Abstract
Forekomst av kreft stamceller (cscs) eller tumor initiere celler kan føre til kreft tilbakefall i en ettergivende celle-mikro samspill, fremme invasjon i glioblastom (GBM) og neuroblastom (NB). Ekstracellulære matriks (ECM) små leucine-rik proteoglykaner (SLRPs) spiller flere roller i vev homeostase ved ombygging den ekstracellulære matriks (ECM) komponenter og moduler intracellulære signalveier. På grunn av sine pan-hemmende egenskaper mot reseptor tyrosin kinaser (RTK), er SLRPs rapportert å utøve kreft effekter
in vitro Hotell og
in vivo
. Men deres roller ser ut til å være vev-spesifikke, og de er også involvert i kreftcellemigrasjon og narkotika motstand, banet vei til komplekse ulike scenarier. Målet med denne studien var å finne ut om SLRPs decorin (DCN) og lumican (LUM) er rekruttert i celle plastisitet og microenvironmental tilpasning av differensierte kreftceller indusert mot stilk-lignende fenotype. Flytende neurosfærer ble samlet ved å anvende CSC anrikningsmedium (neural stamcelle serumfritt medium, NSC SFM) til den etablerte SF-268 og SK-N-SH-kreft-cellelinjer, cellemodeller av GBM og NB, respektivt. I begge modellene ble observert den tidsavhengige synergis aktivering av DCN og LUM. Den høyeste DCN og LUM mRNA /protein uttrykk ble oppdaget etter celle eksponering for NSC SFM for 8/12 dager, vurderer disse cellene som SLRP-uttrykke (SLRP
+) CSC-aktig. Ultra avbildning viste den cellulære heterogenitet av både GBM og NB neurosfærer og identifisert de indre levende celler. Foreldrecellelinjer av både GBM og NB vokste bare i myk agar + NSC SFM, mens de sekundære Neurosfærene (stammer fra SLRP
+ t
8 CSC-lignende) viste lavere spredning priser enn primær neurosfærer. Interessant, SLRP
+ CSC-aktig fra GBM og NB Neurosfærene var resistente mot temozolomid (TMZ) ved konsentrasjoner 750 mikrometer. Våre resultater tyder på at GBM og NB CSC-lignende fremme aktivering av store mengder SLRP svar på CSC berikelse, samtidig anskaffe TMZ motstand, cellulær heterogenitet, og en hvilende fenotype, noe som tyder på en ny sentral rolle for SLRP i legemiddelresistens og celle plastisitet av CSC-lignende, slik at celleoverlevelse og ECM /nisje modulasjon potensial
Citation. Farace C, Oliver JA, Melguizo C, Alvarez P, Bandiera P, Rama AR, et al. (2015) Microenvironmental Modulation av decorin og Lumican i Temozolomide-Resistant Glioblastoma og Nevroblastom Cancer Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10,1371 /journal.pone.0134111
Redaktør: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Universitetet i Kreta, Hellas
mottatt: 28 april 2015; Godkjent: 06.07.2015; Publisert: 31.07.2015
Copyright: © 2015 Farace et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Fundació la Marató TV3, Prosjekt n ° 111431.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Glioblastoma (GBM) og neuroblastom (NB) er de mest vanlige og dødelige nervesystemet ondartet kreft hos voksne og pediatriske pasienter. Verdens helseorganisasjon anser GBM den mest aggressive astrocytom, og det kan utvikle seg til sekundær GBM fra lavgradige gliomer, eller
de novo
med rask progresjon til døden [1]. I motsetning til dette, NB oppstår hovedsakelig fra neural crest-celler som en nevroendokrine kreft i det sympatiske nervesystemet, og 60% av pediatriske pasienter viser metastatisk sykdom ved diagnose [2]. Selv temozolomid (TMZ) -en alkyleringsmiddel som induserer celledød av hele DNA alkylering /metylering i guaninrester-i kombinasjon med andre legemidler eller strålebehandling representerer en førstelinjebehandling øke total overlevelse (OS) av pasientene med GBM eller NB [ ,,,0],3, 4], medikamentresistens og progresjon av kreft er vanlig. Fordi GBM er meget inngripende i hjernen og NB en tendens til å invadere andre organer, forblir pasient OS dårlig ( 1,5 år i GBM-pasienter og 4 år i NB-pasienter). [5, 6]
