Abstract
Bakgrunn og formål
Tissue microRNAs (mirnas) kan oppdage kreft og forutsi prognose. Flere nyere studier har rapportert at vev, plasma, og spytt mirnas dele lignende uttrykk profiler. I denne studien undersøkte vi diskriminerende effekt av spytt mirnas (inkludert hele spytt og spytt supernatant) for påvisning av esophageal kreft.
Materialer og metoder
Etter Agilent microarray, seks deregulerte mirnas fra hele spyttprøver fra sju pasienter med spiserørskreft og tre friske kontroller ble valgt. De seks utvalgte mirnas ble utsatt for validering av deres uttrykk nivåer av RT-qPCR med både hele spytt og spytt supernatantprøver fra et uavhengig sett av 39 pasienter med spiserørskreft og 19 friske kontroller.
Resultater
Seks mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-21, MIR-451, MIR-486-5p, og MIR-634) ble identifisert som mål av Agilent microarray. Etter validering av RT-qPCR, MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451 i hele spytt og Mir-10b *, MIR-144, MIR-21, og MIR-451 i spytt supernatant ble signifikant oppregulert i pasienter, med følsomheten til 89,7, 92,3, 84,6, 79,5, 43,6, 89,7 og 51,3% og spesifisitet på 57,9, 47,4, 57,9%, 57,9, 89,5, 47,4 og 84,2%, henholdsvis.
Konklusjoner
Vi fant særegne mirnas for esophageal kreft i både hele spytt og spytt supernatant. Disse mirnas har diskriminerende makt for påvisning av esophageal kreft. Fordi spytt samling er ikke-invasiv og praktisk, spytt mirnas viser store løftet som biomarkører for påvisning av kreftfaren i områder med høy risiko
Citation. Xie Z, Chen G, Zhang X, Li D, Huang J Yang C, et al. (2013) Spytt microRNAs som lovende Biomarkører for påvisning av spiserørskreft. PLoS ONE 8 (4): e57502. doi: 10,1371 /journal.pone.0057502
Redaktør: Anthony W. I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 29 oktober 2012; Godkjent: 22 januar 2013; Publisert: 01.04.2013
Copyright: © 2013 Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft (EF) er den åttende mest vanlige. kreft og sjette største årsaken til kreftdødelighet globalt [1]. Anslagsvis 482,300 nye EU-saker og 406,800 dødsfall skjedde i 2008 på verdensbasis. Forekomsten varierer internasjonalt med nesten 16 ganger, med de høyeste tallene i Sør- og Øst-Afrika og Øst-Asia og lavest i Vest og Midt-Afrika og Mellom-Amerika i både menn og kvinner. EC er 3 til 4 ganger mer vanlig blant menn enn kvinner [2]. Dens forekomsten har økt raskt i vestlige land i løpet av det siste halve århundret [3]. Den Chaoshan område i Guangdong-provinsen i Kina har en høy forekomst av EF ( 100/100000) [4]. Dødstallene forårsaket av EF i Kina står for mer enn 70% av alle EU-dødsfall på verdensbasis [5]
Den generelle overlevelse er fortsatt lav.; bare 3-5% av diagnostiserte pasienter overlever i 5 år, [6]. I kontrast til overlevelse øker til 90% hos pasienter diagnostisert med Stage I sykdom (T1N0M0) som gjennomgår kirurgisk reseksjon [7]. Derfor tidlig diagnose og behandling er avgjørende. I dag, avhengig av den kliniske diagnose hovedsakelig på radiologi og endoskopisk biopsi. Men disse testene er kostbare, invasiv, eller forårsake ubehag for pasienten, og de fleste pasienter er i et sent stadium av sykdommen når nøyaktig diagnose er oppnådd. Derfor er det nødvendig å identifisere en biomarkør av tidlig stadium EC.
