Abstract
Bakgrunn
Glioblastoma er den hyppigste og mest ondartet primær hjernesvulst med en dårlig prognose. Oversettelsen av terapeutiske strategier for glioblastom fra den eksperimentelle fasen inn i klinikken har vært begrenset av utilstrekkelige dyremodeller, som mangler viktige funksjoner i humane tumorer. Lentiviral genterapi er et attraktivt terapeutisk alternativ for menneskelig glioblastom, som vi validert i et klinisk relevant dyremodell.
metodikk /hovedfunnene
Vi brukte en gnager xenograft modell som sammenfatter den invasive og angiogene funksjoner i menneske glioblastom å analysere transduksjon mønster og terapeutisk effekt av lentiviral pseudotyped vektorer. Både lymfatisk choriomeningittvirus glykoprotein (LCMV-GP) og vesikulær stomatitt viruset glykoprotein (VSV-G) pseudotyped lentiviral vektorer svært effektivt omsatte menneskelige glioblastom celler
in vitro Hotell og
in vivo
. I kontrast, pseudotyped gammaretroviral vektorer, tilsvarende de som evalueres for klinisk behandling av glioblastom, viste ineffektiv genoverføring
in vitro Hotell og
in vivo
. Begge pseudotyped lentivirale vektorer transdusert kreft stilk-lignende celler kjennetegnet ved deres CD133-, nestin- og SOX2-ekspresjon, evnen til å danne kuler i neural stamcelle medium og å uttrykke astrocytic og neuronal differensiering markører i henhold til serumforhold. I en terapeutisk tilnærming ved hjelp av selvmords genet herpes simplex virus tymidinkinase (HSV-1
-tk
) smeltet til EGFP, både lentiviral vektorer formidlet en komplett remisjon av solide svulster som ses på MR som resulterer i en svært signifikant overlevelses fordelen (p 0,001) sammenlignet med kontrollgruppene. I alle tilbakevendende svulster, ble overlevende EGFP-positive tumorceller funnet, talsmann prodrug program for flere sykluser å selv forbedre og forlenge terapeutisk effekt.
Konklusjon /Betydning
I konklusjonen, lentiviral pseudotyped vektorer er lovende kandidater for genterapi av gliom hos pasienter. Den ineffektive genet levering av gammaretroviral vektorer er i tråd med resultatene oppnådd i klinisk terapi for GBM og dermed bekrefter høy reproduserbarhet av invasiv glioma dyremodell for translasjonsforskning
Citation. Huszthy PC, Giroglou T, Tsinkalovsky O, Euskirchen P, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et al. (2009) Synds Invasiv, Cancer Stem-Like Glioblastoma xenografter Bruke Lentiviral Vector-mediert Suicide Gene Therapy. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10,1371 /journal.pone.0006314
Redaktør: Chris Jones, Institutt for kreftforskning, Storbritannia
mottatt: 9 mars 2009; Godkjent: 23 juni 2009; Publisert: 20.07.2009
Copyright: © 2009 Huszthy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Forskningsrådet Norge (gi 186 492 til HM), den norske Kreftforening, Helse Vest, Haukeland universitetssykehus, Bergen Translasjonell Research Programme, EU-kommisjonen sjette rammeprogram (Contract 504 743) og ved Koeln Fortune Program ved Universitetet i Köln (tilskudd 28/2006 til HM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Glioblastoma er den hyppigste og mest ondartet primær hjernesvulst. Til tross for fremskritt innen nevrokirurgi, stråling og kjemoterapi, prognosen for pasienter fortsatt dårlig med en median overlevelse på 14 måneder [1].
En stor ulempe i translasjonell kreft i hjernen forskning har vært mangelen på egnede dyremodeller. Syngeneic- eller xenografttumorer basert på glioblastom cellelinjer dyrket som monolag vokse som avgrenset og svært angiogene lesjoner
in vivo product: [2], mangler de invasive kreftceller, som representerer en viktig funksjon av menneskelig glioblastom. De invaderende celler migrerer bort fra den innledende tumormassen og kan forårsake tilbakevendende svulster i forskjellige deler av hjernen. Dermed disse cellene representerer et stort terapeutisk mål.
