Abstract
Blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) signalveien er blitt funnet å spille en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker ved å regulere prosesser av celleproliferasjon, apoptose, migrasjon, invasjon, metastaser, og oppkjøpet av epitel-mesenchymale overgang (EMT) fenotype. Videre har PDGF signale også blitt funnet å endre ekspresjonen profilen til mirnas, som fører til reversering av EMT fenotype. Selv om rollen av miRNAs i kreft er dokumentert, er det svært få studier som dokumenterer de cellulære konsekvensene av målrettet re-uttrykket av spesifikke miRNAs. Derfor undersøkte vi om behandlingen av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler med PDGF kan endre uttrykket profilen til miRNAs, og vi har også vurdert de cellulære konsekvenser. Vårt studium viser at MIR-221 er viktig for PDGF-mediert EMT fenotype, migrering og vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler. Nedregulering av TRPS1 av MIR-221 er kritisk for PDGF-mediert oppkjøpet av EMT fenotype. I tillegg er den PDGF-avhengige økning i celleproliferasjon synes å være mediert ved inhibering av et bestemt mål av MIR-221 og nedregulering av p27Kip1
relasjon:. Su A, S He, Tian B, Hu W Zhang Z (2013) mikroRNA-221 formidler effekten av PDGF-BB på migrasjon, spredning, og epithelial-Mesenchymale Overgang i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE åtte (8): e71309. doi: 10,1371 /journal.pone.0071309
Redaktør: Takashi Tokino, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 27 juni 2013; Publisert: 13 august 2013
Copyright: © 2013 Su et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde vanligste årsaken til kreft. -relaterte døden i USA [1], og aggressivitet av kreft i bukspyttkjertelen er delvis på grunn av sine indre og ytre stoffet motstand egenskaper, som også er knyttet til oppkjøpet av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) fenotype [ ,,,0],2], [3]. EMT er en prosess som er forenlig med kreftceller «stilk-lignende egenskaper, hvorved epitelceller med en brostein fenotype skaffe mesenchymale cellekarakteristikker med en spindel-formet fibroblast-lignende morfologi, [3], [4]. Denne prosessen involverer demontering av celle-celle kryss, inkludert nedregulering av epitelial celle fenotype markører (E-cadherin, zonula okkludens-1), så vel som den translokasjon av β-catenin fra cellemembranen til kjernen, omorganisering av aktin cytoskjelettet, og oppregulering av mesenchymale celle fenotype markører (vimentin, fibronektin og N-cadherin) [4]. Denne prosessen reduserer klebekapasiteten av mesenchymale fenotypiske celler, noe som fører til økt cellemigrering og invasjon, noe som resulterer i tumor aggressivitet [5].
Blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) kan regulere mange cellulære prosesser, inkludert celle spredning, transformasjon, migrasjon, invasjon, angiogenese og metastase, ved å aktivere kognatreseptoren [6]. I de senere årene har PDGF-BB og beslektede tyrosinkinase betareseptorer vist seg å spille en viktig rolle i oppkjøpet av epitel-mesenchymale overgang (EMT) fenotype av kreftceller [5], [7]. Behandling av epitelial-lignende kreftceller med renset PDGF protein resulterte i betydelig redusert uttrykk av E-cadherin og økt uttrykk av sink-finger E-box binding homeo-box 2 (ZEB2) både på mRNA og protein nivå i forbindelse med induksjon av EMT karakteristika [8]. ZEB2 har vist seg å være involvert i nedregulering av ekspresjonen av mange gener som koder for viktige proteiner av epitelcelle-fenotype, inkludert E-cadherin, samtidig med oppregulering av ekspresjonen av vimentin [9]. Det er viktig å merke seg at PDGF også signifikant økt ekspresjon av fibronektin, N-cadherin, og vimentin, med samtidig tap av E-cadherin. Men ytterligere i dybden mekanistiske studier er nødvendig for å forstå hvordan PDGF regulerer involvert i EMT fenotype prosesser.