Behandling svikt i kreftpasienter har tidligere vært knyttet til kreft stamcelle (CSC) subpopulasjoner, som sikrer opprettholdelse av kreft heterogenitet, og disse CSC subpopulasjoner er mer motstandsdyktig mot selektive legemidler gjennom flere felles trinn på selvfornyelse og differensiering [7-9]. Metastase og kreft tilbakefall er også knyttet til oppførselen til cscs, inkludert deres hvilende fenotype, vandrende evne, og unndragelse av immunsystemet [10]. Rikelig forskning tyder på at celler stilk-lignende celler er utstyrt med medfødt maskiner som beskytter dem fra radio /kjemoterapi [11, 12]. Dette innbefatter stilk-relaterte mekanismer, som for eksempel beskyttende celle nisjer og endringer i ekspresjonen av gener som er involvert i regulering av cellesyklusen, DNA-reparasjon, legemiddelmetabolisme, og medikament-utløps [13]. Den medikamentresistens og cellulær invasjon potensialet for cscs også øke ved den reversible epiteliale-til-mesenchymale fenotypisk overgang (EMT) [14, 15], som sammenfatter EMT i normal organogenese og utvikling [16, 17].
Flere microenvironmental signaler, herunder omorganisering av ekstracellulære matriks (ECM), hypoksi, og auto /paracrine faktorer kan avgjøre stilk og kreft celle skjebner [18-25], og utløse eller hemmer EMT prosesser [26, 27]. Derfor ECM glykoproteiner og proteoglykaner som er i stand til å modifisere både ECM miljø og intracellulære signalveier er av største viktighet i den kreft mikromiljøet [28-30]. De små leucine-rik proteoglykaner (SLRPs), deling strategisk konserverte domener, representerer et klart eksempel på ovennevnte konseptet. Den leucin-rik proteinkjerne (40-50 kDa) binder seg til en rekke vekstfaktorer (GF) og membranreseptorer, mens forgrening av glycosaminoglycanic sidekjeder er involvert i ECM-kollagen montering og også i membran reseptorbinding. Interessant, på tross av sine pan-hemmende egenskaper mot reseptor tyrosin kinaser (RTK) og kreft vekst trasé, «vokter fra matrix» decorin (DCN) og lumican (LUM) SLRPs kunne utøve kreft effekter
in vivo
og
in vitro product: [31-33]. Imidlertid har nyere studier belyse nylig identifiserte vevsspesifikke egenskapene til både DCN og LUM i normalt vev og i ondartet kreft mikromiljøet. Som rapportert av andre forfattere, delvis gliom inhibering av DCN i genterapi eksperimenter i rotter bringer med seg en markert reduksjon av microglial celler infiltrering [34], som kan påvirker kreft hemming
in vivo
. DCN øker også unndragelse av immunsystemet og muskel invasjon i prostata kreft
in vivo product: [35], og utøver uventede verne- og antiapoptotic effekter i glioma celle linjer under hypoksiske forhold [36]. I orale maligne squamous cell carcinoma-celler, den nukleære lokalisering av DCN synes å øke cellulær invasjon
via
atom epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) pathway [37, 38], mens i osteosarcom-celler, DCN-mediert vekst arrest unngås
via
langvarig aktivering av membran EGFR [39]. Klinisk DCN har vært foreslått som regulator av kjemoresistent mekanisme i munnhulen [40] og relatert til medikamentresistens og redusert overlevelse i GBM-pasienter [41]. I likhet med DCN er LUM rapportert å megle svulst undertrykkelse. Imidlertid er Lum uttrykt i høy grad pankreatiske cancere med en lav grad av differensiering [42] og i GBM pasienter, så vel. Lum også hemmer celleadhesjon og fremmer migrasjon av osteosarkom-celler ved å regulere den transformerende vekstfaktor β2 (TGF-β2) /SMAD2 sti [43], og et 70-kDa Lum proteoglykan synes å forbedre cancer celleproliferasjon og hemmer migreringen av bukspyttkjertel kreftceller. Videre sammen for å DCN, LUM ble oppregulert i cisplatin fast hode og nakke kreft celler [44].
