniserende stråling i en ligand-uavhengig måte, og ioniserende stråling eller cisplatin uten EGF induserte EGFR transport inn i kjernen [33]. De viste at mekanismen for stråleindusert EGFR import inn i kjernen var assosiert med en karyopherin α. Men vi vet ikke den eksakte mekanismen for kjernefysisk translokasjon av EGFR av YM155 uten EGF ennå. Dermed er ytterligere studier for å finne ut mekanismen YM155 i kjernefysisk translokasjon av EGFR. Liccardi et al. rapporterte at nukleær translokasjon av EGFR er viktig i modulering av reparasjon av DNA-skade etter kjemoterapi [34]. I denne studien, 10 nM YM155 indusert kjernefysisk translokasjon av EGFR og økte EGFR transkripsjonsnivåer. EGFR translocates til kjernen, hvor EGFR kan aktivere gener assosiert med reparasjon som en transkripsjonsfaktor [35]. Imidlertid vil høyere konsentrasjoner av YM155 (100 nM) redusert EGFR transkripsjonsnivåer og forbedret EGFR degradering. Derfor, økt transkripsjon og translokasjon av EGFR ved lave konsentrasjoner (10 Nm) av YM155 kan beskytte celler fra apoptose, mens høye konsentrasjoner (100 nM) reduseres celleoverlevelse ved å redusere EGFR transkripsjon og økende EGFR degradering.
Levkowitz ET al. rapportert at binding av EGF til EGFR fører EGFR nedbrytning gjennom binding med c-CBL på pY1045-EGFR [36]. Ahsan et al. rapportert EGFR fosforylering, ubiquitinering og nedbrytning i cisplatin-indusert cytotoksisitet [37]. Pangbum et al rapporterte at sulindak metabolitt induserer også ubiquitinering av EGFR [38]. Tilsvarende fant vi at EGFR fosforylering, og EGFR ubiquitinering og degradering etter behandling med YM155 ble indusert. Det er imidlertid ytterligere forskning for å undersøke E3 ubiquitin ligase til YM155.
XIAP har blitt rapportert å indusere nedregulering av survivin gjennom XAF1 (XIAP forbundet faktor 1) [39]. XIAP har også blitt identifisert som en kofaktor Survivin ved inhibering av apoptose [40]. Survivin løslatt fra mitokondrier som svar på apoptotiske stimuli samhandler med XIAP gjennom en XIAP-bindingssete som tilsvarer Lys15-Met38, noe som resulterer i økt XIAP stabilitet mot ubiquitinering /proteasomal degradering og hemming av apoptose [41], [42]. Fosforylering av Survivin i cytoplasma hemmer sammensetning av Survivin-XIAP kompleks, avskaffe sin anti-apoptotiske funksjon [41]. Våre resultater viste at effekten av YM155 på XIAP uttrykk skilte seg i sammenheng med Survivin knockdown. YM155 induserte en økning i XIAP transkripsjonsnivåer og fremmet XIAP protein degradering. YM155 redusert samspillet av survivin med XIAP, litt forbedret ubiquitinering av XIAP, og indusert lysosomal degradering av XIAP. Derfor påvirker YM155 nedbrytning av XIAP samt Survivin, og griper med sammenstillingen av Survivin-XIAP kompleks. Den YM155-indusert reduksjon i XIAP nivåer er usannsynlig på grunn av en reduksjon i Survivin nivåer. I denne studien har vi ikke undersøke fosforylering av survivin av YM155 eller undersøke andre faktorer som kan påvirke survivin-XIAP kompleks. Følgelig bør ytterligere dybde mekanistiske studier på YM155 modulering av XIAP utføres.
I konklusjonen, fant vi at YM155, kjent som en survivin inhibitor, fremmer nedregulering av PI3K, p-ERK, og p-STAT3 gjennom nedbrytning av EGFR i kreft i bukspyttkjertelen celler. Våre data tyder på at YM155 har terapeutisk potensial i bukspyttkjertelkreft og gi støtte til klinisk utprøving av YM155 i denne sammenheng.
Materialer og Metoder
cellelinjer, forbindelser, plasmid, og antistoffer
den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc-1, MIAPaCa-2, og BxPC-3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USAA). YM155 ble hentet fra Hanmi Pharmaceuticals (Seoul, Korea). Andre reagenser brukt inkluderer LY294002 (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland), AZD6244 (Chemizon Korea), MG132 (Calbiochem), klorokin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Z-VAD-FMK (R Daewoong Pharmaceuticals, Korea), og cetuximab (Merck Korea). Primære antistoffer mot de følgende proteinene ble anvendt for Western blot-analyser: Survivin (Abcam, Cambridge, MA, USA); XIAP (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); ubiquitin og β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); EGFR, fosfor (P) -EGFR (Y1068, Y1045), BCL-XL, Mcl-en, Bud, p-Bad (S112), Bad, PI3K, ERK, p-ERK (T202 /Y204), STAT3, p- STAT3 (Y705), aldolase, og H3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA). Immunreaktive proteiner ble påvist ved anvendelse av arts egnede pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Noen materialer er beskrevet i materialer og metoder S1.
Celleviabilitet analyse og siRNA transfeksjon
Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av en Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan), ifølge produsentens instruksjoner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i duplikat. Femti prosent hemmende konsentrasjoner (IC
50s) ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego).