microRNAs (mirnas) har blitt identifisert som forbedrer flere aspekter ved kreft i bukspyttkjertelen patogenesen, inkludert metastase, invasjon, og selvfornyelse [10]. Emerging bevis tyder på at uttrykket av gener som er grunnleggende for kjøp av EMT fenotype og tumorcelle aggressivitet er regulert av mirnas som fører til enten translasjonsforskning undertrykkelse eller nedbrytning av målet mRNA [11], [12]. MIR-221 er høyt uttrykt i ulike kreft-avledede celler, inkludert pankreatisk karsinom, prostatakarsinom og thyroid karsinom-celler [13], [14], [15]. Nyere studier har vist at MIR-221 regulerer EMT ved å målrette TRPS1 (tricho-neshorn-phalangeal syndrom type 1) og lindre sin hemming av ZEB2 [16]. Dessuten har høye nivåer av MIR-221 er vist å fremme proliferasjon av disse cellene ved binding til det 3′-UTR av cellesyklus-inhibitor og tumor suppressor p27Kip1 og inhibering av dets ekspresjon [13], [15]. I de senere år har PDGF signalering er funnet å endre ekspresjonen profilen til mirnas, som fører til reversering av fenotypen EMT [17], [18].
Selv om rollen til mirnas i kreft er blitt dokumentert, det er svært få studier som dokumenterer den cellulære konsekvens av målrettet re-uttrykket av spesifikke miRNAs. Derfor hypotese vi at PDGF signal kan modulere EMT fenotype via reguleringen av miRNA biogenesis. I denne studien undersøkte vi om behandlingen av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler med PDGF kan endre uttrykket profilen til miRNAs, og vi har også vurdert de cellulære konsekvenser. Resultatene viser at PDGF viser dens effekter på både celleproliferasjon og EMT fenotype ved å fremkalle Mir-221 uttrykk, noe som resulterer i nedregulering av p27Kip1 og TRPS1 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Materialer og metoder
Cell Culture
De stabile menneskelige kreft i bukspyttkjertelen ASPC-1 cellelinjer hentet fra Typisk kultur bevaring kommisjon cellen bank, Chinese academy of Sciences (Shanghai, Kina) ble dyrket i DMEM medium (Invitrogen, CA) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 2 mmol /l glutamin, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Alle cellene ble opprettholdt i en 5% CO2-fuktet atmosfære ved 37 ° C
Forskning Reagenser og antistoffer
Rekombinant human PDGF-BB ble kjøpt fra R . D Systems. Kjemisk syntetisert miRNA-hemmere, etterligner, og egge kontroller ble hentet fra Dharmacon eller Ambion. De syntetiske små forstyrrelser RNA (siRNAs) rettet mot menneskelig TRPS1 eller p27Kip1 var Stealth Velg RNAi (Invitrogen) og HP Validert siRNA (Qiagen). Celler ble sådd med 100.000 til 300.000 celler /ml og transfektert ved Oligofectamine (Invitrogen), DharmaFECT3 transfeksjon reagens (Dharmacon) eller RNAi MAX (Invitrogen) ved de angitte konsentrasjoner. Antistoffer mot ZEB2, N-cadherin og vimentin ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot ZEB1, Snail1, Snail2, Twist, E47, E-cadherin og ZO-en ble kjøpt fra Santa Cruz. Antistoffer mot TRPS1, p27Kip1 og GAPDH ble kjøpt fra Abcam. FITC-konjugert anti-mus IgG for vimentin og E-cadherin farging ble innkjøpt fra Invitrogen. Den Mirvana miRNA Isolation Kit og TAQMAN miRNA Analysene ble kjøpt fra ambion og Applied Biosystems.
Transfeksjon av miRNA Ligner og spesifikk Anti-mirnas
ASPC-1 celler ble sådd på 3 × 10
5 celler per brønn i seks-brønns plater og transfektert med MIR-221 etterligner eller miRNA egge kontroller ved en sluttkonsentrasjon på 20 nM ved bruk av Oligofectamine (Invitrogen). ASPC-1-celler ble transfektert med anti-miR221 (miRNA inhibitorer) eller et anti-miRNA kontroll ved en sluttkonsentrasjon på 200 nM ved hjelp av DharmaFECT3 transfeksjon reagens (Dharmacon). Etter 3 dager med transfeksjon, ble cellene splittet og transfektert gjentatte ganger med MIR-221, miRNA-hemmere, eller styre hver 3-4 dager i de angitte tidsrom.
