Abstract
I tumorprogresjon bestemte forandringer i atom matrise (NM) proteinsammensetningen så vel som i kromatinstruktur forekomme. NM samhandler med kromatin via spesialiserte DNA-sekvenser som kalles matrix-bindende områder (Mars). I den foreliggende undersøkelse, ved hjelp av en proteomikk tilnærming sammen med en to-dimensjonal sørvestre assay og konfokal lasermikroskopi, viser vi at differensieringen av stabiliserte humane prostata-carcinomceller er markert med modifikasjoner både NM proteinsammensetningen og bindingen mellom NM proteiner og MARS. Godt differensiert androgen-følsomme og langsomt voksende LNCaP-celler er karakterisert ved et mindre komplekst mønster og med et større antall proteiner bindings MAR-sekvenser i forhold til 22Rv1 celler som uttrykker androgen reseptor men androgen-uavhengig. Til slutt, i dårlig differensierte og sterkt aggressive androgen-uavhengig PC3 celler kompleksiteten i NM mønster ytterligere økning og en mindre antall proteiner binde Mars. Videre er det i denne cellelinjen med hensyn på LNCaP-celler, er disse endringene er synkrone med endringer i både kjernefysiske fordeling av MAR-sekvenser og i de gjennomsnittlige sløyfe dimensjoner som i betydelig grad øker. Selv om uttrykket av mange NM proteiner endringer i løpet dedifferentiation, bare en svært begrenset gruppe av MAR-bindende proteiner ser ut til å spille en nøkkelrolle i denne prosessen. Variasjoner i ekspresjonen av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og spesielle AT-rik sekvens-bindende protein-1 (SATB1) sammen med en økning i fosforylering av lamin B representerer endringer som kan utløse passasje i retning av en mer aggressiv fenotype . Disse resultatene tyder på at belyse MAR-bindende proteiner som er involvert i differensiering av prostata kreft celler kan være et viktig verktøy for å forbedre vår forståelse av denne kreftprosessen, og de kan også være nye mål for prostatakreft behandling.
Citation: Barboro P, Repaci E, D’Arrigo C, Balbi C (2012) The Role of Nuclear Matrix Proteiner Binding til Matrix vedlegg Regions (Mars) i Prostate Cancer Cell Differensiering. PLoS ONE syv (7): e40617. doi: 10,1371 /journal.pone.0040617
Redaktør: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 22 desember 2011; Godkjent: 11 juni 2012; Publisert: 11.07.2012
Copyright: © 2012 Barboro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Regione Liguria (www.regione.liguria.it), stipend nummer 563/2009; Compagnia San Paolo (www.fondazioneintesasanpaoloonlus.org), stipend nummer 2009,127; Minis dell’Universita «e Ricerca SCIENTIFICA – MIUR (www.prin.miur.it) prosjekt PRIN, gi nummer 2005065404-003. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Unormal atom organisasjon og endringer i mengden og fordelingen av heterochromatin har lenge vært anerkjent som kjennetegner menneskelig kreft [1]; Men i dag vet vi ikke den eksakte årsakene til disse endringene, vi vet heller ikke hvordan aktiviteten /stanse av tusenvis av gener er orkestrert. I eukaryoter, er genomet oppdelt i domener kromatin ved binding av kromatin til en støtte struktur: atom matrise (NM). Samspillet mellom kromatin og NM skje via AT-rike DNA-sekvenser som kalles matrix-bindende områder (Mars). Mars-funksjonen i flere prosesser, inkludert organisering kromatin løkker, forsterke genekspresjon og tilrettelegging replikering [2]. Ikke alle potensielle Mars er bundet til NM eller delta i organiseringen av loopen feste regioner. MAR-binding er en dynamisk hendelse som er celletype og /eller cellesyklusavhengig og kan tillate regulering av fjerne gener på en koordinert måte [3]. Flere MAR-bindingsproteiner er blitt identifisert, hvorav noen er dramatisk deregulert i tumorceller. Ofte deres uttrykk er også signifikant korrelert med aggressive kreft fenotyper. På samme måte kan endringer i samspillet mellom NM proteiner og Mars være knyttet til storskala kromatin omorganisering observert under kreftutvikling. Dette har ført til en økende interesse for Mars og MAR-bindende proteiner som potensielle mål for antineoplastiske legemidler [2].
