Abstract
Mål
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Totalt fem-års overlevelse har vist liten forbedring i løpet av de siste tiårene. Seven in absentia homologe (Siah) proteiner er E3 ubiquitin ligaser som medierer proteasomal protein degradering av poly-ubiquitinering. Selv om Siah proteiner spiller en nøkkelrolle i flere biologiske prosesser, deres rolle i kreft hos mennesker er fortsatt kontroversielt. Målet med studien var å dokumentere SIAH2 uttrykk mønster på ulike nivåer (mRNA, protein nivå og immunhistokjemi) i human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) prøver i forhold til omkringliggende friskt vev fra samme pasient, og å analysere tilknytning clinicopathological funksjoner.
Materialer og Metoder
Ett hundre og femti-to prøver fra en pasient kohort behandles kirurgisk for primær lungekreft ble innhentet for studiet. Fremkallende og protein uttrykk nivåer av SIAH2 ble analysert og sammenlignet med klinikk-patologiske variabler.
Resultater
Denne studien er den første til å analysere SIAH2 uttrykk mønster på ulike nivåer (RNA, protein expression og immunhistokjemi) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Vi fant ut at SIAH2 protein uttrykk er betydelig forbedret i human lunge adenokarsinom (ADC) og plateepitelkreft lungekreft (SCC). Paradoksalt nok var ikke-signifikante endringer på RNA-nivå funnet, tyder på en post-traductional reguleringsmekanisme. Enda viktigere, ble en øket korrelasjon mellom SIAH2 ekspresjon og tumor klasse detektert, noe som tyder på at dette protein kan anvendes som en prognostisk biomarkør for å forutsi lungekreft progresjon. Likeledes SIAH2 proteinekspresjon viste en sterk positiv korrelasjon med fluorodeoxyglucose (2-deoksy-2 (
18F) fluor-D-glukose) opptak i primær NSCLC, noe som kan hjelpe klinikere i stratifying pasienter med økt total risikoen for dårlig overlevelse. I tillegg beskrev vi en invers korrelasjon mellom uttrykket av SIAH2 og nivåene av en av sine underlag, serin /treonin kinase DYRK2.
Konklusjoner
Våre resultater gir innsikt i den potensielle bruken av SIAH2 som en roman mål for lungekreft behandling
Citation. Moreno P, Lara-Chica M, Soler-Torronteras R, Caro T, Medina M, Álvarez A, et al. (2015) uttrykk for Ubiquitin Ligase SIAH2 (Seven
I Absentia
homolog 2) er økt i Human lungekreft. PLoS ONE 10 (11): e0143376. doi: 10,1371 /journal.pone.0143376
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 6 juli 2015; Godkjent: 04.11.2015; Publisert: 18.11.2015
Copyright: © 2015 Moreno et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Economía y Competitividad MICINN (SAF2010-17122) til MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0650- 2010) til MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0246-2013) til MAC, og Instituto de Salud Carlos III, Award nummer:. PIE14 /00005 (FLEXI-MET) til MAC
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser:. Siah, Seven in absentia homolog; Doktorgrader, Prolyl- hydroksylaser; DYRK2, Dual-spesifisitet tyrosine- (Y) -phosphorylation regulert kinase 2; SCC, plateepitelkreft; ADC, Adenocarcinoma; NSCLC, Ikke-småcellet lungekreft; PET /CT, Positronemisjonstomografi (
PET
) /computertomografi (CT) skanner;
18FDG, 2-deoksy-2 – (
18F) fluor-D-glukose
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis, regnskap for nesten 1,4 millioner dødsfall årlig [1]. I motsetning til bryst eller prostata kreft, hvor overlevelse er betydelig forbedret, samlet 5-års overlevelse for lungekreft har vist liten forbedring i løpet av de siste to eller tre tiår. Således er den relative 5 års overlevelse 11-15% [2, 3], noe som betyr at 90% av pasientene vil dø av sykdommen.