En nylig etablert modell der glioblastom biopsibaserte kuler blir serie passert i hjernen til nakne rotter viser svært invasive og angiogene funksjoner [3]. Derfor er denne modellen godt egnet for studiet av nye terapeutiske strategier. Likevel, rapporter ved hjelp av denne eller andre klinisk relevante modeller for eksperimentell terapi er mangelvare. Nylig, analyserte vi det terapeutiske potensialet av HSV-1-basert onkolytisk Herpes vektor G207 i biopsi sfæroide baserte GBM modell. Tumorvolumet i behandlede dyr ble redusert sammenlignet med kontrollgruppene, men det var ingen signifikant overlevelse fordel [4]. I motsetning til dette den samme behandlingen var mer effektivt i en celle-linje-basert dyremodell [5] og som et resultat blir for tiden undersøkt i et fase I /II klinisk studie [6]. I den foreliggende undersøkelsen brukte vi invasiv xenograft modell for å evaluere transduksjon og terapeutisk effekt av lentiviral pseudotyped vektorer.
Gammaretroviral vektorer avledet fra Moloney murine leukemia virus (MMLV) har vært de mest brukte retrovirus for genterapi av hjernesvulster [7] – [10]. Men til tross for lovende resultater i dyremodeller, har kliniske studier med retrovirale vektor supernatanter eller retrovirale emballasje celler mislyktes [11] – [13]. En stor ulempe med gammaretroviral vektorer er den eksklusive transduksjon av delende celler, da det i humane gliomer, gjør de fleste tumorceller som ikke deler innenfor et gitt behandlingsvindu. Derfor lentivirale vektorer med deres evne til også å transdusere ikke-delende celler er attraktive kandidater for behandling av kreft i hjernen. I tidligere studier har vi utviklet gammaretroviral og lentivirale vektorer pseudotyped med glykoproteiner (GP) av lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV) [14], [15]. Disse vektorene har et bredt vertsområde og kan konsentreres ved ultrasentrifugering for
in vivo
applikasjoner. I tillegg er LCMV-GP ikke er cytotoksisk, og stabile rekombinante emballasjecellelinjer kan etableres [16], [17]. Nylig viste vi at lentiviral LCMV-GP pseudo effektivt levert transgener til rotte glioma celler
in vivo
, mens bosatt nevronene ikke ble omformet [18]. Videre viste vi en betydelig terapeutisk effekt av LCMV-GP pseudotyped lentiviral vektorer i cellelinje basert 9L rotte glioma modellen ved hjelp av selvmordsgenet HSV-1
tk
. VSV-G lentivirale pseudotyper viste også en betydelig effekt, lik som LCMV pseudotyper, som i hovedsak er mediert av en bystander virkning av transduserte normale hjerneceller [19].
I det presenterte arbeid, vi viste at både , VSV-G og LCMV-GP pseudotyped lentiviruses effektivt omsatte humane glioma celler
in vitro Hotell og
in vivo
, mens gammaretroviral transduksjon var ineffektive. Den genoverføring til gliomceller var effektiv for begge lentivirale pseudotyped vektortyper. Men det var mer spesifikk hjelp LCMV-GP pseudotyped vektorer, som VSV-G pseudo også transduced vertshjerneceller i invasive områder. Analyse av transduserte tumorceller viste at begge lentivirale vektorer rettet CD133-positive så vel som CD133-negative kreftceller. Videre omsatte glioblastom celler uttrykte stamcellemarkører nestin og SOX2. Viktigere, når de evalueres for terapeutisk anvendelse ved bruk av HSV-1-
tk
som et transgen, begge lentivirale vektorer mediert fullstendig tumorregresjon på MR, noe som resulterer i en svært signifikant overlevelsesfordel (p 0,001) sammenlignet med kontrollgruppene .
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
samlingen av menneskelige vevsprøver ble godkjent av regional etisk komité. Håndteringen av dyrene og kirurgiske prosedyrer ble utført i samsvar med norske dyr loven og lokal etisk komité godkjente protokollen.