Det er bemerkelsesverdig at SLRPs er uttrykt i stamcelle nisjer i kylling embryo [45], i cerebral endothelial -celler [46], i forløpere av forskjellige celletyper [47], og i et NB celle subpopulasjon svarer til nervevekst-faktor-mediert neurite vekst [48]. DCN stammer fra astrocytter hemmer også nevrale stamceller /stamceller differensiering mot et nevron lignende cellestruktur [49]. Å endre de mekaniske karakteristikker av tre-dimensjonale (3D) kollagen matriser, er SLRPs rekruttert i løpet av ontogenic (utviklings) EMT [50], celle forløper migrering og differensiering [51], og leging av sår /reparasjon av vev som svar på sentralnervesystemet skade og inflammasjon [52]. I denne sammenheng kan det tenkes at de små DCN og Lum proteoglykaner spille en rolle i biologi cscs i nervesystemet opprinnelse. For å oppnå dette, undersøkte vi involvering av DCN og LUM i GBM og NB CSC-lignende modeller, simulere fenomener av anker tap og avløsning av differensierte kreftceller som ligger til grunn EMT prosessen, og deres forhold til CSC-lignende oppførsel og celle respons til TMZ. I denne studien rapporterer vi for første gang den massive synergistisk uttrykk for DCN og LUM SLRPs i GBM og NB cellelinjer utsatt for flytende 3D neurosfære baserte CSC-lignende berikelse. Neurosfære mikrografer markere stammen lignende heterogenitet og celle polarisering av 3D NB og GBM modeller. Videre SLRP
+ NB og GBM CSC-lignende isolert fra neurosfærene viste lavere spredning priser, mindre apoptose, og økt resistens enn foreldrecellelinjer, noe som tyder på sentrale og synergi roller for DCN og LUM i TMZ motstand, overlevelse og vedlikehold av hvile, slow-sykling, CSC-lignende delpopulasjoner.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og CSC berikelse
i denne studien, to etablerte GBM og NB cellelinjer ble registrert. SK-N-SH cellelinje er en kommersiell epiteliale cellelinje opprinnelig stammer fra benmarg metastasering av en 4 år gammel kaukasisk kvinne lider med NB, og det ble tidligere beriket i CSC-aktig. I motsetning til dette er SF-268 en nonepithelial cellelinje avledet fra et høyverdig anaplastisk astrocytom, som aldri har vært brukt til CSC-lignende anrikning. Den etablerte SK-N-SH (fra American Type Culture Collection) og SF-268 kreftcellelinjer (vennlig levert av Instrumentation Scientific Center, Granada University) ble rutinemessig opprettholdt som heft kulturer (monolagene) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM ) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2. Konfluente celler ble løsnet i 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) -ethylenediaminetetraacetic eddiksyre (EDTA) ved 37 ° C i 10 min, vasket to ganger i PBS, og dyrket som monolag. CSC anrikning av kreftcellelinjer ble utført ved å generere neurosfærer i neurale stamcelleserumfritt medium (NSC SFM) [53, 54], inneholdende KnockOut DMEM /F12 pluss 20 pg /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), 20 ug /ml epidermal vekstfaktor, 1 × StemPro Neural Supplement (Invitrogen, Paisley, UK), 1% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin. NSC SFM ble erstattet hver 2 dager etter mild sentrifugering av neurosfærer.