Kurativ-hensikter pulmonal reseksjon gir den beste muligheten for kur når tumorene er lokalisert i lungene [4]. Dessverre, de fleste pasienter til stede med en avansert sykdom (trinn III og IV), er systemisk behandling med kjemoterapi og /eller strålebehandling det mest gunstig behandlingsform. I det siste tiåret, har flere nye molekylære terapeutiske mål er beskrevet, men deres effektivitet og klinisk effekt er fortsatt uklart [5]. Til sammen fremhever disse dataene behovet for nye og mer effektive behandlingsformer.
Seven i abstentia homolog (Siah) proteiner er ringen (Veldig interessant nytt gen) finger E3 ubiquitin ligaser, som formidler proteasomal protein degradering av poly-ubiquitinering [6]. Strukturelt den Siah familien presentere en avvikende N-terminalt domene, et sterkt konservert katalytisk RING domain, to sink finger-domener og et substrat-bindende domene [7-9]. Mus uttrykke tre medlemmer av familien, Siah1a, Siah1b og Siah2. To Siah proteiner er blitt identifisert i mennesker, SIAH1 og SIAH2 [10, 11], som kan utøve ulike funksjoner i cellulære prosesser, inkludert cellesykluskontroll, DNA-skade respons, tumorigenese og metastase [12]. Flere Siah underlag er beskrevet til nå, inkludert hypoksi regulerende familie av Prolyl- hydroksylaser (doktorgrad), PML, TRAF2, PPAR, AKAP121, HDAC3, DCC, HIPK2 og DYRK2 [13-15]. Derfor Siah proteiner er sentrale aktører i biologiske prosesser som DNA skade respons, hypoksi vei, østrogen signalering, betennelse, apoptose, og svulst undertrykkelse [12, 15].
Rollen Siah proteiner i human kreft fortsatt kontroversielt . I dag er antall studier som kobler uttrykk for Siah med utvikling av kreft hos mennesker svært begrenset, presentere motstridende bevis som klassifiserer Siah proteiner enten som et onkogen eller som en tumor suppressor. På den ene siden har flere grupper vist et oncogent rolle for Siah proteiner, spesielt SIAH2, i bryst [16-18], prostata [19, 20] og leverkreft [21]. Tvert imot, har Siah proteiner (spesielt SIAH1) blitt funnet å virke som en tumor suppressor i brystkreft [22], gastriske tumorer [23] og leverkreft [24]. Dette kan forklares som en konsekvens av spesifisiteten av hver underenhet for å nedbryte forskjellige substrater. Dermed kan vi konkludere med at hver subenhet spiller en annen rolle i tumorigenesis kontroll, som nylig har blitt gjennomgått av Wong SF og Møller A [25].
Hovedsakelig på grunn av onkogene rolle SIAH2 i noen typer kreft, målene for vår nåværende studien var å dokumentere for første gang mønsteret av SIAH2 uttrykk på ulike nivåer (mRNA, protein nivå og immunhistokjemi) i human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) prøver sammenlignet med omkringliggende friskt vev fra samme pasient, og å analysere sin tilknytning clinicopathological funksjoner. Videre er korrelasjonen med uttrykket av en SIAH2 substrat, serin /treonin kinase DYRK2 (Dual spesifisitet tyrosin-fosforylering regulert kinase 2) [26] ble også undersøkt.
Det nye ved dette arbeid er avhengig av analyse av SIAH2 ekspresjon mønster på forskjellige nivåer (RNA, protein expression og immunhistokjemi) i det humane NSCLC sammenlignet med friske lunge fra den samme pasient. De observerte resultater varsle om mulig bruk av SIAH2 som en prognostisk biomarkør for lungekreft.