Flere studier har vist at avvikende ekspresjon av mirnas er nært knyttet til patogenesen og utvikling av kreft, og mirnas besitte diskriminerende effekt som kreft [biomarkører ,,,0],8]. Flere studier har rapportert at mirnas er avvikende uttrykt i kreft vev og plasma hos pasienter med EF [9], [10]. Imidlertid miRNA ekspresjon i spyttet hos pasienter med EC har ennå ikke blitt rapportert. På grunn av den omfattende blodtilførsel i spyttkjertler, er spytt ansett å være et terminal produkt på blodsirkulasjonen, og molekyler som er til stede i plasma er også til stede i spytt. Derfor er spytt antas å speile systemisk helse og reflektere forhold som kreft, infeksjonssykdommer, hjerte- og karsykdommer,
etc
. [11]. Tissue, plasma, og spytt mirnas dele lignende uttrykk profiler [12] – [16]. Denne studien omfattet to faser: Oppdagelsen og valideringsfasen. I discovery fasen ble seks mirnas som ble feilregulert mest betydelig i hele spytt av pasienter med EF av Agilent microarray analyse valgt som mål. I valideringsfasen, ble uttrykket nivåer av de seks satsings mirnas validert av RT-qPCR ved hjelp av både hele spytt og spytt supernatantprøver.
Materialer og metoder
Prøve størrelse estimering
i oppdagelsen fase, i henhold til de Agilent microarray resultatene, følsomheten av MIR-144 for EC var 85,7%. Formelen for utvalgsstørrelsen estimering var som følger: n =
u
α
/2P (1-P) /
δ
2
i denne formelen
n
er antallet nødvendig,
u
α
/2 er testnivået,
α er
verdi cutoff av to-tailed normalfordeling,
P
er den forventede verdien av sensitivitet, og
δ
er den tillatte feil.
Ifølge evnen til å oppnå utvalgsstørrelsen for vår studie, valgte vi verdiene
α
= 0,05 (
u
a
/2 = 1,96),
δ
= 0,11, og verdiene ble anvendt ved formelen. Resultatet ble
n
= 1.96
2 × 0,857 × (1 til 0,857) /0.15
2 ≈38.9 = 39. Det er, i valideringen fase av denne studien, minimum antall saker som trengs for EF-gruppen var 39, og 39 saker ble valgt. I henhold til evnen til å oppnå prøvestørrelse for vår studie, antok vi at forholdet av tilfellene i EF-gruppen til at i den friske gruppe for å være 02:01. 19 tilfeller i sunn gruppe ble valgt.
Subject utvalg
46 hele spytt og 46 spytt supernatantprøver fra 46 pasienter med EC og 22 hele spytt og 22 spytt supernatantprøver fra alders-, kjønns- og etnisk-matchede friske personer ble hentet fra Guangdong General Hospital mellom juli 2011 og januar ble 2012. Pasient histopatologiske resultatene bekreftet av endoskopisk biopsi, og EF-pasientene hadde ingen samtidige organiske, systemiske eller orale sykdommer, som for eksempel hepatitt, diabetes mellitus,
etc
, som kan påvirke EU markør uttrykk nivåer. Kreft iscenesettelse var basert på UICC /TMN iscenesettelse system [17]. Stages I, II og III var basert på histopatologiske resultatene etter kirurgisk reseksjon. Stage IV var basert på histopatologiske resultatene av punktering biopsi av metastatiske lymfeknuter eller PET-CT-resultater. «N /A (Ikke tilgjengelig)» ble tildelt da pasienter nektet ytterligere tester eller behandlinger. Friske personer ble samlet som kontroller basert på negative helseeksamensresultatene inkludert blodprøver, røntgenundersøkelse, muntlig eksamen, mageultralydundersøkelser, fekal okkult blod testing og digitale endetarms eksamen. Ingen av disse kontrollene hadde blitt diagnostisert med en hvilken som helst form for kreft, enten forut for undersøkelsen eller på tidspunktet for prøvetakingen. Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board og etikkutvalg ved Guangdong General Hospital. Alle deltakerne ble gitt skriftlig samtykke til deres informasjon skal lagres på sykehuset database og brukes til forskning.