Nylig, vi har vist at i de tidlige stadiene av rottelever kreftutvikling, er stor-skala kromatin omorganisering relatert til morfologiske og proteinsammensetningen endringer av NM. Disse endringene modifisere evnen til NM proteiner til å binde RNA og DNA-holdige MAR-sekvenser [4]. Videre disse endringene er synkron med endringer i organiseringen av lamins i nukleoplasma. I normale hepatocytter, blir lamins satt sammen til filamenter som danner et ortogonalt gitter, mens det i transform hepatocytter den todimensjonale lokal orden går tapt [5].
prostata-karsinom (PCA) representerer et stort helseproblem, fordi dens forekomsten fortsetter å øke, og det er ingen biomarkører for tiden i stand til å skille lat svulster fra aggressive. Androgen ablasjon er den mest vanlige terapeutisk tilnærming til PCa. Dessverre, etter noen år med behandling, utvikler sykdommen i de fleste pasienter som deretter skaffe seg en androgen-uavhengig fenotype som det ikke er noen behandlinger tilgjengelig [6]. En forståelse av de veier som fører til androgen uavhengighet er derfor avgjørende for å utvikle nye behandlingsformer. Arbeidet utføres i vårt laboratorium og andre til å søke etter PCA markører med forbedrede diagnostiske og prognostiske funksjoner har identifisert flere NM proteiner som er forskjellig uttrykt ved PCA med hensyn til ikke-svulstvev; dessuten noen få proteiner ble signifikant korrelert med tumor aggressivitet og /eller risiko for biokjemisk progresjon [7], [8].
I denne studien brukte vi en proteomikk tilnærming sammen med todimensjonal sørvestre blotting (SWB ) og confocal analyser for å karakterisere bånd mellom NM proteiner og Mars i tre menneskelige PCA cellelinjer som representerer modeller i ulike stadier av PCa progresjon: godt differensiert androgen-responsive LNCaP cellelinje, mellom-skille 22Rv1 celler som uttrykker androgen reseptor (AR ) men androgen-uavhengig og til slutt dårlig differensiert og sterkt aggressiv PC3 som ikke uttrykker AR. Disse cellelinjer er en god modell system for å studere PCa progresjon som mer enn 70% av proteinene uttrykt NM at de passer inn isolert fra PCA vev [9]. Her har vi gi bevis på at det er et omvendt forhold mellom kompleksitet NM proteinsammensetningen og den grad av differensiering av cellelinje og at NM interaksjoner med LAR-sekvenser endres under differensiering, som modifiserer kromatin sløyfe dimensjoner og følgelig genekspresjon.
Materialer og metoder
Cell Culture
LNCaP, 22Rv1 og PC3 prostata karsinom cellelinjer ble oppnådd fra ATCC (CRL-1740, CRL-2505 og CRL-1435, henholdsvis; Rockville, MD, USA) og holdt i RPMI-1640 uten fenolrødt (Celbio, Milano, Italia) inneholdende varme-inaktivert 10% føtalt bovint serum (trekull strippet), 1% penicillin, streptomycin 1% og 1% glutamin. LNCaP og 22Rv1 medium ble også supplert med 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat og 4,5 mg /ml glukose. Passasjetall ved hvilket LNCaP-celler ble plassert på opprettholdelsesmedium varierte fra 24 til 34. Cellene ble dyrket i et monolag i nærvær av 0,1 nM 5-α-dihydrotestosteron (SIGMA, St. Louis, MO, USA) ved 37 ° C i 5% CO
2. Alle forsøk ble utført under anvendelse av celler fra en eksponensiell fase kultur.
Isolering av NM
For en- eller to-dimensjonal polyakrylamidgelelektroforese (1D eller 2D-PAGE), NM var isolert i henhold til Barboro
et al
. [10]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad (München, Tyskland) protein mikroanalyse med bovint serumalbumin som en standard. For konfokalmikroskopi ble NM hentet
in situ
som beskrevet av Zeng
et al
. [11].