Materiale og metode
Pasienter og Prøver
Lung vevsprøver fra pasienter behandlet kirurgisk for primær lungekreft ble oppnådd ved Universitetssykehuset Reina Sofia (Cordoba, Spania) fra januar 2011 til desember 2012. den innsamling, bruk og oppbevaring av vevsprøver ble godkjent av etikk og klinisk forskningsutvalg ved Universitetssykehuset Reina Sofia. Alle pasienter inngått en skriftlig informert samtykke dokument som viser deres frivillig donasjon. Parallelt ble clinicopatological data prospektivt samlet, inkludert: demografiske data, komorbiditet, historie neoplasmer, tumorstørrelse, SUV (max) av tumor (maks standardisert opptak verdi, som mål på
18FDG opptak), pTNM, svulst klasse, og utvikling av metastaser i løpet av oppfølgingen. Vevsprøver ble umiddelbart frosset med RNAlater
® (SIGMA, St. Louis-MO, USA) og lagret ved -80 ° C til RNA ekstraksjon og protein-analyse ble utført. De resterende prøven var formalinfiksert og parafin-embedded for konvensjonelle diagnostiske studier og immunhistokjemisk analyse. Alle prøver som inngår i denne studien ble histologisk gjennomgått og klassifisert som adenokarsinom (n = 36) eller squamous celle lungekreft (n = 40). I tillegg ble det tilstøtende normalt lungevev også tatt fra alle pasienter. Ingen av pasientene hadde mottatt kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Humane biologiske prøver som ble brukt var samlet inn, lagret og administrert av Cordoba node tilhører Biobank av den andalusiske Health Service (Servicio Andaluz de Salud-SAS).
Histologisk analyse
Immunhistokjemisk farging ble utført på formalinfiksert, parafininnstøpte menneskelig lungesvulster. Farging av kreftceller ble bedømt og sammenlignet med perifert normalt lungevev. Fem-mikrometer seksjoner fra tumorprøver var forberedt på vev lysbilder. Snittene ble deparaffinised i xylen, og rehydrert i en gradert etanol serien og destillert vann. Farging med hematoksylin-eosin (H E) og musen Siah mAb 24E6H3 (Novus Biologicals, Cambridge, UK) på 1:40 fortynning eller kanin polyklonale anti-DYRK2 antistoff (AP7534a; Abgent, San Diego, California) på en : 50-fortynning ble utført over natten ved 4 ° C. Antigen gjenfinning for seksjoner som skal farget med anti-Siah mAb eller det polyklonale anti-DYRK2 antistoff ble utført ved inkubering av lysbildene i 1 mM EDTA pH 8,0 i et 98 ° C-100 ° C damper i 30 minutter. SIAH2 IHC-farging ble vurdert som følger: 0, ingen flekker eller svak cytoplasmatisk farge på mindre enn 10% av tumorceller; 1+, svak cytoplasmatisk farge i mer tan 10% av tumorceller; 2 +, svak eller moderat cytoplasmatisk farge på mer enn 10% av tumorceller; 3+, mer enn 10% av sterk cytoplasmatisk farging. Som rapportert tidligere, ble 0 eller 1+ fargeintensitet regnet som DYRK2 negativ, mens 2+ eller 3+ ble betraktet som DYRK2 positiv.
mRNA utvinning og qPCR
Total RNA ble ekstrahert fra vev som er lagret i RNAlater
® ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoll, og behandlet med 1 pl (1unit /il) DNAse-1 (Sigma, USA). Total RNA konsentrasjon og integritet ble analysert ved hjelp av Experion
® automatisert elektroforese stasjon (Bio-Rad, CA, USA). Alle de analyserte prøvene viste en verdi RIN (RNA Integrity Number) høyere enn 9. Revers transkripsjon ble utført med iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR ble ansatt med GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) i en iCYCLER deteksjonssystem (Bio-Rad). Forsterkningen profilen bestod av en innledende denaturering i 5 minutter ved 95 ° C og deretter 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, gløding i 10 s ved en temperatur på 61,4 ° C (SIAH2 genet) eller 56 ° C (DYRK2 genet) , 30 sekunder ved 72 ° C for forlengelse og en denatureringstrinn av 1 minutt ved 97 ° C. Forsterkning effektivitet ble validert og normalisert mot β-aktin og HPRT, og brett endring i genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Følgende primere ble brukt:
SIAH2 fremover: 5′-CTATGGAGAAGGTGGCCTCG-3 «
SIAH2-vendegir: 5′-CGTATGGTGCAGGGTCAGG-3′
DYRK2 fremover: 5′-GTGGTCAAGGCCTACGATCACA-3 «
DYRK2-revers: 5′-CCGCAGGTGTTCCAGGATTC-3′
HPRT fremover: 5′-ATGGGAGGCCATCACATTGT-3 «
HPRT-vendegir : 5′-ATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3 «
β-actin-forward: 5′-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3′
β-actin-vendegir: 5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 «
Western blotting og antistoffer
Totalt proteinekstrakter fra lungekreft prøver og matchet ved normal lunge ble hentet fra RNAlater
® bevart vev. Membranene ble først inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (anti-SIAH2: sc-5507, fortynning 1: 500, Santa Cruz, anti-DYRK2: AP7534a, fortynning 1: 500, Abgent, anti β-actin: klon C4, fortynning 1: 1000, Santa Cruz). Vaskede Membranene ble deretter inkubert med passende sekundære antistoffer koblet til pepperrotperoksidase. SIAH2 protein signalintensitet på vestlige blotter ble analysert og kvantifisert ved hjelp ImageJ v1.45 programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/), etter normalisering p-aktin signal intensiteter.