Spytt samling
Forsøkspersonene ble bedt om å avstå fra å spise, drikke, røyke, og munnhygiene fremgangsmåter for minst 2 timer før samlingen. For å stimulere kjertel spytt flyt, fag fikk en 2% sitronsyreløsning for søknad til de bilaterale bakre sideflater tungen med en bomullspinne i 5 s hvert 30 s. Den sitronsyrestimuleringen fortsettes ved 30-sekunders intervaller under hele samlingen prosedyren. Opp til 5 ml av spytt fra hvert individ ble oppsamlet i et 50 ml sentrifugerør. Totalt 2 ml spytt ble fjernet fra røret som en helhet spyttprøve. De resterende 3 ml av spyttprøver ble sentrifugert ved 3000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C for å spinne ned eksfolierte celler, og supernatanten ble overført til mikrosentrifugerør, etterfulgt av en andre sentrifugering ved 12.000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C for fullstendig å fjerne cellulære komponenter som spytt supernatantprøvene. Hele spytt er spytt som ikke er blitt sentrifugert. Den kan inneholde ekspandert esophageal kreftceller regurgitated fra spiserøret på grunn av obstruksjon av esophageal tumor. Spytt supernatant er spytt som er blitt sentrifugert, og det inneholder ikke noen eksfolierte celler og andre pellets. Derav spytt Supernatanten blir ansett for å være det terminale produktet av blodsirkulasjonen, og det kan reflektere indre miljø i våre Bodis. Prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Prosedyren er nevnt ovenfor, må være ferdig innen 2 timer [18].
Agilent microarray i discovery fasen
Siden dette er den første forskning på spytt microRNAs for påvisning av EF i verden, vi bare valgte 10 tilfeller å utføre microarray. Syv hele spyttprøver fra EC gruppe og tre fra den friske gruppen ble valgt tilfeldig. Patologi alle sju pasienter med EF var plateepitelkarsinom; en var stadium I, en fase II, 3 fase III, og to trinn IV. Totalt 923 modne miRNA sekvenser ble samlet og integrert i vår miRNA microarray design. Rådata ble normalisert ved quantile algoritme, Gene Spring Programvare 11,0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). 6 mirnas ble valgt som mål, og deres uttrykk nivåer ble validert ved RT-qPCR i valideringen fase. Det merkede Fremgangsmåten var som følger: gTotalGeneSignal verdien i Agilent microarray utgjorde ekspresjonsnivået av hver miRNA. Derfor, for identiske mirnas, ble søylediagrammer trukket i henhold til gTotalGeneSignal verdien av hver miRNA. Vi valgte fem mirnas: Mir-144, MIR-10b *, MIR-451, MIR-486-5p, og MIR-634, de verdiene som hadde en tendens til å være mye høyere eller lavere i EF-gruppen enn i den friske gruppen og som også er nært knyttet til utviklingen av deseases. Samtidig har flere studier rapportert at Mir-21 er abnormt uttrykt i kreft vev og plasma fra pasienter med EF [9], [10]; den gTotalGeneSignal verdien av MIR-21 ikke viser denne tendensen, men ble også valgt som et mål. Baren diagrammer av de 6 mål mirnas ble presentert i Figur 1. (De sju barer foran representerer gTotalGeneSignal verdi fra EF-gruppen, og tre bak representerer gTotalGeneSignal verdi fra den sunne gruppen. Y-aksen representerer verdien av gTotalGeneSignal ).
A), med unntak av prøve 4, verdiene av de seks EC gruppeprøver var høyere enn for de tre friske gruppeprøver. B) Med unntak av prøve 2, verdiene av de seks EC gruppeprøver var høyere enn for de tre friske gruppeprøver. C) Med unntak av prøve 10, verdiene av de syv EC gruppeprøver var høyere enn for de to friske gruppe prøver. D) Med unntak av prøve 10, verdiene av de syv EC gruppeprøver var høyere enn for de to friske gruppe prøver. E) Alle EU-konsernets verdier var lavere enn de tre av de sunne gruppen. F) Flere studier har rapportert at mirnas er avvikende uttrykt i kreft vev og plasma med EC pasienter; Men den gTotalGeneSignal verdien av MIR-21 ikke skiller mellom EF og sunne grupper. Men det ble også valgt som et mål miRNA.