RNA ekstraksjon og kvantitativ revers transkripsjon (QRT) -PCR
uttrykk for DCN og LUM mRNA ble vurdert i t
0 celler og neurosfærene etter 4 (t
4), 8 (t
8) og 12 dager (t
12) fra CSC berikelse. Foreldrecellelinjer i DMEM ble anvendt som kontroll (t
0). RNA ble ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, MD, USA) og kvantifisert med et Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, DE, USA). RNA (1 ug) fra hver prøve ble reversert transkribert med M-MLV revers transkriptase (Sigma, Italia), i henhold til produsentens anvisninger, og SYBR Green-baserte forsterkning (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble utført med CFX96 Fast -Tid PCR Detection System (Bio-Rad, Italia), som tidligere rapportert [55]. PCR sykkel program var: 50 ° C (2 min), 95 ° C (2 min), 42 sykluser: denaturering ved 95 ° C (30 s), annealing ved 56 ° C (30 e), og forlengelse ved 72 ° C (40 sek), fulgt av en smeltekurve analyse (område 56-95 ° C) med trinn på 0,5 ° C /5 s for å vurdere primer spesifisitet. Primersekvensene var: frem 5′-GGA CCG TTT CAA CAG AGA GG-3 «, reverse 5′-GAC CAC TCG AAG ATG GCA TT-3′ (DCN); frem 5»-TGG AGG TCA ATC AAC TTG AGA A-3 «, reverse 5′-CAA ACG CAA ATG CTT GAT CTT-3′ (LUM); fremover 5»-CAA GGA GTA AGA CCC CTG GAC-3 «, revers 5′-TCT ACA TGG CAA CTG TGA GGA G-3′ (glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase, GAPDH); fremover 5»-GGC ATC CTC ACC CTG AAT GA-3 «, revers 5′-AGG TGT GGT GCC AGA TTT TC-3» (β-actin, ACTB). Mål-transkripter var uavhengig er normalisert til GAPDH og ACTB (husholdningsgener), og RNA av de t
0-celler ble anvendt som kalibreringskontrollen. Resultatene ble uttrykt på en logaritmisk skala som fold endringer (FCS), med to
-ΔΔCt metode.
Western blotting
Hele proteinekstrakter ble oppnådd med puls sonication av mobilnettet pellets i 200 ul ekstraksjonsbuffer inneholdende 50 mM Trizma-base, 0,25 mM sukrose, 5 mM EDTA (pH 7,4), 0,5% Triton-X-100 og 1% protease inhibitor cocktail. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Bradford-metoden. Proteiner (50 ug) ble blandet 1: 1 med 2 x Laemmli-buffer, oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter, og fylt på en 12% denaturerende SDS-PAGE-gel med Kaleidoscope prestained standarder. Proteinene ble separert elektroforetisk på en konstant spenning (90 V) i 90 minutter og blottet på en 0,45 um nitrocellulosemembran i henhold semidry betingelser med Trans-Blot SD halvtørr elektroforetisk overføring Cell (Bio-Rad, Spania) i 25 minutter ved 200 mA. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i PBS, inkubert ved 4 ° C over natten med kanin polyklonalt anti-Lum-antistoff (fortynnet 1: 100; sc-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller mus monoklonalt anti-DCN -antistoff (1:50; sc-73896, Santa Cruz Biotechnology) i blokkeringsbuffer, vasket 4 ganger i vaskeoppløsning (0,1% Tween i PBS), inkubert ved romtemperatur i 1 time med det passende monoklonale pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1: 5000; Sigma Aldrich), og igjen vasket i vaskeoppløsning. Blottene ble påvist med ECL Western blotting Detection reagenser (Amersham, UK). Molecular Imager VersaDoc MP 4000-system (Bio-Rad, Hercules, CA) ble anvendt for visualisering kjemiluminescens. Blottene ble strippet og inkubert med monoklonalt anti-β-actin antistoff. (1: 30000, Sigma Aldrich) som lasting kontroll
soft agar kulturer
Cellelinjene ble dyrket i myk agar for å vurdere deres koloni eller neurosfære formasjon under forankringsuavhengig forhold, i DMEM eller NSC SFM. For å utforske spredning av SLRP
+ CSC-like etter CSC berikelse for 8 dager (t
8 CSC-aktig), sekundære Neurosfærene ble generert fra t
8 CSC-aktig. Kort fortalt ble StemPro Accutase celledissosiasjon Reagens (Invitrogen) pleide å distansere de t
8 neurosfærer. En trypanblått eksklusjon testen ble utført og 5 × 10
3 /ml celler ble samlet inn i 2 × DMEM eller NSC SFM. Cellene ble blandet 1: 1 med en forvarmet løsning inneholdende 0,6% ultrarent agarose i PBS (0,3% endelig agar konsentrasjon), sådd ut i triplikat i seks-brønners plater med 2 ml av størknet 0,6% bunnen agar, og inkubert i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO
2. De myke agar kulturer ble fotografert daglig under en invertert fase-kontrast mikroskop (Nikon Eclipse TE 2000-S).
Transmission og scanning elektronmikroskopi bildebehandling
Åtte-dag (t
8 ) neurosfærer ble oppsamlet, vasket i PBS og fiksert i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M PBS (pH 7,4) i 2 timer ved 4 ° C. De faste neurosfærer ble omhyggelig vasket fire ganger i PBS, postfiksert i 1% osmiumtetroksyd (OsO
4) i 0,1 M PBS i 1 time ved 4 ° C, og lagret i PBS ved 4 ° C inntil innebygging. Prøvene som benyttes for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) ble dehydrert i serie med økende konsentrasjoner aceton og innleiret i epoxy for ultratynn snitting ved 60 ° C natten over. De supertynne skiver skåret med en 8800 Ultratome (LKB, Bromma, Sverige) ble farget med 4% uranylacetat og føre citrate og vises på en Zeiss EM 109-902 transmisjonselektronmikroskop (Zeiss, Oberchochen Tyskland). For skanning elektronmikroskopi (SEM), ble postfiksert neurosfærene inkubert i ren heksametyldisilazan i 1 time ved 4 ° C, tørket i et kritisk punkt tørker (Polaron, Watford, UK), og metallisert på en S150A frese Coater (Edwards, Crawley, UK) for skanning i Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Nederland) eller DSM 962 SEM instrumenter (Zeiss, Oberchochen, Tyskland).
TMZ behandling og MTT analysen
enkeltceller fra monolagene og t
8 neurosfærer av begge cellelinjer ble oppsamlet som beskrevet ovenfor. Cellelevedyktigheten ble testet med Trypan blå eksklusjon, og 5 x 10
3-celler /brønn ble sådd ut i 96-brønners mikrotiterplater, i DMEM eller NSC SFM. Neste dag, ble mediet erstattet med friskt medium uten eller med ulike konsentrasjoner av TMZ (25-1500 mg /ml, Sigma, Madrid, Spania). DMSO ble inkludert som bilen kontroll. Hver tilstand ble testet i seks brønner. Tre dager senere ble mediet erstattet med friskt medium for å bevare TMZ aktivitet. Endepunktet av den TMZ behandlingen ble etablert på dag 6. Til slutt, en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) kolorimetrisk analyse ble utført (Sigma). I korthet, ble 20 ul av MTT /brønn tilsatt, og platene ble inkubert ved 37 ° C. Etter 4 timer ble mediet forsiktig fjernet og DMSO ble tilsatt for å oppløse formazanfremstilling salter. Reaksjonene ble målt med en Multiskan EX mikrofotometer (Thermo Scientific, Madrid, Spania) ved 570 nm. TMZ doserespons ble uttrykt som prosentandel (%) inhibering av celle metabolsk aktivitet i forhold til ubehandlede celler, og justert til bærerkontrollen. Hemmingen av cellevekst ved TMZ ble evaluert i fire eksperimenter.
Statistisk analyse
Students tohalede
t
test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellene i TMZ behandlingsresultater for SLRP
+ CSC-aktig og foreldrecellelinjer. Forskjellene i qPCR genekspresjon ble undersøkt med en-veis analyse av varians (ANOVA). Statistisk signifikans ble satt til p. 0,05
Resultater
DCN og LUM uttrykk under neurosfære baserte CSC berikelse
Neurosfærer av både SF-268 og SK-N-SH cellelinjer kjøpt vanlige 3D conformations som følge av vedvarende radial spredning av de fleste cellene, nådde 50 pm etter 4 dager (fig 1A). En QRT-PCR-analyse viste at DCN og Lum mRNA-ekspresjon, med unntak av Lum i SF-268 t
12, øker under CSC berikelse forhold i begge cellelinjer, som viser de høyeste DCN og Lum mRNA-ekspresjon verdier etter 8 dager (t
8). Sammenlignet med foreldrecellelinjer (t
0), og vurderer ACTB som husholdningsgenet, GBM CSC-lignende var mer anriket i LUM mRNA (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 11,00; t
8: 21,70; t
12: 9,51) enn i DCN mRNA (FC
DCN
= t
0: 1 ; t
4: 6.32; t
8: 17,87; t
12: 11,08) (p 0,01). Tilsvarende NB CSC-lignende viste høyere LUM mRNA nivåer (FC
Lum
= t
0: 1; t
4: 29,04; t
8: 105,78; t
12: 60,12) enn DCN mRNA nivåer (FC
DCN
= t
0: 1; t
4: 23,02; t
8: 80,44; t
12: 40,22) (p 0,01; fig 1B)
(A) neurosfære generasjon fra SF-268 og SK-N-SH cellelinjer.. Bar, 50 mikrometer. (B) Uttrykk for DCN og LUM mRNA i CSC berikelse kulturer. QRT-PCR resultatene var normalisert til ACTB og tegnes som relative fold endringer (FCS) mellom Neurosfærene på ulike tidspunkter (t4, t8, og T12) og tilhenger t
0 celler med to
-ΔΔCt metode. Alle DCN og LUM FC verdier for neurosfærene var statistisk signifikant (* p 0,01). (C) Western blotting-analyse av DCN og Lum. p-aktin ble benyttet som kontroll lasting. Totalt DCN og Lum nivåene var høyere i neurosfærene enn i de adherente celler fra begge cellelinjer. En 70-kDa LUM isoform ble oppregulert i neurosfærene i begge cellelinjer, med den høyeste uttrykk i T8 neurosfærer. Heft SF-268 celler viste basal uttrykk for den 37-kDa LUM kjerne protein.