Cellelinjer
Den humane embryonale nyrecellelinje 293T (ATCC nummer CRL-11268) og TE671-cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og opprettholdt i Dulbbeco modifiserte eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% glutamin. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Tissue kultur
tumorfragmenter fra glioblastom multi pasienter ble oppnådd under operasjonen. Vevsprøver ble tatt fra levedyktige kreft områder som tilsvarte regioner med kontrastforsterkning på preoperativ MR-skanninger. Prøvene ble overført til prøverør som inneholdt komplett vekstmedium, og sfæroider ble fremstilt som tidligere beskrevet [20]. Den samme metode ble anvendt for tumor materiale passert i nakne rotter. Kort fortalt ble vevsprøver hakket inn ~0.5 mm fragmenter og plasseres i 80 cm
2 vevskulturflasker (Nunc, Roskilde, Danmark) base belagt med 0,75% agar (Difco, Detroit, MI). Sfæroidene ble opprettholdt i en standard vevskultur-inkubator med 5% CO
2 og 100% relativ fuktighet ved 37 ° C. Mediet ble endret en gang i uken. Spheroids med diameter mellom 400 og 600 nm ble valgt for
in vitro
eksperimenter og for intra implantasjon.
Dissosiasjon av svulster
Svulster ble skilt ved hjelp av nevrale Dissosiasjon Kit (Miltenyi , Bergisch-Gladbach, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll
flowcytometrisk analyse og celle sortering
Celler ble analysert og sortert på en MoFlo celle sorter (Beckman Coulter, USA;. tidligere Cytomation, USA), som er utstyrt med en sammenhengende Enterprise 621 argon-ion-laser innstilt på 488 nm (anvendt ved 180 mW), og 635 nm Diode (25 mW). To ug /ml propidiumjodid – PI (Molecular Probes) ble tilsatt til prøvene før strømnings sortering for å lette diskriminering døde celler. GFP og PI var spent på 488 nm og fluorescens ble målt gjennom 530/40 BP og 613/20 BP optiske filtre (alle filtre fra Omega Optical, Brattleboro, VT, USA), henholdsvis. Dubletter ble diskriminert ved hjelp av en fremover lysspredning (FSC) versus pulsbredde. FL3 kanal (i logaritmisk modus) med FSC ble brukt til å vise og gate ut PI positive /døde celler. FSC og sidelys scatter (SSC) signaler ble oppdaget og vist i lineær modus. GFP + -celler ble definert på SSC versus FL1 (i logaritmisk modus) dot plottet etter utelukkelse av døde celler og rusk som ovenfor beskrevet.
For analyse av CD133 uttrykk celler ble farget med allofykocyanin (APC) konjugert monoklonalt CD133 /1 (AC133) antistoffer (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Tyskland), i henhold til produsentens generell protokoll for immunfluorescens farging (for 10 minutter i mørke ved 4 ° C). CD133-APC ble eksitert ved 635 nm, ble fluorescens målt gjennom 670/30 BP optisk filter, og levende CD133 + celler ble definert på SSC versus FL6 (i logaritmisk modus) prikkplott. Ikke-farget cellesuspensjon ble anvendt som en kontroll.
GFP + tumorceller ble sortert i «rense en» -modus inn i polypropylen rundbunnet Falcon-rør (Becton Dickinson Labware Europa, Frankrike) inneholdende dyrkningsmedier, som ble plassert på is. Aliquoter fra noen prøver på slutten av sorterings ble fjernet og analyseres på nytt for kontroll av den typen renhet som var større enn 98%.
kultur av sorterte cellene
sorterte cellene ble enten dyrket i Neurobasal medium (Invitrogen, Carlsbad, California) med B27 supplement (20 ul /ml, Invitrogen), Glutamax (10 ul /ml, Invitrogen), fibroblast vekstfaktor 2 (20 ng /ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ), epidermal vekst faktor (20 ng ml; Peprotech) eller overført til DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% glutamin og dyrket på dekkglass i 24 brønners plater
Immunfluorescens farging av kulene /adherente celler
Spheroids /heftende celler ble farget med human-spesifikke mus-anti-nestin antistoffer (Millipore, Bille, MA), geit-anti-SOX2 antistoffer (R D), mus-anti-β-tubulinIII (Millipore ) antistoffer og mus-anti-GFAP antistoffer (Millipore). Primære antistoffer ble inkubert over natten ved 4 ° C. Alexa-Fluor647-geit-anti-mus und Alexa-Fluor647-esel-anti-geit antistoffer (Dianova, Hamburg, Tyskland) ble brukt som sekundære antistoffer over natten ved 4 ° C (for kuler) eller i 2 timer ved romtemperatur (for adherente celler). Spheroids ble undersøkt under et fluorescens mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) og tilhenger celler ble analysert ved konfokal scanning laser mikroskopi (Zeiss, Jena, Tyskland).