BEAS-2B plateepitel-celledifferensiering modell
BEAS-2B celler ble kjøpt fra Sigma (Sigma,. europeisk Innsamling av cellekulturer, Salisbury, UK 95102433) og vedlikeholdes i serum gratis LHC-9 medium (Life Technologies, Carlsbad, CA , USA) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2. Squamous differensiering ble kjøpt etter dyrking i LHC-9 medium beriket med 10% FBS i løpet av 7 dager.
Statistical Analysis
Pearsons khikvadrattest og Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere forskjeller mellom kategoriske variabler. Uparet t-test ble brukt for å sammenligne midler mellom to kvantitative variable fra normalfordelte data, og Mann-Whitney test for ikke-normalfordelte data. Kruskal-Wallis-test ble anvendt for variabler med mer enn to kategorier. Lineære regresjonsanalyser ble utført for å vurdere forholdet mellom to kontinuerlige variabler. Kontinuerlige variabler er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Kategoriske variabler er uttrykt som teller og proporsjoner. Forskjeller med p-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av SPSS (SPSS 20.0 for Mac: SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Den mRNA uttrykk for SIAH2 endres ikke i menneskelig lungekreft
Sytti-seks kirurgisk resected humane lungekreft prøver med matchet prøver av tilstøtende normalt lungevev ble undersøkt (n = 36 ADC, n = 40 SCC). De clinicopathological egenskapene til hele pasientmateriale er oppsummert i tabell 1. Endringer i ekspresjon av SIAH2 i tumorprøver, sammenlignet med normale lungeprøver ble uttrykt som en fold-endring. Som vist i figur 1, ble små forskjeller i SIAH2 genekspresjon funnet i både ADC og SCC prøver, selv om det ikke er vesentlig.
Total RNA ble ekstrahert fra vevene, integritet evaluert (alle prøver inkludert viste en RIN ovenfor 9 ) og endringer i uttrykket av SIAH2 i tumorprøver sammenlignet med normale lunge prøver fra samme pasient analysert ved qPCR og uttrykt som en fold-endring. Forsterkning effektivitet ble validert og normalisert mot β-aktin og HPRT, og brett endring i genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Resultater representerer gjennomsnitt ± SD.
SIAH2 proteinnivåer overexpressed i human lungekreft
Vi neste undersøkt om SIAH2 protein uttrykk endres i human lungekreft. For dette formål ble de totale proteiner ekstrahert fra de samme 76 lungekreft prøvene anvendt ovenfor, og SIAH2 protein ekspresjon i lungekreft vevet i forhold til normalt lungevev ble undersøkt ved Western blot. SIAH2 protein ekspresjon i lungekreft prøver ble sammenlignet med den tilsvarende friskt vev etter normalisering til actin signalintensiteter, og uttrykt som relativ OD uttrykket (Representative gel i fig S1). Som vist i figur 2, har vi funnet at SIAH2 protein-ekspresjon ble betydelig økt i både ADC og SCC prøver sammenliknet med normalt lungevev (Fig 2A og 2B). Dessuten, etter analysering av folden induksjon av SIAH2 i tumorprøver, sammenlignet med normale lungeprøver fra samme pasient, ble den høyeste SIAH2 protein uttrykk som finnes i ADC, hvor ekspresjon ble økt med 4 ganger sammenlignet til SCC, som viste en 2 -doble økning i SIAH2 proteinnivåer (figur 2C).