Protein Analysen viste en klar økning i LUM protein (70 kDa) under CSC berikelse. Den høyeste Lum ekspresjon ble påvist i både SF-268 og SK-N-SH t
8 neurosfærer (figur 1C). I motsetning til dette ble 40-kDa Lum-proteinet påvist med mye mindre uttrykk som 70-kDa Lum i både SF-268 og SK-N-SH, og spesielt i t
12 (figur 1C). På den annen side, har vi oppdaget at en betydelig økning i DCN (mer enn 150-kDa) proteinekspresjon i både SF-268 og SK-N-SH t
12 neurosfærer mens 40 kDa-DCN-proteinet ble påvist meget svakt, med et vanskelig uttrykk evaluering. Ifølge mRNA resultater, 8-dager SLRP
+ CSC-lignende (T8 CSC-aktig) avledet fra både GBM og NB cellelinjer ble inkludert i videre analyse.
soft agar kulturer av SLRP
+ CSC-lignende og foreldrecellelinjer
For å vurdere forskjellene i cellevekst mellom CSC-lignende og foreldrecellelinjer, de sekundære neurosfærer fra SLRP
+ t
8 CSC-lignende ble generert i myk agar og sammenlignet med foreldre-celle-avledet primære neurosfærer. Forankringsuavhengig myke agar kulturer viste neurosfære kolonier i NSC SFM, mens ingen eller lave kolonier av foreldre celler hadde vokst i DMEM-baserte soft agar-analysen etter 22 dager (figur 2A). Den primære SK-N-SH Neurosfærene var større enn SF-268 neurosfærer, nå 200 mikrometer etter 3 uker, og hadde vist en tydelig mørk kjerne innenfor 3D-strukturen. De myke agar kulturer av t
8 GBM og NB CSC-lignende (SLRP
+) vokste som små sekundære Neurosfærene i NSC SFM, og nysgjerrig også som små kolonier i DMEM etter 30 dager (figur 2B). De sekundære Neurosfærene var mindre enn de primære Neurosfærene og intrasphere stresset celler (mørke kjerner) var bare påvises i videregående SF-268 Neurosfærene etter 2 uker, mens de sekundære SK-N-SH Neurosfærene opprettholdt et gjennomsiktig utseende.
(A) Primær soft agar neurosfærer fra foreldrecellelinjer. Fravær av kolonier formasjonen i semisolid DMEM (22 dager) og neurosfære formasjonen i semisolid NSC SFM (14 og 22 dager). (B) Sekundære myke agar Neurosfærene fra SLRP
+ CSC-lignende isolert fra t
8 neurosfærer. Neurosfærer ble generert i både semisolid DMEM og semisolid NSC SFM (14 og 22 dager), noe som tyder på den langsomme sykling oppførselen til CSC-aktig og rest død unndragelser aktivitet i DMEM dyrket sekundære neurosfærer. Bar, 50 mikrometer.