(A) Representant Deep Purple-farget 1D gel og tilsvarende SWB. Pilene på høyre side indikerer de tre viktigste bånd som skriver seg fra 1D SWB, hver av hvilke svarer til flere steder i 2D som tydelig i (D), (F) og (H). (B) En sammenligning mellom den relative mengde av XmnI binding til NM proteiner i forskjellige cellelinjer. Ordinat representerer gjennomsnitt ± SE av de relative mengder av XmnI som bestemt ved kvantitativ analyse av tre forskjellige preparater. Nedgangen i 22Rv1 og PC3 med respekt LNCaP celler var signifikant (* P = 0,004, ** P 10
-5). (C, E og G) Representative 2D-sølv-farget gel over og (D, F og H) SWB av NM proteiner ekstrahert fra LNCaP (C, D), 22Rv1 (E, F) og PC3 (G, H) celler. Proteinene som er identifisert er uthevet i rødt bokser. De tre piler viser de tre gruppene av proteiner påpekt i (A). L, Lamin; h, hnRNP, fr, fragmenter
Utarbeidelse av en DNA Probe
En svært repeterende sekvens på 370 bp (XmnI) DNA hentet fra S /MAR transaksjonen DataBase [http.: //smartdb.bioinf.med.uni-goettingen.de] frigi 2,3 (deponeringsnummer SM0000134) ble anvendt som en probe for DNA-bindingseksperimenter. XmnI er et AT-rikt DNA-sekvens innenfor en base-Oppheve paring region (BUR) og er i stand til å binde de samme proteiner som binder MAR-inneholdende DNA ko-isolert med NM, som vi tidligere har demonstrert [4]. Plasmid pUC57 med XmnI sekvensen ble konstruert ved GenScript Corporation (Piscatway, NJ, USA).
Escherichia coli
TOP F10 «ble transformert med pUC57, og transformerte celler ble selektert på agarplater supplert med ampicillin. Plasmider ble isolert ved anvendelse av Qiagen Maxi Plasmid kit, restriksjonsfordøyd med
XMN
I og etterfølgende gel-renset fra agarosen ved anvendelse av en høy Pure PCR-produktrensing sett (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
DNA-prøver ble biotinylert ved nick oversettelsesprosedyre (BioNick DNA Merking System, Invitrogen /Life, San Diego, California). Unincorporated nukleotider ble fjernet fra prøven ved hjelp av en Sephadex G-25 spin kolonne (Roche Diagnostics).
Nuclear Halo Utarbeidelse og Halo-fluorescens in situ hybridisering (FISH) teknikk
Nuclear glorier var forberedt i henhold til fremgangsmåten i de Belle
et al
. [12] med mindre modifikasjoner. Kort sagt ble LNCaP og PC3-celler vasket to ganger i fosfatbufret saltløsning (PBS) og kjernene ble ekstrahert ved inkubering av cellene i 100 mM KCl, 300 mM sukrose, 10 mM PIPES, pH 6,8, 3 mM MgCl
2, 0,5% Triton X-100 ved 4
°
C i 20 min. Deretter, 3 x 10
5 kjerner ble cytospun på objektglass i 10 minutter ved 100 x
g.
Platene ble neddykket i 4 minutter i en oppløsning inneholdende 2 M NaCl, 10 mM PIPES, pH 6,8 og 10 mM EDTA, og deretter skyllet i 2 minutter ved en serie av 10X, 5X, 2X og 1 x PBS, pH 7,4. Etter fiksering med 3,7% formaldehyd i PBS, ble DNA farget med DAPI og den relative halogen størrelsen på hver kjerne ble bestemt som rapportert av Guillou
et al
. [13].
(A) Venn-diagram som viser antallet protein flekker visualisert i hver cellelinje. Tall i de overlappende områdene representerer vanlige flekker. (B-D) Kake diagram som viser prosentandelen av flekker som binder XmnI sekvens på tre cellelinjer. Fargene cyan og gul, betegne flekker som var, med respekt LNCaP celler, annerledes uttrykt eller med ingen forskjell, i 22Rv1 (C) eller PC3 (D), henholdsvis.