Lentiviral og Retrovirale vektorer
lentiviral vektor plasmid pRRL.sinCMVeGFPpre ble publisert av Naldini et al. [21]. Byggingen av lentiviral vektor pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre har blitt beskrevet tidligere. Den retrovirale vektor pMP71-EGFP-pre har blitt beskrevet tidligere [22].
Fremstilling av lentiviral og retrovirale vektor supernatantene
293T cellelinje ble brukt for transient lentiviral vektor produksjon. Den lentiviral vektor plasmid pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre (5 mikrogram) eller pRRL.sinCMVeGFPpre (5 mikrogram), HIV gag-pol-REV uttrykk plasmid pCMV-dR8.91 (12,5 mikrogram) [21] og 2 mikrogram av konvolutt ekspresjonsplasmid pHCMV-LCMV-GP [14] eller pCMV-G [23] ble kotransfektert inn i 293T-celler og konsentrert som tidligere beskrevet [18]. For fremstilling av retrovirale vektorer, ble 293T-celler transfektert med 7,5 ug pMP71-EGFP-pre, 12,5 ug pSV-Mo-MLVgagpol, og 2 ug av konvolutten ekspresjonsplasmid pHCMV-LCMV-GP [14] eller pCMV-G [23]. Vektorer ble høstet og konsentrert som beskrevet tidligere [24].
Titrering av virusvektor supernatanter
vektorer ble titrert på TE671 celler som beskrevet tidligere [18].
Implantasjon av glioblastom kuler
Intrakraniell implantasjon av glioblastom kuler ble gjort som beskrevet tidligere [25].
Vector infusjon
Tre uker til en måned etter implantering, ble dyrene bedøvet og forberedt for vektor injeksjon. Skinnet ble trukket tilbake for å vise plasseringen av kraniotomi. 2 ganger 10 mL av vektor aksjer ble levert inn til sentrum av svulstene ved hjelp av en glassprøyte (modell 701, Hamilton, Bonaduz, Sveits) festet i en mikroprosessorstyrt infusjonspumpe (UMP 2-1, Verden Precision Instruments, Aston, Stevenage , UK). Injeksjons koordinater ble estimert etter å analysere MR-bilder for hver enkelt lesjon. Vektor infusjonen ble gjort ved konveksjon forbedret tilførsel i løpet av 25 min (200 nl /min i 10 min, etterfulgt av 400 nl /min i 10 min, og til slutt 800 nl /min i 5 min). Etter infusjon ble kanylen på plass i 5 min for å unngå vektor tilbakeløp. Nålen ble sakte trukket tilbake og skinfolds ble lukket med polyamid kirurgisk tråd. Etter operasjonen ble rotter lov til å komme i en inkubator innstilt på 35 ° C før du returnerer dem til merdene.
Behandling av rotte gliomer
Rotter bærer glioblastom xenotransplantater ble behandlet av daglig i.p. injeksjoner av 50 mg /kg ganciklovir (GCV, Roche, Basel, Sveits).
Analyse av rottehjerner
Dyrene ble avlivet og dynket med sterilt saltvann og deretter med 4% paraformaldehyde. Hjernene ble fjernet, suspendert i 30% sukrose i tre dager, og deretter hurtigfrosset i isopentan avkjølt med tørris. Koronale seksjoner (12 mikrometer) var forberedt på en cryostat. For immunfluorescens analyse, ble seksjonene farget med menneske-spesifikke anti-nestin antistoffer (Millipore) for menneske glioblastom celler, mus-anti-Neun (Millipore) antistoffer for nevroner, rotte spesifikke mus-anti-nestin antistoffer (Millipore) for astrocytter og stamfar celler. Primære antistoffer (fortynning 1:200) ble inkubert over natten ved 4 ° C. Biotinylert geite-anti-mus og geit-anti-kanin (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) ble anvendt som sekundære antistoffer (fortynning 1:100) i 2 timer ved romtemperatur. Seksjoner ble inkubert med Extravidin-Cy3 (Sigma, St. Louis, MO) som fluorokrom (fortynning 1:200) i 1 time ved romtemperatur. Seksjonene ble undersøkt under et fluorescens mikroskop (Nikon) og analysert ved hjelp av konfokal laser-skanning mikroskopi (Zeiss, Jena, Tyskland).