(A, B) Totale proteiner ble ekstrahert fra ADC eller SDC prøver og den tilsvarende normale lungevevet, SIAH2 proteinekspresjon analysert ved hjelp av western blot og båndene kvantifisert av densitometry etter normalisering til aktin signalintensitet. Resultatene er uttrykt som relativ OD ekspresjon og representerer gjennomsnittet ± SD. **
p
0,001. (C) Fold induksjon representasjon av SIAH2 i tumorprøver, sammenlignet med normale lungeprøver fra samme pasient. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD. (D) Resultater fra 16 pasienter (8 ADC og 8 SCC) er valgt for å representere et område av differensial mRNA-ekspresjon mellom normalt lungevev (N) og tumor (T). SIAH2 protein uttrykk ble analysert ved immunoblotter (øvre panel) og mRNA uttrykk ved qPCR (nedre panel). Dataene er gjennomsnitt ± SD av n = 3 forsøk. **
p
0,001 og ***
p
0,0001.
På grunn av forskjellen i induksjon observert mellom SIAH2 mRNA og protein nivå, bestemte vi oss for å analysere nærmere et utvalg av 16 prøver (8 ADC og 8 SCC). Disse prøver ble valgt for å representere et bredt spekter av SIAH2 mRNA differensialuttrykk mellom tumor og normalt vev. Som vist i figur 2D, i de fleste tilfellene SIAH2 proteinekspresjon er forhøyet i tumorer, uavhengig av mRNA-ekspresjon. Disse resultatene indikerer klart at det foreligger en endring eller endring i kontrollmekanismer på post-transkripsjonsnivået i tumorceller sammenlignet med friske vevet.
SIAH2 uttrykk økes i høy grad lungekarsinom
for å teste om SIAH2 uttrykk kan være korrelert med lunge kreftutvikling, bestemte vi oss for å evaluere SIAH2 uttrykk og sin lokalisering mønster i lungekreft med immunhistokjemi i hele pasient kohort. Vi observerte at SIAH2 ekspresjon var meget påvises i begge hovedtyper av human lungekreft, blir uttrykket overveiende atom (figur 3). Moderat til sterk homogen farging ble identifisert i lungekreft eksemplarer sammenlignet med normal lungevevet, som viste isolerte og sporadiske mobilnettet misfarging.
Representative bilder av lunge svulst og tilstøtende normalt vev farget med SIAH2 antistoff og hematoxylin-eosin (HE ) (x100).
For ytterligere å undersøke om endogen SIAH2 protein uttrykk endres med lunge svulst aggressivitet, analyserte vi SIAH2 uttrykk i ulike menneskelige lungekreft, inkludert godt differensiert ADC, dårlig differensiert ADC og SCC. Som vist i figur 4, er prosentandelen av tumorceller som uttrykte SIAH2 øket med den histologiske tumor karakter, er størst i dårlig differensierte lungekreft prøver. Videre ble en forskjell på SIAH2 uttrykk mellom SCC og ADC oppdaget, med SCC blir mer intenst farget for SIAH2 forhold til ADC.