Små interfering RNA og Transfeksjon
ASPC-1-celler ble transfektert med 100 nmol /l human TRPS1, p27Kip1 liten interfererende (si) RNA eller et kontroll siRNA (Santa Cruz) ved anvendelse av RNAi MAX transfeksjon reagens. Mediene ble fjernet etter en 24-timers transfeksjon, og deretter ble cellene inkubert i medium inneholdende 5% FBS i ytterligere 24 timer. Cellelysater ble fremstilt for Western blot-analyse, og total RNA ble ekstrahert for sanntids revers transkripsjon-polymerase chain reaction assay.
Cell Proliferation Assay
MTT-analysen ble utført som beskrevet tidligere [19]. I alt 6 x 10
3-celler ble delt opp i 96-brønners plater. Cellene ble behandlet med eller uten 20 ng /ml PDGF-BB i 24 timer, etterfulgt av en celle proliferasjonsanalyse ved hjelp av en ikke-radioaktiv analyse CellTiter96 celleformering (Promega) i henhold til produsentens anvisninger. Absorbansen ved 490 nm ble avlest med en enzym-bundet immunosorbent assay-plateleser. For den prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) farging [20], ble ASPC-1-celler farget med et FITC-konjugert anti-PCNA-antistoff (klon PC10) fra Biolegend samt DAPI. Minst 150 celler ble telt pr tilstand, og prosentandelene av PCNA-positive celler er presentert.
Wound Healing Assay
A sårheling analyse ble utført for å undersøke kapasiteten av cellemigrering og invasjon som tidligere beskrevet [21]. I korthet, etter at cellene vokste til 90-95% konfluens i 6-brønners plater, ble en enkelt ripe sår generert med en 200-mL engangspipettespiss. De skrape sår ble fotografert over 7 timer med en Nikon invertert mikroskop med et vedlagt digitalt kamera, og deres bredder ble kvantifisert med ImageJ programvare. Dataene ble plottet som prosentandelen av sårheling, sette den innledende skrape bredde som 100%. Resultatene er presentert som gjennomsnittet av tredoble målinger per tilstand i tre uavhengige eksperimenter.
Cell Invasion analysen
De invasive atferd av cellene ble testet ved hjelp av en Matrigel trans invasjon analysen. Transwell kamre (Millipore) (8 um porestørrelse) ble belagt med Matrigel (15 ug /filter). Celler (2,0 x 10
4) i serumfritt medium ble platet inn i det øvre kammer og nedre brønnene ble fylt med komplett medium. Celler ble tillatt å invadere på tvers av Matrigel-belagte membran i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2. Etter inkubering ble cellene fjernet fra den øvre overflaten av filteret ved å skrape med en bomullspinne. Den invaderte celler som festet til bunnen av membranen ble fiksert med metanol og farget med DAPI. Antallet celler som gjennomtrengt membranen ble bestemt ved å telle det midlere celletallet av fem tilfeldig utvalgte høy-strømfelt.
Kvantitativ real-time PCR
RNA ble renset ved anvendelse av RNeasy (Qiagen) eller Mirvana (Ambion) kits med DNase-behandling på RNeasy kolonner. Komplementær DNA (cDNA) ble generert med High-Capacity cDNA revers transkripsjon kit (Roche). Den kvantitative analyse av endring i ekspresjonsnivåene ble beregnet ved hjelp av sanntids-PCR-maskin (iQ5, Bio-Rad). PCR sykkel betingelsene var 94 ° C i 3 minutter og 40 sykluser (94 ° C i 15 s, 60 ° C i 20 s og 72 ° C i 40 s). Sanntids-PCR ble anvendt for å kvantifisere mRNA-ekspresjon. Reaksjonene ble utført i duplikat, og delta-delta-syklus Terskel (ddCt) verdier ble beregnet på basis av gjennomsnittet av normaliserings gener. Taqman miRNA analyser ble anvendt for kvantifisering av MIR-221, og resultatene ble normalisert til gjennomsnittet av de oppnådde resultater for RNU6B.
Western Blot analyse
Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av total cellelysater. Totale cellelysater fra forskjellige forsøk ble oppnådd ved å lysere cellene i RIPA-buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% natrium-deoksycholat, 2 mM natriumfluorid, 2 mM Na3VO42, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 mM protease inhibitor cocktail. Den totale cellelysater ble separert på SDS-PAGE-geler, overført til PVDF-membraner (Millipore), immunoblottet med antistoffer, og visualisert ved hjelp av et forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Amersham Biosciences). Proteinbåndene ble kvantifisert ved densitometri hjelp gel analyse programvare ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij). Alle verdier ble normalisert til GAPDH.