For analyse av transduksjon effekt, på hverandre følgende seksjoner (hver 20.-30.) Gjennom hele tumorer ble undersøkt under et fluorescens mikroskop (Nikon) med en automatisert trinn ved anvendelse av 10 x forstørrelse. Transduksjon volum ble beregnet ved hjelp av Nikon Lucia bildebehandlingsprogrammer.
Farging av parafinsnitt
Parafin innebygd formalinfikserte vevssnitt fra rottehjerne og pasientmateriale ble plassert i xylen bad i 2 × 3 minutter , absolutt etanol 2 x 3 minutter, 96% etanol 2 x 2 minutter og til slutt i destillert vann i 30 sekunder for fjernelse av parafin og rehydratisering. Epitop gjenfinning ble utført ved oppvarming av seksjonene ved 99 ° C i 20 minutter i 10 mM citratbuffer ved pH 6,0. Snittene ble inkubert med et monoklonalt human-spesifikt anti-nestin antistoff 1:200 i TBS /1% BSA over natten ved 4 ° C. Et biotinylert geit-anti-mus-antistoff (Vector Laboratories) ble anvendt som sekundært antistoff (fortynning 1:100) i 1 time ved romtemperatur fulgt av ABC-kompleks inkubering i 30 min. Snittene ble utviklet med med 3’3-diaminobenzidin (DAKO Cytomation), etter produsentens anvisninger.
Magnetic resonance imaging
Ved hjelp av en Bruker Pharmascan 7 Tesla MR scanner (Bruker Biospin, Billerica, MA ), aksial T2-vektet RARE sekvenser ble kjøpt (repetisjon tid, 4200 ms, ekko tid, 36 ms, skivetykkelse, 1 mm; synsfelt, 3,2 cm, matrisestørrelse, 256 × 256, 20 stykker). Under skanning ble dyrene holdt under bedøvelse med 1,5% isofluorane (Schering-Plough, Kenilworth, NJ) blandet med 50% luft og 50% O2.
Statistisk analyse
Overlevelse ble analysert ved hjelp en log-rank test basert på Kaplan-Meier test i SPSS programvare. Forskjeller mellom par av gruppene ble bestemt av Student
t
-test.
P
verdier 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Lentiviral pseudotyped vektorer effektivt transduce glioblastom kuler
in vitro
Menneskelig glioblastom. kuler som stammer enten direkte fra pasienten (lav generasjon) eller fra serie
in vivo
passasjer i hjernen til nakenrotter (høy generasjon), ble smittet med lentiviral LCMV-GP (5 × 10
4 i 10 mL) eller VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer (begge 5 × 10
4 partikler i 10 mL) eller med retrovirale MLV-baserte vektorer pseudotyped med LCMV-GP (1 × 10
5 partikler i 10 mL). Vektorene ble fremstilt på samme måte for
in vitro
og
in vivo
eksperimenter (se materialer og metoder). Begge lentiviral vektorer omsatte pasient kuler og høy generasjon kuler svært effektivt (figur 1). I motsetning til dette, retrovirale vektorer transdusert bare noen få enkle celler i høy genererings kulene (figur 1) og mislyktes i å omsette pasient kuler (data ikke vist). I konklusjonen, begge lentiviral vektorer er mye mer effektive i transducing menneskelige glioblastom kuler
in vitro
enn retrovirale vektorer.
Menneskelige glioblastom kuler som stammer fra en pasient biopsi eller etter serieaging i nakne rotter (høy generasjon) ble smittet av lentiviral vektorer pseudotyped med LCMV-GP (5 × 10
4) eller VSV-G (5 × 10
4) eller ved retrovirale vektorer pseudotyped med LCMV-GP (1 × 10
5). Alle vektorer ble uttrykker markørgenet EGFP. Spheroids ble analysert ved konfokal mikroskopi for EGFP uttrykk 7 dager etter smitte. Bildene viser EGFP (grønn), fasekontrast og en overlapping av begge. Lave gen .: kuler direkte utledet fra pasientmaterialet (lav generasjon). Høye gen .: kuler som stammer fra serie
in vivo
passasjer i rottehjerne (høy generasjon). Original forstørrelse 100 ×.