Representative bilder av immunhistokjemisk analyse av SIAH2 i normal lunge, godt og dårlig differensiert adenokarsinom og squamous cell carcinoma. Sporadisk atom positivitet i normal lunge, moderat farging i godt differensiert adenokarsinom og sterk farging i dårlig differensiert adenokarsinom og plateepitelkreft (HE: hematoxylin-eosin) (x100)
Sammenhengen mellom SIAH2 uttrykk og clinicopathological. funksjoner
for å evaluere den biologiske betydningen av SIAH2 uttrykk i menneskelig lungekreft, undersøkte vi sammenhengen mellom ulike clinicopathological egenskaper (S1 Table) og endringer i SIAH2 uttrykk nivåer (mRNA og protein) i svulster i forhold til sunn lungevev . IHC data ble ikke inkludert fordi SIAH2 uttrykk var positiv i alle svulster. Den syvende utgaven av TNM klassifisering for lungekreft (Lung Cancer Staging Project, International Association for studier av lungekreft-IASLC) [27] ble brukt for iscenesettelsen. Det er bemerkelsesverdig at SIAH2 protein uttrykk viste en sterk sammenheng med SUV (max) i primær NSCLC (
p
= 0,014). Videre øker tumorstørrelse korrelert med høyt opptak av
18FDG i PET /CT-skanner (
p
= 0,012) (fig 5).
(A) Positiv korrelasjon mellom SIAH2 protein uttrykk og 18FDG opptak (målt som maks standardiserte opptak verdi SUVmax) i primær NSCLC (
p
= 0,014), r2 = 0,13). (B) Positiv sammenheng mellom økende tumorstørrelse og 18FDG opptak på PET /CT-skanner (
p
= 0,012, r2 = 0,12).
DYRK2 protein uttrykk er redusert i human lunge kreft
Deretter bestemte vi oss for å korrelere SIAH2 uttrykk med noen av sine underlag. Vi deretter analysert den mulige virkningen av tidligere vist gjensidig regulering mellom SIAH2 og DYRK2 i human lungekreft [26] av immunhistokjemi. DYRK2 spiller en viktig rolle på DNA skade-signalveien og dens lunge uttrykket har ikke vært dypt undersøkt ennå. DYRK2 ble bestemt i den fullstendige pasientmateriale og representative bilder er vist i figur 6A. Vi har observert en signifikant økning i DYRK2 ekspresjon i friske lungeprøver, sammenlignet med tilsvarende lungekreft prøver, noe som tyder på at SIAH2 overekspresjon er forbundet med redusert ekspresjon av dets substrater.
(A) Representative bilder av adenokarsinom eller skvamøst cellekarsinom, og tilstøtende normalt vev farget med DYRK2 antistoff (x100). (B) BEAS-2B-celler ble dyrket med eller uten serum i løpet av 7 dager, lysert og protein-ekspresjon ble undersøkt ved immunblot med de angitte antistoffer (øvre panel) og mRNA ekspresjon ved qPCR (nedre panel). Representant blot ut av tre uavhengige eksperimenter og posisjoner og molekylvekt (i KDA) er indikert.
Til slutt bestemte vi oss for å vurdere de nevnte resultater ved å bruke en
in vitro
differensiering modell av stamceller til lungekreft. Derfor har vi undersøkt SIAH2 og DYRK2 protein og mRNA uttrykk nivåer i menneske bronkial epiteliale cellelinje BEAS-2B. En invers uttrykk mellom SIAH2 og DYRK2 protein-ekspresjon ble funnet, enten i normale epitelceller eller når den utsettes for skvamøst differensiering (figur 6B), uten å observere betydelige endringer i mRNA-nivå. Derfor, observerte vi at DYRK2 ekspresjon ble betydelig redusert i skvamøse fenotype, sammenlignet med normale epitelceller. Tvert imot, SIAH2 nivåene økte signifikant følgende fenotype squamous differensiering. Disse resultatene ved bruk av en
in vitro
differensiering modell forsterke sammenhengen mellom SIAH2 proteinekspresjon og lungecarcinom observert i prøver fra mennesker, som også er forbundet med en redusert ekspresjon av substrater slik som DYRK2.
diskusjon
Aktuell litteratur inneholder motstridende data med hensyn til rollen Siah i kreft progresjon. Det er derfor av avgjørende betydning for å studere enkelte skjema separat for å diskriminere deres dominerende rolle i utviklingen av forskjellige neoplasmer. Likevel har data fra
in vitro
studier, dyremodeller eller pasient kohorter demonstrert en dominerende rolle SIAH2 som et onkogen i solide svulster og leukemogenesis [12, 19, 28-30]. Våre resultater støtter denne hypotesen, fremhever at den observerte økningen i SIAH2 uttrykk avhenger av histologiske tumor klasse.