Heterogeneic ultrastructures av GBM og NB Neurosfærene
ultrastructural bildebehandling med TEM og SEM viste bred cellulær heterogenitet i t
8 Neurosfærene av begge cellelinjer. SEM avbildning av neurosfærene overflater viste mer pakkede celler i NB neurosfærene enn i GBM neurosfærene, mens de perifere cellene i GBM neurosfærene hadde mer tynn membran extroflections enn SK-N-SH-neurosfærer (figurene 3A, 3B, 4A og 4B ). Tilstøtende elektron-tette og elektron-Lucent celler og sporadiske apoptotiske celler observert på GBM neurosfære periferiene (fig 3C-3E). De perifere cellene i NB neurosfærene var polarisert, med mer OsO
4 farging i cytoplasma enn de indre celler, og inneholdt tette granuler, endocytiske vesikler og noen membran extroflections (figur 4C-4E). Store deler av celledød, preget av membran blebbing, celle skrukker, apoptotiske legemer, og bred atom komprimeres heterochromatin, ble observert i midten av neurosfærer av begge cellelinjer (figur 3G, 3H, 4G og 4H). Men aktiv mitose og levende celler nær de indre stresset områder ble også observert, både i GBM og NB Neurosfærene (figur 3G, 3i, 3J, 4F og 4J). Interessant nok har disse mikro-resistente celler i hypoksisk neurosfære kjernen viste innrykkede kjerner, store mengder eukromatin og klart synlig mitokondriell apparat.
(A) SEM-bilde av en hel SF-268 neurosfære (1000 x). (B) SEM-bilde av neurosfærene overflate (2200 x). (C-J), TEM bilder av indre og ytre neurosfærer. Detaljer om tynn membran extroflection (C-D), interaksjoner mellom elektron-tette og elektron-Lucent celler (E), detaljer om celle-celle adhesjon (F), lider områder i de indre områder, med nekrotisk (G) og apoptose ( H) celler, levende celler, og detaljer av den mitokondrielle anordningen i inner kuler (i, J). Legg merke til de apoptotiske celler i periferien av et neurosfære (D) og de levende celler nær de lidende områder (I). Bar: (C-E) og (G-I), 5 um; (F og J), 1 mikrometer.
(A) SEM bilde av hele SK-N-SH neurosfære (950 ×). (B) SEM avbildning av neurosfære overflate (3000 ×). (C-J) TEM bilder av indre og ytre neurosfære. Detaljer angående celle vesikler, celle polarisasjonsretninger, og adskillelses (C-E), levende celler i de indre neurosfærene og detaljer av mitokondriell anordningen (F), som lider områder i de indre områder, med nekrotisk (G) og apoptotiske celler (H og I), og en intrasphere mitotisk hendelse (J). Bar: (C-J), 5 mikrometer
TMZ behandling og MTT analyse av SRLP
+ CSC-lignende og foreldrecellelinjer
Low-range TMZ konsentrasjoner (. 0-500 mm) induserte ikke signifikante forskjeller i de metabolske aktiviteter av SF-268 foreldre celler og SRLP
+ t
8 CSC-aktig. Som vist i figur 5A, den metabolske aktiviteten av foreldrecellene varierte fra 76,14% til 100% (94,63% ± 7,10%), mens metabolsk aktivitet av SRLP
+ t
8 CSC-lignende varierte fra 80,71% til 100% (88,22% ± 5,43%). Høyere konsentrasjoner av TMZ (750-1500 mm) induserte signifikante forskjeller mellom SLRP
+ t
8 CSC-lignende og foreldrecellelinje. Ved disse konsentrasjoner, den metabolske aktiviteten av SF-268 opphavelige cellelinje varierte fra 38,99% til 58,86% (51,80% ± 7,59%), mens det av SF-268 SRLP