Lentiviral pseudotyped vektorer effektivt og spesielt transduce glioblastom celler
in vivo
Å sammenligne transduksjon effektiviteten av lentiviral og gammaretroviral vektorer
in vivo
, vi brukte en xenograft modell som reflekterer angiogene og invasive egenskaper ved menneskelig glioblastom
in situ
. Den xenograft uttrykker også det nevrale stamfar markør nestin og tett rekapitulerer histologi pasientens tumor (figur 2). Vektorene ble injisert inn i sentrum av progressivt økende lesjoner ved hjelp av mikroprosessorstyrt stereotaktisk infusjon. Injeksjons koordinater ble estimert etter å analysere MR-bilder for hver enkelt lesjon. Injeksjonsvolumet ble brukt, var 2 x 10 mL og vektoren titer 1 x 10
7 /ml for alle vektorer. Transduksjon effektivitet ble bedømt 7 dager etter injeksjon vektor. Begge lentivirale vektorer pseudotyped viste meget effektiv transduksjon av tumorene (figur 3A, D). Når analysert ved høyere forstørrelse, både LCMV-GP og VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer viste effektiv transgen levering til nestin-positive tumorceller i fast (figur 3B, E) og invasive kreft områder (figur 3C, F). I motsetning til dette, den retrovirale vektoren bare transdusert noen få spredte tumorcellene nær injeksjonsstedet (figur 3 G, H). For en kvantitativ sammenligning av transduksjon effektivitet mellom de to lentivirale vektorer pseudotyped ble de GFP-positive områder målt på histologisk snitt (se materiale og metoder). Det totale volumet av transduced svulstvev var 7,05 ± 3,51 mm
3 for LCMV-GP pseudotyped vektorer og 4,05 ± 2,04 mm
3 for VSV-G pseudotyped vektorene (figur 3I). Selv om det var en forskjell i den midlere, det var ikke statistisk signifikant (p = 0,269) på grunn av høye interindividuelle forskjeller (standardavvik)
Parafin deler av pasientens tumor og xenograft tumor ble farget med H E (AD) eller immunostained med menneskelige spesifikke anti-nestin antistoffer (E, F). Pasient tumor (A) og xenograft tumor (B) viser angiogene egenskaper ved menneskelig glioblastom med palisading nekrose (pil) og vaskulære proliferates (pilspisser). Høyere forstørrelse av pasienten (C) og xenograft tumor (D) viser tilsvarende tumorcelle morfologi med polymorfe kjerner i nærheten av en tumor nekrose. Pasient (E) og xenograft tumor (F) viser sterk nestin ekspresjon av tumorceller. Enkelttumorcelleinfiltrasjon inn i den hvite substansen er observert i xenograft tumor (F). Pasienten biopsi ble avledet kun fra den faste tumor kjerne. A, B, E, F: Original forstørrelse 100 ×. C, D: Original forstørrelse 200 ×
Intrakraniale hjernesvulst ble infisert med LCMV-GP eller VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer eller med LCMV-GP pseudotyped retrovirale vektorer som uttrykker EGFP 3-4 uker etter spheroid implantasjon. og analysert ved fluorescens (A, D, G) eller konfokal laser-skanning mikroskopi (B, C, E, F, H) 7 dager etter infeksjon. De confocal bilder viser overlegg av EGFP (grønn fluorescens) og human-spesifikke nestin (rød fluorescens). Tumorer ble effektivt transdusert ved lentiviral LCMV-GP (A-C) og VSV-G (D-F) pseudotyped vektorer, retrovirale vektorer mens bare transdusert få spredte tumorceller (G, H, piler). Transduserte gliomceller uttrykte human-spesifikke nestin i faststoff (B, E, H) og invasiv tumorområder (C, F, piler). (I) Transduksjon effektivitet av lentivirale vektorer ble sammenlignet kvantitativt ved å måle volumet av transduksjon på histologiske snitt ved hjelp av et fluorescens mikroskop og Nikon bildebehandling. LCMV transdusert tumorer (n = 3) hadde en høyere transduksjon volum enn VSV transduserte tumorer (n = 3), imidlertid var forskjellen ikke statistisk signifikant (p = 0,269). A, D: Original forstørrelse 40 ×. C, E, G, H: Original forstørrelse 100 ×. D, F:. Original forstørrelse 200 ×
For å analysere transduksjon spesifisitet, ble histologiske snitt av invasive kreft områder farget for rotte spesifikke markører Neun (for nevroner) og nestin (for astrocytter og stamceller). LCMV-GP pseudotyped lentivirale vektorer utelukkende transduserte tumorceller i alle invasive områder (figur 4A), mens normale hjernecellene ikke ble transdusert (figur 4B, C). Også VSV-G pseudotyped vektorer viste spesifikk transduksjon av tumorceller i enkelte invasive områder (figur 4D, E), men de er også omformet noen vertshjerneceller på andre områder (figur 4G, H).