Validering fase
uttrykk nivåer av de 6 valgte mirnas ble validert ved RT-qPCR med både de 58 hele spytt prøver og de 58 spytt supernatantprøver fra 39 pasienter med EC og 19 friske kontroller. Den Mirvana PARIS sett (Ambion, USA) ble anvendt for å isolere total RNA fra 1 ml av hel spytt eller spytt supernatant, i henhold til produsentens protokoll. Til slutt, RNA ble eluert i 30 ul av forvarmet nuklease-fri vann (95 ° C) og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kvaliteten og konsentrasjon av isolert total RNA ble bestemt ved anvendelse av en NanodropND-1000 (Thermo Scientific, Worcester, MA), med verdien ved OD260 /280 rundt 2,0 som indikerer høy kvalitet eller renhet. Revers transkripsjonsreaksjon ble først utført med 11 pl blanding inneholdende 2 pl av RNA-ekstrakt, 2 pl RT primer (Ribo, Kina) og 7 mL av nuklease-fritt vann. Den 11 pl blandingen ble inkubert ved 70 ° C i 10 minutter og i is i 2 min. Deretter 5 mL av RT-buffer, 2 pl dNTP (2,5 mM), 0,5 ul RNase-inhibitor (40 U /pl), 0,5 pl revers transkriptase (200 U /ul), og 6 pl av nuklease-fri vann var tilsatt til 11-pl blanding. Den reverse transkripsjonsreaksjon fortsettes ved 42 ° C i 60 min, 70 ° C i 10 minutter, og 4 ° C for ∞. cDNA-oppløsning (3 ml) ble amplifisert ved bruk av 9 ml av SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Kina), 2 ul av miRNA forover primer, 2 ul av miRNA bakover primer, og 4 ul av nuklease-fritt vann i et sluttvolum på 20 ml. Kvantitativ PCR ble kjørt på en Biorad CFX96 2,1 (Biorad Biosystems), og reaksjonsblandingene ble inkubert ved 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 50 sykluser av 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 10 sek. Ved slutten av PCR-sykluser, smelter kurve analyse utført for å validere generering av det forventede PCR-produkt. Innstillingen av smeltekurve var 65,0 til 95,0 ° C i trinn på 0,5 ° C i 0,05 min + plate lese. Hver prøve ble analysert i triplikat. Alle Ct-verdier var 36. Uttrykket nivåer for hvert mål miRNA ble normalisert til at av MIR-16. MIR-16 er de mest brukte interne kontroll mikroRNA i kroppsvæskeprøver, inkludert plasma [10], [19]. Og aller viktigst, i discovery fasen og validering fase, vår studie viste at Mir-16 kunne stabilt uttrykke i spytt og arbeide som en intern kontroll for spytt miRNAs. Rådata i discovery fasen kan lastes ned fra nettsiden til GEO: www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/linking.html, og aksesjonsnummer er GSE41268. Den methodoloy ble rådata og bilder av validering av MIR-16 som en intern kontroll i vår forskning presentert i data S1. Alle ekspresjonsnivåer ble beregnet å utnytte de to
-ΔΔCt metoden [20]. Kort fortalt: sample
iΔCt
target Mir = prøven
ikt
target MIR-prøven
ikt
MIR-16; Prøven
iΔΔCt
target Mir = prøven
iΔCt
target MIR -. middelverdien av ΔCt
target MIR på den sunne gruppen
Statistisk analyse
Expression nivåer av mirnas og aldre ble sammenlignet med Mann – Whitney U test eller Kruskall – Wallis H test. Kjønn ble sammenlignet med χ
2 test. En multivariat logistisk regresjonsmodell ble etablert for fire risikofaktorer: røyking, alkohol inntak, drikke eller spise på varme temperaturer, og Chaoshanese nasjonalitet. De odds ratio (ORS) av de 4 risikofaktorer ble beregnet ved fremover LR. Hver OR ble sammenlignet med χ
2 test. Mottaker-operasjonelle egenskaper (ROC) kurver ble anvendt for å evaluere diskriminerende effekt av hver miRNA for differensiering av pasienter og kontroller. Korrelasjonen av hvert miRNA uttrykk nivå mellom hel spytt og spytt supernatant ble analysert ved Spearmans korrelasjonstest. Forskjellene i de diskriminerende krefter målet mirnas ble sammenlignet med metoden for DeLong bruke MedCalc12.2.1 programvare. Andre statistiske analyser ble utført med SPSS programvare, versjon 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). En
p
verdi av. 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans
Resultater
Hele spytt profil
Ti hele spyttprøver (7 fra pasienter med EF og tre fra friske kontroller) ble evaluert av Agilent microarray. Totalt 923 modne miRNA sekvenser ble samlet og integrert i vår miRNA microarray design. Totalt 461 mirnas ble detektert i hele spytt (sondesignalverdien av disse mirnas var til stede i minst én prøve). Av disse 461 mirnas, 452 ble påvist i EF prøver og 391 friske kontrollprøver. Totalt 232 miRNAs ble oppdaget i alt 10 prøver. Totalt 261 miRNAs ble påvist i alle 7 EF prøver, og 243 mirnas i alle 3 kontrollprøver. Tjuefem mirnas viste signifikante forskjeller i uttrykk mellom EF-gruppen og den friske gruppen. 6 mirnas (MIR-144, MIR-10b *, MIR-21, MIR-451, MIR-486-5p, og MIR-634) ble utsatt for validering av deres uttrykk nivåer av RT-qPCR. Antallet mirnas påvist i hver prøve ble presentert i tabell 1.