+ t
8 CSC-lignende varierte fra 79,09% til 79,64% (78,94% ± 0,45%) (p 0,05). SF-268 foreldre IC
50 var rundt 1250 mikrometer, og nådde ikke IC
50 av SF-268 SRLP
+ t
8 CSC-aktig.
(A) SF-268 heftende celler
versus
SF-268 SLRP
+ t
8 CSC-aktig. (B) Heft SK-N-SH celler
versus
SK-N-SH SLRP
+ t
8 CSC-aktig. Hemming av cellevekst ved lave doser av TMZ (0-500 mm) var større i t
8 cscs-aktig enn i foreldrecellelinjer, med betydning i SK-N-SH-celler (* p 0,05, fig 5B). I motsetning til dette, hemming av cellevekst ved høye doser av TMZ ved, tilsvarende farmakologiske doser ( 750 pM), var større hos foreldrecellene enn i t
8 cscs-lignende celler i CSC anrikninger av begge cellelinjer (* p 0,05, figur 5A og 5B). DMSO bakgrunn ble trukket fra prøver og kontrollverdier og data vist som gjennomsnitt (SD) av [(A
prøver-A
DMSO) /(A
kontroll-A
DMSO)] * 100 av fire uavhengige forsøk.
Ved lave og høye konsentrasjoner TMZ indusert betydelige forskjeller i de metabolske aktiviteter av SK-N-SH foreldrecellene og SRLP
+ t
8 CSC -like. Som vist i figur 5B, den metabolske aktiviteten av celler behandlet med 0-500 uM TMZ varierte fra 75,08% til 100% (88,41% ± 6,70%) for parentale celler og fra 66,86% til 100% (74,70% ± 10,84%) av SRLP
+ t
8 CSC-lignende (p 0,05). I celler behandlet med 750-1500 uM TMZ, den metabolske aktiviteten byttet og varierte fra 42,91% til 68,56% (54,96% ± 9,61%) for parentale celler og fra 63,92% til 70,61% (66,64% ± 2,50%) for SRLP
+ t
8 CSC-lignende (p 0,05). IC
50 i SK-N-SH foreldre celler var rundt 1250 mikrometer, og nådde ikke IC
50 av SK-N-SH t
8 SRLP
+ CSC-aktig.
Diskusjoner
stamcelle teorien om kreft er en ny forståelse av kreftutvikling som vurderer onkogenese å være avvikende organogeneseperioden [56]. Fordi CSC-lignende er til stede i kreft som tumor-initiering celler og sirkulerende kreftceller, kan de samhandle med og reagere på CSC nisje, som kan modulere celle skjebner, noe som bidrar til kreft vev heterogenitet og narkotika motstand [57]. Dette plastisitet letter forankring tap og cellemotilitet, genererer sirkulerende tumorceller
via
EMT i en lærerik mikromiljø. Ulike CSC subpopulasjoner har blitt funnet i samme svulst [58], avskaffe all tvil om rollene til cscs i kreft heterogenitet og mikromiljøet modulasjon, og dermed i legemiddelresistens [59, 60]. Flere tidligere studier har rapportert SLRP proteiner i bryst [61], bukspyttkjertel [62], tykktarms [63], livmorhals [64], prostata [30], og lungekreft [65], blant andre, fremhever de kontroversielle roller DCN og LUM i kreft biologi. Våre resultater gir det første bevis på relevansen av DCN og LUM til CSC biologi, viser betydelig økt mRNA og proteinnivåer både SLRPs i GBM og NB CSC-aktig. Men mens LUM mRNA og protein økt i t
8 neurosfærer, økt DCN mRNA ved t
8 og DCN protein ved t
12. Dette faktum kan forklares med forskjeller mellom DCN og LUM i intrasphere fangst og kanskje av CSC spesifikke post-transkripsjonsreguleringsmekanismer som fortsatt er ukjent. I tillegg har påvirkning av vekstfaktorer og deres reseptorer, for eksempel de av EGF og TGF-β1, på DCN modulasjon og handel er vist i voksne celler [66, 67], som tyder på antatte krysstale av DCN og vekstfaktorer baner i CSC, som fortjener videre mekanistiske undersøkelser.
3D tumorsphere kulturer i betingede serum-frie medier, som utgjør en metodisk utvikling av neurosfærene kulturer brukes i nevrale stilk og stamcelleforskning [68-70], anses representative
in vitro
cancermodeller som er nyttige i den CSC-lignende anrikning av primær [71-75] og etablerte cancercellelinjer [76, 77]. Her ble denne modellen brukes for å oppnå neurosfære baserte serumfritt CSC anrikning av human GBM og NB kreft-cellelinjer, noe som forbedrer celle plastisitet gjennom cellen dedifferentiation mot en stilk-lignende fenotype.