Betydningen av den rollen SIAH2 i tumorigenesis er validert i ulike undersøkelser som prøvde å modulere både sin overflod og sin aktivitet. Schmidt RL og medarbeidere [31], konstruert mutant Siah1 /2 proteiner med inaktivert E3 ligase aktivitet, og derfor sperret selv-ubiquitinering og substrat degradering. De fant at redusert Siah funksjon økt celle apoptose og hadde hemmende effekt på tumorvekst, som konkluderte med at Siah formidler onkogene Ras-mediert tumorigenesis i bukspyttkjertelkreft. Den samme gruppen publiserte den første arbeidet som analyseres i detalj rolle Siah proteiner i lungekreft [32]. Forfatterne demonstrerte at SIAH2 spiller en viktig patogen rolle i human lungekreft og derfor åpnet en mulighet til å hemme Siah virkning som et nytt anticancer mål. Selv om konklusjonene var hovedsakelig basert på human cellelinje eksperimenter, en foreløpig tilnærming ved hjelp av menneskelig lungekreft prøvene viste en sterk sammenheng mellom økt Siah protein uttrykk og tumor celleproliferasjon. Men den store ulempen med denne studien er at hvis ikke klarer å skille mellom de to medlemmer av familien, SIAH1 og SIAH2. Videre er detaljert SIAH2 uttrykk på ulike nivåer mangler.
I en annen studie adressering rolle SIAH1 og SIAH2 i en syngene modell av brystkreft [33], forfatterne observert at blokade av Siah-substrat bindingssete resulterte i redusert tumorvekst og angiogenese. Disse funnene er også i overensstemmelse med de som er rapportert av Qi J og kolleger [34] i en muse SW1 melanom modell. Hemming av SIAH2 aktivitet gjennom en ring mutant, dominant-negativ form for SIAH2 redusert tumordannelse, mens blokade av SIAH2-substrat bindingssetet redusert metastaser, men ikke har en innvirkning på tumordannelse. Den samme gruppen undersøkt bidrag SIAH2 i TRAMP modell av nevroendokrin prostatakreft [19]. Viktigere, genetisk knockout av Siah2 dempet utviklingen av nevroendokrin prostata kreft. Videre er både hyppigheten og størrelsen av metastatiske lesjoner ble betydelig redusert. I tråd med denne observasjonen, i en brystkreftmodell fant forfatterne at tapet av SIAH2 forsinket begynnende svulstdannelse redusert stromal infiltrering, økt tumor perfusjon gjennom normalisert tumor vaskulaturen, redusert produksjon av proangiogenic vekstfaktorer og til slutt ført til et økt følsomhet kjemoterapi [28].
Nylig, Muller og kolleger har demonstrert hvordan SIAH2 akselererer proteasomal nedbrytning av TYK2, som fører til STAT3 inaktivering i lungekreftceller [35]. De viste også en invers korrelasjon mellom ekspresjonen av begge proteiner i NSCLC-prøver fra forskjellige pasientkullene. Videre fant de også at SCC viste signifikant høyere nivåer av SIAH2 forhold til ADC. Disse resultatene er overensstemmende med de som ble oppnådd i foreliggende arbeide, der immunhistokjemisk analyse viste en høyere SIAH2 uttrykk i SCC prøvene sammenlignet med prøver ADC. Disse resultatene fremheve ikke bare betydningen av SIAH2 uttrykk, men også ekspresjonen av noen av de substrater som spiller nøkkelroller i regulering av kreftcellevekst og karsinogenese. Vi hadde tidligere vist en gjensidig regulering mellom DYRK2 og SIAH2, der SIAH2 formidler DYRK2 ubiquitinering og styrer sitt uttrykk som respons på hypoksi [26]. DYRK2 er et medlem av en evolusjonært konservert familie av dual-spesifisitet tyrosinfosforylering regulert kinaser (DYRKs) som spiller en viktig rolle i den DNA-skade-signalveien og celleproliferasjon. Selv om rollen DYRK2 i kreft progresjon er fortsatt uklart, har en lavere uttrykk i invasive svulster blitt beskrevet [36]. Vi demonstrerte hvordan økningen i SIAH2 uttrykk dermed undertrykker DYRK2 uttrykk. Disse resultatene tyder på muligheten for at oppbyggingen av SIAH2 kan være omvendt korrelert med ekspresjonen av viktige proteiner som styrer tumorprogresjon og invasjon, som DYRK2 eller STAT3, peker ut SIAH2 som et potensielt terapeutisk mål.