Kjennetegn på EU-pasienter og friske kontroller i valideringen fase
I valideringsfasen, 39 pasienter med EF var valgt, 32 (82,1%) av dem hadde plateepitelkarsinom, 4 (10,3%) hadde adenokarsinom, og 3 (7,7%) hadde småcellet karsinom. Kreft oppsetning av pasientene med EC var som følger: 0 (0%) var i stadium I, 12 (30,8%) i trinn II, 11 (28,2%) i fase III, 10 (23,6%) i trinn IV, og 6 var utilgjengelig. Data om EU-pasienter og friske kontroller er presentert i tabell 2. Alle pasienter med EF var 40 år, hovedsakelig fra Chaoshan, Guangdong-provinsen, rapporterte drikke eller spise ved høye temperaturer, og drikker alkohol, og de fleste var mannlige røykere. Ifølge den logistiske regresjonsmodellen, ORS av Chaoshanese enkeltpersoner og drikke eller spise på en høy temperatur var statistisk signifikant (41,984 og 31,594, henholdsvis).
Diskriminerende kraften i hele spytt og spytt supernatant mirnas for EC
uttrykk nivåer av de 6 utvalgte satsings mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-21, MIR-451, MIR-486-5p, og MIR-634) ble validert av RT- qPCR bruke begge hele spytt og spytt supernatantprøver. 3 mirnas (MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451) i hele spytt fra EC gruppen var signifikant oppregulert (
p
= 0,001, 0,012 og 0,002, henholdsvis, fold-endringer, 58,7 , 45,6, og 42,4, henholdsvis). De andre 3 mirnas (MIR-21, MIR-486-5p, og MIR-634) viste ingen signifikante forskjeller mellom EF-gruppen og sunn gruppe (
p
= 0,110, 0,078 og 0,157, henholdsvis). ROC-kurver ble etablert for å evaluere diskriminerende kraften i hele spytt Mir-10b *, MIR-144, og MIR-451; AUC var 0,762, 0,706, og 0,756, respektivt. En optimal verdi cutoff er nødvendig for ROC-kurven for å definere den diskriminerende effekt. Når Younden indeks (Younden index = følsomhet + spesifisitet -1) når den maksimale verdi, vil den tilsvarende verdien cutoff være den optimale verdien cutoff [21].
cutoff verdiene av de 3 hele spytt mirnas (MIR -10b *, MIR-144, og MIR-451) ble bestemt å være 0,74530111, 0,78131771, og 0,79964271, henholdsvis. Derfor deres følsomhet for EC deteksjon var 89,7, 92,3 og 84,6% og spesifisiteten var 57,9, 47,4 og 57,9%, henholdsvis.