For å undersøke fordelingen av XmnI sekvenser i nucleoids ble halo-FISH teknikk brukt. Etter halogen ekstraksjon og fiksering ble objektglassene inkubert med 70% formamid, 2x saltvann-natriumcitrat (SSC) og 50 mM natriumfosfat, pH 7,0 ved 73 ° C i 3 minutter, fulgt av 50% formamid, 2 x SSC og 50 mM natrium fosfat, pH 7,0, ved 73 ° C i 1 min. Hybridiseringsblandingen (4 ng /ul biotinylert XmnI probe, 2x SSC, 1 mg /ml konkurrerende DNA, 10% dekstransulfat og 25% formamid) ble varme denaturert separat i 5 minutter ved 73 ° C, hurtig avkjølt på is og påføres prøven. Etter en inkubering over natten ved 37 ° C, ble platene vasket tre ganger med 50% formamid og 2 x SSC, pH 7,0, ved 42 ° C i 5 minutter etterfulgt av ytterligere tre vaskinger med 0,1X SSC ved 60 ° C i 5 minutter. FISH påvisning ble utført med streptavidin konjugert med CF
TM555 (1:100 fortynning, Biotium, Hayward, CA), mens total DNA ble kontra med DAPI. Prøvene ble analysert ved lysmikroskopi ved hjelp av et Leica DM LB2 epifluorescens mikroskop (Wetzlar, Tyskland) utstyrt med et 40x objektiv. Bilder ble tatt med et Olympus DP70 kamera og behandlet med WCIF ImageJ v1.43 programvare (https://www.uhnresearch.ca/facilities/wcif/imagej/).
Gel elektroforese
1D og 2D-PAGE av NM proteiner ble utført som beskrevet tidligere [14]. Ble gelene enten farget for protein mønster analyse eller behandles for Western blot (WB) eller SWB. Lamin B fosforylering mønsteret ble utført av en multiplekset proteomikk analyse. Gelene ble først inkubert med Pro-Q Diamond (Molecular Probe Inc., Eugene, OR, USA), et fosfoprotein-spesifikk fargestoff, etterfulgt av inkubasjon med SYPRO Ruby fargestoff (Molecular Probe Inc.) for totalt protein visualisering, som anbefalt av produsenten.
SWB og WB Prosedyrer
SWB ble utført som tidligere rapportert [4]. Kort fortalt ble en 1D eller 2D-PAGE gel elektrooverført til en Hybond-P membran (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Membranen ble inkubert i buffer A (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl
2 og 0,5% Tween-20) i 2 timer ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 37 ° C i den samme buffer inneholdende 50 ng /ml DNA-probe og et 500-gangers overskudd av en ikke-spesifikk konkurrent (sonikert laksesperm-DNA). Membranen ble deretter vasket med tre utskiftninger av buffer A i løpet av en periode på 60 min. Før testing ble membranene probet med biotinylert DNA inkubert i 30 minutter med pepperrot peroksydase-bundet streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) fortynnet 1:1200 i buffer A og ble deretter vasket fire ganger med den samme buffer i 15 minutter ved romtemperatur . Ikke-radioaktiv påvisning av DNA bundet til NM ble gjennomført med de forbedrede ECL Plus Western blotting reagenser og avslørt ved hjelp av Hyper ECL (GE Healthcare) med de samme eksponeringsforholdene.
De koordinatene representerer gjennomsnitt ± SE av de relative mengder av disse proteiner som bestemt ved kvantitativ analyse av tre til seks BAC utført som benytter minst tre forskjellige fremstilling av NM (* P≤0.05; ** P 0,0005). Representative BAC vises til høyre; de store proteolytiske fragmenter av PARP1 og SATB1 er preget av fulle prikker. De relative molekylvekt av standardproteiner i kDa er rapportert.