For det første gang, evaluert vi SIAH2 uttrykk på ulike nivåer i primær lungekreft sammenlignet med tilstøtende normalt lungevev. Vi fant en trend mot en induksjon av SIAH2 genuttrykk i SCC i forhold til tilstøtende normalt lungevev, men ikke signifikant. Tvert imot, vi fant ikke forskjeller i SIAH2 genekspresjon i ADC prøver. Dette står i sterk kontrast med SIAH2 proteinekspresjon undersøkt ved western blot, som var signifikant økt i både ADC og SCC prøver sammenliknet med normalt lungevev. Disse resultatene klart peker mot mulig eksistens av noen endring på post-transkripsjonsnivået i tumorceller sammenlignet med friske vevet. Til dags dato er SIAH2 fosforylering kanskje den viktigste kontrollmekanismen av SIAH2 selv ubiquitinering og degradering [26, 37, 38]. Forandringer eller endringer i uttrykket av disse kinaser i stand til å fosforylere SIAH2 i tumorceller kan være en av de underliggende mekanismene som er ansvarlig for denne forskjellen mellom mRNA og protein uttrykk.
De skiller seg ut som den høyeste SIAH2 protein uttrykk var funnet i ADC histologi forhold til SCC histologisk analysert ved western blot, siden analysen gjennom immunhistokjemi viste forskjellige resultater. Men disse resultatene parallelt en tidligere undersøkelse som viser en høyere ekspresjon av SIAH2 i SCC i forhold til ADC analysert ved hjelp av immunhistokjemi i tre forskjellige kullene [35]. Tumorstørrelse er en velkjent prognostisk faktor i NSCLC, og er assosiert med FDG opptak i PET /CT-skanner. Etter avtale, har vi funnet en sterk sammenheng mellom økende tumorstørrelse og
18FDG opptaket målt som SUV (max), og kan være nyttig for å forutsi NSCLC pasient prognose. Enda viktigere, SIAH2 protein uttrykk viste en sterk sammenheng med
18FDG opptak, som kan hjelpe klinikere i stratifying pasienter med økt generell risiko for dårlig overlevelse.
Konklusjoner
Våre funn tyder på en viktig Sammenhengen mellom ekspresjonen av SIAH2 og lungekreft, som også er forbundet med den histologiske tumor karakter,
18FDG opptak og med en nedgang i ekspresjon av SIAH2 substrater såsom DYRK2. Disse resultatene understreker mulig bruk av SIAH2 som diagnostisk og prognose markør i lungekreft. Spesielt våre funn tyder på at analysen av SIAH2 kan forbedre diagnostisering av lungekreft, og kunne utdype dagens kunnskap om sin prognose. Videre kan det også bli en mulig terapeutisk mål for NSCLC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Representant gel av SIAH2 protein uttrykk i lungekreft prøvene sammenlignet med tilsvarende friskt vev etter normalisering til aktin signalintensitet.
Verdiene under gels indikere SIAH2 og aktin protein signalintensitet (kvantifisert ved hjelp ImageJ). SIAH2 relative OD uttrykk i tumorprøve i forhold til normalt vev ble beregnet etter normalisering til aktin signalintensitet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0143376.s001 plakater (TIFF)
S1 Table.