Intrakraniell hjernesvulst ble infisert med LCMV-GP- eller VSV-G-pseudotyped lentiviral vektorer som uttrykker EGFP 3-4 uker etter svulst implantasjon og analysert konfokal laser scanning mikros 7 dager etter smitte. Transduksjon av invasiv tumorceller ble analysert etter farging med human-spesifikke nestin antistoffer. Verts nevroner og astrocytter ble merket ved hjelp av antistoffer mot Neun og GFAP. Invasive områder viste enkelt celle invasjon av tumorceller (A-C, E, F) eller et subependymal akkumulering av tumorceller (D, G, H). LCMV pseudotyped vektorer spesifikt transdusert invasive glioma-celler (A-C). VSV-G pseudotyped vektorer viste spesifikk transduksjon av tumorceller i enkelte områder invasive (D-F), men også transduksjon av enkelt normale hjerneceller i andre (G, H, piler). Transduced normale hjerneceller ble hovedsakelig oppdaget av morfologiske kriterier (flere prosesser), som farging (GFAP eller Neun) ikke alltid samsvarer med de omsatte cellene. A, D: nestin flekker, forstørrelse 200 ×. B, E, G: GFAP farging, forstørrelse 200 ×. C, F, H:. Neun farging, forstørrelse 200 ×
Lentiviral pseudotyped vektorer transduce kreft-stammen lignende glioma celler
For å analysere potensialet for begge lentiviral vektorer for å infisere kreft stilk-lignende celler transdusert tumorer ble enzymatisk dissosiert og CD133-ekspresjon ble målt ved flow-cytometri. Begge vektorene transduserte CD133-positive og CD133-negative celler (figur 5A). Selv om det var høye interindividuelle forskjeller i den fraksjon av de totale CD133-positive tumorceller i de ulike xenotransplantater, begge vektorer viste lignende effektivitet i transduse CD133-positive celler, som var noe høyere enn den samlede fraksjon av CD133-positive celler (tabell 1) .
Intrakraniale hjernesvulst ble infisert med LCMV-GP eller VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer som uttrykker EGFP 3-4 uker etter svulst implantasjon. Svulster ble skåret ut når store lesjoner dukket opp på MR og ble enzymatisk dissosiert. Transduksjon av CD133-positive celler ble målt ved flow-cytometri. (A) LCMV-GP og VSV-G pseudotyped vektorer transduce CD133 positive og negative tumorceller. Fraksjonen av transduserte (GFP-positive) celler er noe høyere i CD133-positive celler (høyre kolonne) sammenlignet med CD133-negative celler (midterste kolonne). GFP + celler ble sortert, dyrket i nærvær eller fravær av serum og analysert ved hjelp av fluorescens (B-G) eller konfokal mikroskopi (H-O). LCMV-GP (B) og VSV-G (E) transduserte celler form sfæroidene ved kultur i serumfritt nevralt basalmedium supplert med EGF og bFGF. Transduserte sfæroider uttrykke det neurale stamcellemarkører nestin (C, F) og SOX2 (D, G). Transduserte celler dyrket i serumholdig medium uttrykke stammecellemarkører nestin (H, L) og SOX2 (I, M), men også differensieringen markører GFAP (J, N) og beta-tubulinIII (K, O). Bildene C, D, E, F, HO Vis overlapping av virus levert transgenet (EGFP, grønn) og oppdaget antigen (Alexa-647, rød).