For WB, proteiner separert med 1D eller 2D-PAGE ble overført til en Hybond-P membran (GE Healthcare), og immundeteksjon ble utført ved hjelp av antistoffene som er rapportert i Tabell 1. immunoreaktivt flekker eller båndene ble detektert ved anvendelse av ECL. Etter 1D WB analyse ble den relative mengden av hvert protein som undersøkes oppnådd ved å normalisere integrert optisk tetthet ved ECL med integrert optisk tetthet av den totale mengde av NM proteiner bestemmes av den Deep lilla-farging gel som tidligere beskrevet [4]. Kort fortalt ble like mengder (8 mikrogram) av samme forberedelse lastet på to 1D-PAGE-geler og sendt til elektroforese. En gel ble farget med Deep Purple og densitometriske skanninger ble utført i en Molecular Imager FX scanner (Bio-Rad) og den samlede protein (
A
) ble evaluert av integrering av tetthet kurven optisk. Den andre gel ble utslettet og immunreaktive bånd ble påvist ved hjelp av Hyper ECL filmer (GE Healthcare), som viser en lineær respons til lys produsert av forbedret chemiluminescence. De relative mengder av proteiner stedfortreder ble oppnådd ved å normalisere den integrerte optiske tetthet av ECL (
B
) til den integrerte optiske tetthet (
A
) av den tilsvarende dyp lilla-farget gel. Denne metoden tillot oss å oppnå kvantitative resultater. Sammenligningen av de relative mengder av proteiner ble utført ved å eksportere enkeltverdier for hver film og analysere dem ved hjelp av t-test i OriginPro 7.5-programvaren.
Bildeanalyse av 2D Gel Spot Patterns
Alle de sølv-farget 2D-geler ble digitalisert med en GS-800 densitometer (Bio-Rad) ved anvendelse av de samme skanning. Spot påvisning ble gel justering og normalisering utført ved hjelp av programvarepakken PDQuest (Ver. 7.3.0, BioRad). Differensial analyse ble utført ved å gruppere 2D gels inn i tre klasser, som hver inneholder fire til seks gels hentet fra fire til fem forskjellige NM forberedelser isolert fra LNCaP eller 22Rv1 eller PC3 celler. Reproduserbarhet av gelene, uttrykt som gjennomsnittlig prosent av passet stedene innenfor hver klasse ± SD, var 87 ± 5% av LNCaP, 83 ± 3% for 22Rv1 og 83 ± 1% for PC3. Mann-Whitney test ble brukt til å oppdage over- eller under uttrykt flekker; P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant og bare protein flekker hvis uttrykk var to ganger eller mer deregulert ble analysert. For å kompensere for små forskjeller i utvalg lasting og gel flekker, ble volumet av hver spot normalisert i henhold til total mengde i gyldige punkter i hver gel.
PDQuest analyse programvare ble også brukt til å detektere proteiner som bundne antistoffer i 2D WB ved å matche antigen flekker i autoradiografer med protein flekker i replica 2D SWB.
(A, D) Hele celler farget med dual-color immunfluorescens. (B, E) NM forberedt
in situ Hotell og farget av immuno-FISH. (A, B) konfokalmikroskop analyse av lokalisering av PARP (grønn) og DNA-sekvens eller XmnI (blå). (D, E) Lokalisering av SATB1 (grønn) og DNA-sekvens eller XmnI (blå). I bunnen av paneler B og E intensitetsprofil linje skanner, utført mellom de hvite kors i NM som indikert på confocal flette bilder i B og E, vises. Ordinaten representerer fluorescensintensiteten i vilkårlige enheter, representerer abscissen avstanden i piksler. Barene tilsvarer fem mikrometer. (C, F) spredningsdiagrammer som viser kvantifisering analyser av colocalization av PARP /DNA (a), PARP /XmnI (b), SATB1 /DNA (a), eller SATB1 /XmnI (b), respektivt. R tilsvarer Pearsons korrelasjonskoeffisient; M1 til den fraksjon av proteinet som blir undersøkt overlappende DNA eller XmnI og M2 brøkdel av DNA eller XmnI overlappende proteinet. Horisontale linjer viser gjennomsnittsverdiene ± SE av 20 felt (122-226 totalt NMS) replikert i to forskjellige eksperimenter (* P≤0.03, ** P 0,001).