4 mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-21, og MIR-451) ble signifikant oppregulert i EF-gruppe spytt supernatanter (
p
= 0,013, 0,036, 0,015 og 0,006, henholdsvis folde-endringer, 4.5, 6.7, 9.7 og 5.4, henholdsvis; AUC, 0,702, 0,671, 0,698, og 0,725, respektivt). De to andre mirnas (MIR-486-5p og MIR-634) viste ingen signifikante forskjeller mellom EF-gruppen og sunn gruppe (
p
= 0,211 og 0,524, henholdsvis). Ved å beregne Younden indeksen, cutoff verdiene av de fire spytt supernatanten mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-21, og MIR-451) var fast bestemt på å være 1,05078691, 8,08243248, 0,88851054, og 8,48817219, henholdsvis. Derfor deres følsomhet for deteksjon av EF var 79,5, 43,6, 89,7 og 51,3% og spesifisiteten var 57,9, 89,5, 47,4 og 84,2%, henholdsvis.
rådata av uttrykket nivåer for hvert mål mirnas og informasjonen av forsøkspersoner i vår studie ble presentert i data S2. Baren diagrammer av uttrykk nivåer av abnormt uttrykt spytt mirnas nevnt ovenfor ble presentert i figur 2. ROC kurver av abnormt uttrykt mirnas ble presentert i Figur 3.
A) hele spytt Mir-10b *. B) hele spytt MIR-144. C) hele spytt MIR-451. D) spytt supernatant Mir-10b *. E) spytt supernatant MIR-144. F) spytt supernatant MIR-21. G) spytt supernatant MIR-451. miRNA uttrykket nivåer ble beregnet av 2
-ΔΔCt metode. Disse mirnas var signifikant oppregulert i EF (n = 39) sammenlignet med friske (n = 19) gruppe.
A) Hele spytt Mir-10b *. B) hele spytt MIR-144 og C) hele spytt MIR-451. D) spytt supernatant Mir-10b *. E) spytt supernatant MIR-144. F) spytt supernatant MIR-21. G) spytt supernatant MIR-451.
Sammenligning av AUC
Jo større AUC, tilsynelatende mer betydnings diskriminerende makt. Imidlertid, for å diagnostisere en sykdom ved å bruke den samme samling av prøver, er det ikke tilstrekkelig å evaluere den diskriminerende effekt ganske enkelt ved å sammenligne AUC-verdier [22], [23]. For nøyaktig sammenligne ulike AUC, vi brukte metoden for DeLong med MedCalc programvare, versjon 12.2.1. 3 hele spytt og 4 spytt supernatant mirnas var i stand til å oppdage EC. MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451 kan oppdage EC bruke både hele spytt og spytt supernatant. AUC indikerte ingen signifikante forskjeller mellom hele spytt Mir-10b * og spytt supernatant Mir-10b *, hele spytt MIR-144 og spytt supernatant MIR-144, og hele spytt MIR-451 og spytt supernatant MIR-451 (
p
= 0,3413, 0,7050 og 0,6867, henholdsvis). De diskriminerende krefter de samme mirnas i hele spytt og spytt supernatant var ikke signifikant forskjellig. Videre ble AUC for de 3 hele spytt mirnas (MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451) som kan oppdage EC forhold mellom to miRNAs. Resultatene viste heller ingen signifikante forskjeller [
p
= 0,2356 (MIR-10b *
vs
. MIR-144), 0,8959 (MIR-10b *
vs
. MIR -451), og 0,3248 (MIR-144
vs
. MIR-451)]. Til slutt ble AUC for de fire spytt supernatanten mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-21, og MIR-451) som kan oppdage EC forhold mellom to miRNAs. Resultatene viste heller ingen signifikante forskjeller [
p
= 0,8251 (MIR-10b *
vs
. MIR-21), 0,7699 (MIR-10b *
vs
. MIR -451), 0,7102 (MIR-10b *
vs
. MIR-144), 0,6079 (MIR-21
vs
. MIR-451), 0,8729 (MIR-21
vs
. MIR-144), og 0,3529 (MIR-144
vs
. MIR-451)]. I konklusjonen, diskriminerende krefter alle mirnas i både hel spytt og spytt supernatant var like.