GFP- positive celler fra svulster transduced med LCMV-GP eller VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer ble sortert og dyrket i nevrale basal medium supplert med EGF og bFGF. Transduserte tumorceller fra begge vektorer var i stand til å danne kuler (figur 5B, E). Spheroids uttrykt stamcellemarkører nestin og SOX2 (figur 5C, D, F, G). Sortert celler ble også belagt i henhold til serum forhold. Cellene fortsatte å vise betydelig uttrykk for stamcellemarkører nestin og SOX2, men også av differensiering markører GFAP og β-tubulinIII (Figur 5H-O).
Lentiviral pseudotyped vektorer som uttrykker selvmordsgenet HSV-1 –
tk
megle en effektiv terapeutisk effekt
in vivo
for å evaluere den terapeutiske effekten av både lentiviral pseudotyoped vektorer i invasive xenograft modell, vektorer som uttrykker selvmords genet HSV1-
tk
smeltet til EGFP ble injisert i etablerte svulster når synlig på MR ved hjelp av samme metode som beskrevet for
in vivo
tropisme studien. Dyrene ble behandlet daglig med 50 mg /kg ganciclovir i 30 dager med start 7 dager etter injeksjonen vektor. Tumorvekst ble målt hver 7-14 dager etter MR. Etter 4 ukers behandling, 7 av 8 dyr i både LCMV- og VSV-pseudo behandlede gruppene hadde en komplett remisjon på MR (figur 6). Ett dyr i hver gruppe hadde en stabil sykdom frem til slutten av GC-behandling. Alle dyrene i kontrollgruppene utvikles store tumorer i løpet av behandlingsperioden på 30 dager (figur 6). Både LCMV- og VSV-pseudotype-behandlede dyr hadde en meget signifikant overlevelsesfordel (p 0,001) sammenlignet med kontrollgrupper (Figur 7A). Det var ingen statistisk signifikant forskjell i overlevelse mellom de to behandlingsgruppene.
Representant tredimensjonal MRI (T2 RARE). (A, F, K, P) Lentiviral LCMV-GP vektorer med ganciklovir behandling. (B, G, L, Q) Lentiviral VSV-G vektorer med ganciklovir behandling. (C, H, M, R) Lentiviral LCMV-GP vektorer uten ganciklovir behandling. (D, I, N, S) Lentiviral VSV-G vektorer uten ganciklovir behandling. (E, J, O, T) bare ganciclovir behandling. Tidspunkter etter tumorimplantering: (A-E) en dag før injeksjonen vektor. (F-J) 1. uke ganciclovir behandling. (K-O) 2. uke ganciclovir behandling. (PT) 4. uke ganciklovir behandling.
Intrakraniale hjernesvulst ble injisert med LCMV-GP eller VSV-G pseudotyped lentiviral vektorer som uttrykker HSV-1
tk
smeltet til EGFP 3 uker etter svulst implantasjon. 7 dager etter vektor infeksjon ble dyrene i begge behandlede grupper, og i en kontrollgruppe ble behandlet med ganciclovir i 30 dager. (A) Kaplan-Meier overlevelseskurve. Overlevelse fordel for begge behandlingsgruppene sammenlignet med kontrollgruppene var statistisk signifikant (
P
0,001; log-rank test). Det var ingen signifikant forskjell i overlevelse mellom de to behandlingsgruppene. (B-D) Representant MRI (T2 RARE) av tilbakevendende svulster i LCMV- (B, C) og VSV-behandlet (D, E) gruppe. (B) Invasive kontralateral tilbakefall. (C) Invasive lokale og kontralateral tilbakefall. (D) Mer omskrevet lokalt residiv. (E) Makroskopisk bilde av en rottehjerne med et tilbakefall i lillehjernen (rød sirkel), behandlet med VSV-G pseudotyped vektorer og GC. (F-M) Deler av tilbakevendende svulster ble farget med antistoffer mot human-spesifikke nestin og analysert ved fluorescens (F, J) eller konfokalmikroskopi (G-I, K-M).