Confocal Laser Scanning Mikroskopi og image Analysis
i hele LNCaP og PC3-celler, analyse av det romlige forhold mellom de proteinene under studie og det totale DNA ble utført ved to-farge immunfluorescens flekker som tidligere rapportert [15]. Proteiner ble merket ved hjelp av en primær antistoff mot enten spesiell AT-rik sekvens-bindende protein-1 (SATB1) (1:20 fortynning, Santa Cruz) eller poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (1:50, Santa Cruz) med CF
TM555 geit-anti-kanin-IgG (1:200 fortynning, Biotium) som det sekundære antistoff, mens DNA ble merket med 5 uM SYTOX Orange (Molecular Probes). For å studere interaksjonene mellom NM proteiner og LAR-sekvenser, utførte vi immuno-FISH på NM ekstrahert direkte på objektglass ved å følge prosedyren som er beskrevet ovenfor. Dette immuno-FISH teknikk involverte samtidig farging av NM proteiner og DNA-sekvenser og består av to deler. I den første delen (FISH), ble LAR-sekvensene visualisert ved hjelp av en XmnI biotinylert probe som angitt ovenfor (se seksjon halogen-FISH). I den andre delen ble NM proteinene detektert ved immunofluorescens ved å bruke kanin anti-SATB1 (1:15 fortynning, Santa Cruz), kanin-anti-PARP (01:40, Santa Cruz) eller geite-anti-lamin B (1:20 fortynning , Santa Cruz). Immunolocalization av protein-MAR komplekser ble utført ved hjelp av en cocktail av merket sekundære antistoffer (CF
TM633 anti-kanin Ig, 1:100 fortynning og Alexa 488 anti-geit Ig, 1:100 fortynning) og streptavidin konjugert med CF
TM555 (1:100 fortynning). Alle confocal bilder ble samlet i henhold til Nyquist kriteriet som 3D datasett (z-stabler) med en trinnstørrelse på 250 nm ved hjelp av et Olympus FV-500 laser scanning confocal mikroskop utstyrt med en 60 × /1,4 NA olje-nedsenking objektiv. Bildebehandling og samlokalisering analyse ble utført som tidligere beskrevet [15] med WCIF ImageJ v1.43 programvare som gir både Pearsons korrelasjonskoeffisient (R) og co-forekomst Manders «koeffisienter (M1 og M2).
(A) Representative konfokal mikroskop bilder av Lamin B (rød) og XmnI sekvens (blå) i NM trekkes ut
in situ Hotell og farget av immuno-FISH. Barene tilsvarer fem mikrometer. (B) Forstørret delen av 2D-PAGE farget med SYPRO Ruby (a, c) eller Pro-Q Diamond som selektivt flekker bare fosfoproteiner (B, D). Pilene indikerer de forskjellige isoformer av lamin B. Det samme farge tilsvarer den samme isoform i to cellelinjer. I PC3 celler, ikke-fosforylert peptid til stede i LNCaP celler forsvant (røde pilspisser).
Resultater
uttrykk for NM Proteiner Binding Mars Avhenger Differensiert State of PCa cellelinje
de NM proteiner hentet fra LNCaP, 22Rv1 og PC3 cellene ble separert ved 1D-PAGE og en skjerm fra bindingen til XmnI sekvensen ble utført. I alle cellelinjene som ble undersøkt, tre grupper av proteiner (sentrert rundt 107, 71 og 55 kDa, respektivt) som sterkt bundet DNA ble identifisert (fig. 1A, piler). Ingen kvalitative endringene var merkbar blant de tre cellelinjer; ikke desto mindre er mengden av DNA-bindende proteiner NM var betydelig høyere i de minst aggressive celler (Fig. 1B).
(A) Representative nucleoids farget enten med DAPI (blå) for å visualisere bare total DNA (venstre paneler ) eller med halo-FISH å markere XmnI sekvensen (rød) og kontra med DAPI å oppdage total DNA (blå) .Baren tilsvarer 10 mikrometer. (B) Punktdiagram som viser distribusjonen av DNA halogen størrelse. Horisontale linjer angir middelverdiene som oppnås for å måle hver cellelinje minst 100 nucleoids. Den gjennomsnittlige DNA halogen størrelse ± SE var 6,8 ± 0,2 for LNCaP-celler og 7,5 ± 0,2 for PC3-celler, henholdsvis (P = 0,009). Den nederste panelet viser frekvensfordelingen av de halogen radier gruppert i intervaller på 2 um. (C) En skjematisk modell av forholdet mellom sløyfene og NM i dedifferentiation av PCA-celler. I mer differensierte celler (LNCaP) NM er godt organisert med flere proteiner bundet til LAR-sekvenser. I PC3, hvor noen strukturelle regelmessigheter i NM forsvinne, et mindre antall protein arter bundet Mars og så en større DNA sløyfe er forankret til NM.