Sammenheng mellom hele spytt og spytt supernatant uttrykk nivåer
Hele spytt og spytt supernatantprøver ble tatt fra hver Emne. I henhold til de ovenfor angitte resultater, MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451 var signifikant oppregulert i både hel spytt og spytt supernatant i EF-gruppen. Spearmans korrelasjon test ble brukt til å evaluere korrelasjoner av uttrykket nivåene av disse 3 mirnas mellom hel spytt og spytt supernatant. Uttrykket nivåer av disse 3 mirnas i hele spytt og spytt supernatant viste signifikant korrelasjon [
p
= 0.000 (MIR-10b *), 0,035 (MIR-144), og 0,003 (MIR-451)].
Relasjoner mellom miRNA uttrykk nivåer og kliniske kjennetegn ved EC pasienter
uttrykk nivåer av hele spytt Mir-10b *, MIR-144, og MIR-451 og spytt supernatant MIR-21, MIR -10b *, MIR-144, og MIR-451 ble ikke påvirket av alder, kjønn, bosted, spisevaner, røykestatus, alkoholforbruk, patologi type, stadieinndeling, kreft differensiering, eller nodal metastasering av pasienter med EC (tabell 3 .)
Diskusjoner
mirnas faller i to kategorier: cellulære og ekstracellulært. Ekstracellulære mirnas er tilstede i plasma eller andre kroppsvæsker; de også kalles sekretoriske miRNAs. Flere studier har funnet charateristic og stabile miRNA profiler i kroppsvæsker. Ekstracellulære mirnas kan være intersignalmolekyler og transduct inter signaler når strømmer [24].
De mekanismene for hvordan miRNA trer kroppsvæsker fra celler er ikke klart. Kaosuka
et al
. [25] fant at miRNA frigjøres fra celler reguleres av nøytral sfingomyelinasen 2 (nSMase2). Når ceramid økninger i cellene, fremmer nSMase2 miRNA utgivelse. Inhibering av nSMase2 ved den kjemiske inhibitor GW4869 hindrer miRNA frigjøring fra cellene.
RNase er til stede i plasma, spytt, urin og andre kroppsvæsker. Imidlertid har flere studier funnet at mirnas i kroppsvæsker er stabile og kan motstå nedbryting ved høye og lave temperaturer, i sterke syrer og baser, og med RNase. Dette er sannsynligvis fordi gratis mirnas i kroppsvæsker er pakket opp av proteiner eller lagres i vesikler [26] – [28]
Spytt er en kompleks væske som består av sekreter fra de store og små spyttkjertler.. Det er 450 til 750 mindre aksessoriske spyttkjertler ligger på tungen, kinnslimhinnen, og gane med unntak av den fremre delen av den harde ganen og tannkjøtt [29]. Det er også en omfattende blodtilførselen til disse kjertlene; Derfor, molekyler som er tilstede i plasma er også til stede i saliva, slik som proteiner, DNA, RNA,
etc
. Flere studier har rapportert at spytt molekyler kan oppdage muntlige og andre organiske og systemiske sykdommer. Li
et al
. [30] rapporterte at spytt mRNA av DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL-8 og IL-1 kan oppdage kreft i munnhulen mer accuately enn kan plasma mRNA av disse genene. Mbulaiteye
et al
. [31] fant at spyttprøver kan erstatte blodprøver for å påvise EB virus infeksjon. Også, kan spytt C-erbB-2 og CA153 proteiner være nye biomarkører av brystkreft [32] -. [34]
Weber
et al
. [14] rapporterte miRNA profiler av 12 kroppsvæsker og fant maksimalt 458 miRNAs i spytt. Patel
et al
. [35] fant at uttrykket nivåer av spytt mirnas var stabile og miRNA nivåer er reproduserbare innenfor fag. Park
et al
. [15] evaluert både hele spytt og spytt supernatant mirnas hos pasienter med kreft i munnhulen, og funnet lignende miRNA profiler. De rapporterte også at spytt MIR-125a og MIR-200a signifikant nedregulert og at begge kan være nye biomarkører for kreft i munnhulen
Etter Agilent microarray, vi har oppdaget uttrykket nivåer av 923 mirnas i 10 hele spyttprøver.; 461 ble oppdaget. Uttrykket nivåer av 25 mirnas viste signifikante forskjeller mellom EU og sunne grupper. Ved hjelp av den samme teknologien, Weber
et al
. [14] oppdaget 458 hele spytt mirnas fra 5 friske personer. Etter validering av RT-PCR, tre hele spytt mirnas (MIR-10b *, MIR-144, og MIR-451) og fire spytt supernatant mirnas (MIR-10b *, MIR-144, MIR-451, og MIR-21) var signifikant oppregulert hos pasienter med EF. Basert på Spearmans korrelasjon test, hele spytt og spytt supernatant Mir-10b *, MIR-144, og MIR-451 viste signifikante sammenhenger. Forskjellene i AUCer var ikke statistisk signifikante. Dette tyder på at de diskriminerende krefter hele spytt og spytt supernatant mirnas var like. Men flertallet av pasienter med EC da innlagt på sykehuset viste symptomer på problemer med å svelge, oppstøt eller oppkast, og deres spytt kan ha inneholdt ekspandert EC-celler regurgitated fra spiserøret på grunn av esophageal obstruksjon av svulsten. Derfor, hvis spytt miRNA testing brukes til å screene EC hos asymptomatiske pasienter, er spytt supernatant et bedre valg fordi de cellulære komponentene har blitt fjernet.