polypeptider, vi preget uttrykk for videre NM proteiner ved 2D-PAGE etterfulgt av 2D SWB analyse. Den samlede uttrykk profiler fra 2D gels var ganske lik; Men en analyse i dybde viste at kompleksiteten av protein mønster var invers til graden av celledifferensiering. PC3-celler viste at mer komplekse NM protein mønster og 22Rv1 vist en mellomliggende mønster mellom LNCaP og PC3-celler (fig. 1C, E og G). I gjennomsnitt ble 725 protein flekker oppdaget i NM isolert fra LNCaP celler (range 598-781), 847 (intervall 808-909) fra 22Rv1 celler og 918 (range 727-1142) fra PC3 celler. Venn-diagrammet rapportert i fig. 2A viser at flesteparten av stedene visualisert i 2D-PAGE-match i tre cellelinjer, i samsvar med resultatet, som allerede er rapportert, at mer enn 70% av NM proteinene er vanlig mellom cellelinjer og vev PCA; Disse proteiner er den komponent av NM celletype spesifikk [9], [16]. Flekkene annerledes uttrykt i 22Rv1 og PC3, med hensyn til LNCaP-celler, var 98 og 155, henholdsvis. Spesielt 22 flekker var over-uttrykt og 76 var under uttrykt i 22Rv1-celler og 98 ble over-uttrykt og 57 ble under uttrykt i PC3. Denne observasjonen bekrefter tidligere resultater som tyder på at proteinet NM mønster gjennomgår endringer med celledifferensiering [16] og øker i kompleksitet i passasjen fra mer- til mindre differensierte tumorer [7], [8], [17].
Når 2D-geler ble analysert ved SWB, flere NM proteiner sterkt bundet til XmnI sekvensen (fig. 1D, F og H). Bindingen var en sekvens-spesifikk snarere enn en aspecific (elektrostatisk) interaksjon fordi etter inkubering av membranene over natten i 2 M NaCl bindingen var fremdeles påvisbar (data ikke vist). I henhold til 1D analyse, binding en global nedgang i DNA ble observert i funksjon av celledifferensiering: omtrent 136 MAR-bindende flekker ble visualisert i LNCaP, 79 i 22Rv1 og 63 i PC3-celler. Som en helhet, viser denne analyse at en økning i kompleksiteten til NM proteinmønsteret er synkron med en minskning av antall proteiner som binder XmnI sekvensen. Faktisk er disse sistnevnte var 19, 9 og 7% av den totale NM-proteinet uttrykt av LNCaP, 22Rv1 og PC3-celler, henholdsvis (fig. 2 B-D).
principal XmnI bindende flekker ble identifisert ved WB og så var det mulig å tildele en identitet til proteiner oppdaget av 1D SWB. Den første gruppen, ved høyere molekylvekt, tilsvarer co-migrering av PARP1, heterogen kjernefysisk ribonucleoprotein (hnRNP) U, MARPA og Matrin3; den andre gruppen tilsvarer MARPb, Lamin A, Lamin B og hnRNP M; og den tredje gruppen tilsvarer PARP2, hnRNP jeg, hnRNP K og fragmenter av PARP1 og SATB1.
Sammenligningen mellom 2D SWBS av ulike cellelinjer stedfortreder viser at i tillegg til en endring av antall proteiner uttrykte også signalstyrken for DNA-binding til noen av deres forandring. De mer åpenbare forandringer var mellom LNCaP og PC3-celler, mens også i dette tilfelle oppførselen til 22Rv1 celler ble mellomprodukt. Derfor ble følgende analyser utført sammenligne de to mobil mer ulikt dvs. LNCaP vs. PC3.