Biagioni F,
et al product: [36] showet at mikroRNA-10b * er en mester regulator av brystkreft celleproliferasjon og er nedregulert i tumorprøver versus matchet peritumoural kolleger, foreslår de også at restaureringen av mikroRNA-10b * uttrykk kan ha terapeutisk løftet. Men i vår studie, ble Mir-10b * oppregulert i spyttet til EF-pasienter. Fordi opprinnelsen av sirkulerende miRNAs er ikke klart i dag, deres uttrykk nivåer er ikke forenlig med tissular eller mobil mirnas noen ganger. For eksempel, Coulouarn
et al product: [37] og Tsai
et al product: [38] rapporterte at MIR-122 ble nedregulert i leveren kreft vev, men Zen og Zhang [39] rapporterte at det ble oppregulert i serum hos pasienter med leverkreft. MIR-10b * ble oppregulert i spyttet til EU-pasienter, men nedregulert i brystkreft vev. Grunnen for det kan være relatert til forskjellige ekspresjon av MIR-10b * i de to forskjellige typer kreft. I tillegg kan det også bli forbundet med den annen fordeling mellom vev og kroppsvæsker. Rossing
et al
. [40] fant at MIR-144 ble nedregulert i skjoldbruskkjertelen vev. Sureban
et al
. [41] rapporterte at nanopartikkel-baserte levering av siDCAMKL-en økt mikroRNA-144 og hemmet kolorektal kreft tumorvekst via en Notch-en-avhengige mekanismen. Konishi
et al
. [42] rapporterte at uttrykket nivået av plasma MIR-451 ble økt i preoperative pasienter med magekreft og redusert postoperativt (AUC = 0,96). Dermed sine data tyder på at plasma MIR-451 besitter god diskriminerende effekt for magekreft. Brenner
et al
. [43] fant at oppregulering av vev MIR-451 var prediktiv av en dårlig prognose for mage kreftpasienter. I kontrast, Bandres
et al
. [44] rapporterte at nedregulering av MIR-451 i mage eller tykktarm kreft vev spådd en dårlig prognose. I tillegg overekspresjon av MIR-451 i mage og kolorektal kreft celler redusert celledeling og økt følsomhet for strålebehandling. Således sine data antyder at MIR-451 er et viktig tumor suppressor miRNA. Sist, men ikke minst, Wang
et al product: [45] rapporterte at oppregulert ekspresjon av MIR-451 indusert apoptose og undertrykket celleproliferasjon, invasjon og metastase i esophageal carcinoma-cellelinjen EC9706. I tillegg har injeksjon av MIR-451 hemmet tumorvekst i en xenograft modell av spiserørskreft.
MIR-144 og MIR-451 er involvert i patogenesen av myokardial ischemi og vedlikehold av erytroid homeostase. Zhang
et al
. [46] rapporterte at synergieffekter av GATA-4-mediert MIR-144/451 klynge beskyttet mot simulert iskemi /reperfusjon-indusert kardiomyocytt død. Wang
et al
.