The Expression og lokalisering av PARP og SATB1 avhenge av nivået av Differensiering av PCA Cells
I PC3-celler med hensyn LNCaP, signalintensiteten av DNA-binding til Matrin3, SATB1 fragment, hnRNP U og alle grunnleggende hnRNPs redusert. Denne reduksjonen kan skyldes ned-ekspresjon av de grunnleggende hnRNPs (som var blant de 57 stedene ble funnet å være under-uttrykt i PC3-celler), en forandring i forholdet av ekspresjonen av forskjellige isoformer (for eksempel for hnRNP U og Matrin3) eller et annet mønster av fragmentering (for SATB1). Vice versa, uttrykk for PARP2, MARPA og MARPb økt. Selv om disse sistnevnte to proteinene var til stede i en så liten mengde at de ofte ikke ble påvist ved sølvfarging (fig. 1C og G), bindes de meget sterkt til MARS. Dessverre, som allerede rapportert [4], MARPA og MARPb har ikke blitt identifisert ennå, og de er svært sannsynlig å være nye uncharacterized proteiner. Så har vi kvantifisert ekspresjon av proteiner som differensielt bandt XmnI sekvensen ved 1D WB-analyse ved bruk av kommersielt tilgjengelige antistoffer.
diagrammer som illustrerer de relative mengder av proteiner og representative WB eksperimenter er vist i fig. 3. For hnRNP U og Matrin3, bare en trend mot en nedgang kan observeres i PC3 med hensyn til LNCaP celler; vice versa, både PARP og SATB1 gjennomgå betydelige endringer i sine uttrykk. Høyere PARP ekspresjon ble påvist i PC3-celler, og proteinet var i sin naturlige tilstand med bare en liten mengde (ca. 19%) av den karakteristiske sammenbrudd til 89 kDa [18] detektert. Høyere ekspresjon av dette protein i PC3-celler (som representerer en mer udifferensiert fenotype med hensyn til LNCaP-celler) er i overensstemmelse med den inverse sammenheng mellom graden av celledifferensiering og PARP-aktivitet [18].
I forhold til SATB1, to fremtredende band på nesten lik intensitet på 89 (native SATB1) og 54 kDa kan påvises i LNCaP celler. I PC3-celler, ekspresjon av full-lengde proteinet avtar og tre fragmenter på 62, 54 og 43 kDa er til stede. I tillegg er intensiteten av disse tre bånd avtar til 60% med hensyn til intakt SATB1, noe som indikerer at det ikke bare var proteinet forskjellig uttrykt mellom de to cellelinjer, men at både intensiteten og mønsteret av fragmentering var forskjellige i tillegg (fig. 3). De vanligste SATB1 nedbrytningsproduktene er to fragmenter av ca 70 og 30 kDa [19], selv om andre fragmenter, med molekylvekt svært nær det som er observert i våre eksperimenter, er også rapportert [20], [21]. Det polyklonale antistoff geit anvendt i denne studien gjenkjenner SATB1 N-terminale ende; Derfor forventet vi å oppdage bandene som tilsvarer full lengde SATB1 og kortere peptider. I stedet, i LNCaP-celler den hovednedbrytningsproduktet var et 54 kDa-fragment som kunne svare til den C-terminale delesjon av aminosyre 494 (Mr beregnet 54 915) som inneholder domener som er nødvendig for lokalisering ved NM og for binding til MARS [22 ]. Som en bekreftelse på det ovenfor nevnte, i 2D SWB (Fig. 1 D), vi har oppdaget en SATB1 fragment binde XmnI sekvens på omtrent 54 kDa. Dessuten er tilstedeværelsen av et annet protein fragmenteringsmønster i PC3 med hensyn til LNCaP ikke på grunn av tilstedeværelse av apoptotiske populasjoner fordi vi ikke oppdage noen DNA-fragmentering eller apoptotiske legemer i cellepreparater (data ikke vist). Det er derfor mulig at spaltningssetene mønstrene er svært avhengig av den spesielle differensierende og proliferativ tilstand av en celle [21], [23]. Grunnen til at hele SATB1 ikke migrere på 2D tross migrere i 1D WB eksperimenter er for tiden ukjent. Det kan avhenge av den lave konsentrasjonen av protein i løsningen brukes til å laste prøvene i gel strimler for isoelektrisk fokusering, selv om løselighet problemer ikke kan utelukkes.
For å avgjøre om fordelingen og samhandling av PARP og SATB1 med DNA og /eller LAR-sekvenser endre seg som en funksjon av graden av celledifferensiering, utførte vi konfokal mikroskopi-analyse.
i hele LNCaP og PC3-celler, PARP (anskueliggjort på grønn i fig. 4A) var til stede i nukleoplasma hvor det vises en homogen kornet flekker, i samsvar med tidligere undersøkelser [24]. [25].