Immunofluorescence Mikros
I korthet ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert i 0,5% Triton X-100, og deretter blokkert med 10% geiteserum. Cellene ble inkubert i 1 time med antistoffer mot E-cadherin (1:200) eller vimentin (forblandet) i 5% geiteserum, og deretter ble de farget i 1 time med et FITC-konjugert sekundært antistoff (1:250 ). Cellene ble sett av fluorescens mikroskopi, og bildene ble analysert ved hjelp av Advanced Sport programvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).
Statistical Analysis
Resultatene som presenteres er gjennomsnittet av minst tre eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer med standardfeil. Statistiske analyser ble utført ved analyse av varians, etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest eller Students t test ved hjelp av SPSS15.0. p-verdier på 0,05 ble betraktet som signifikant og er angitt med stjerner.
Resultater
PDGF Forfremmet celle migrasjon og spredning og endret Epithelial- Mesenchymale Transition Phenotype i ASPC-1 celler
Vi først undersøkt om PDGF fremmer celle migrasjon ved hjelp av en in vitro scratch såret analyse og Matrigel trans invasjon analysen. I ASPC-1-celler, behandling med PDGF sterkt fremmet cellevandring (Fig. 1A, B). Vi har også fastslått hvorvidt celleformering ble forbedret ved PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer) i ASPC-1-celler. Resultatene av MTT-celleproliferasjonsanalyse indikerte at PDGF økte antall levedyktige celler 1,9 ganger sammenlignet med kontrollen (Fig. 1C). Vi deretter bekreftet disse resultatene ved hjelp av kvantitativ analyse av PCNA farging. ASPC-1-celler behandlet med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer ble farget med PCNA for å måle antall prolifererende celler (Fig. 1D). Resultatet viste at PDGF-mediert økning i celleformering (1,6 ganger) var i overensstemmelse med resultatene av MTT-analysen i fig. 1B.
ASPC-1-celler inkubert med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml) ble underkastet den scratch såret assay (A) og Matrigel transmembrane invasjon assay (B). Resultatene er gjennomsnittet ± SD. av triplikate målinger av tre uavhengige eksperimenter. ASPC-1-celler inkubert med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer ble utsatt for MTT-celleproliferasjonsanalyse (Resultatene er angitt som absorbans-avlesninger ved 490 nm) (C) eller farget med et FITC- konjugert antistoff mot markør spredning PCNA og DAPI (150 celler ble telt pr tilstand, og prosentandelen av PCNA-positive celler er presentert.) (D). Resultatene er gjennomsnittet ± SD. for triplikate bestemmelser i tre uavhengige forsøk. Sanntids-PCR ble anvendt for å bestemme mRNA-nivåer for å evaluere oppregulert ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer (E) og EMT-spesifikke gener (F) i ASPC-1-celler inkubert med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml, 24 hr ). De relative mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH. Alle behandlinger i denne figur ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. G: Mikrofotografier av ASPC-1-celler inkubert med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer). Original forstørrelse, 200X.
I denne studien, ved hjelp av real-time PCR, fant vi også at PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer) behandling signifikant oppregulert uttrykk for transkripsjons repressors i prosesser i EMT, induserende gener som ZEB2 i ASPC-1-celler (fig. 1E). Vi fant ut at det ikke har noen endring i uttrykket av sneglen en, Snail 2, Twist og E47. Disse endringene i ekspresjon var samtidig med tap av E-cadherin og zonula okkludens-1 og med forsterkningen i vimentin, fibronektin og N-cadherin uttrykket (fig. 1F). Viktigst, ASPC-1-celler behandlet med PDGF-BB vist en langstrakt /uregelmessig fibroblastoid morfologi, som viste en epitelial brostein utseende (fig. 1G). Disse resultatene tyder på at PDGF førte til oppkjøpet av EMT fenotype.
Regulering av miRNA uttrykk av PDGF-BB Behandling i ASPC-1 celler
Real-time PCR ble brukt til å avgjøre om behandling av cellene med PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer) kan endre ekspresjonen av miRNA sammenlignet med ubehandlede celler. Vi fant ut at MIR-221-3p og MIR-221-5p var to i de få mirnas beriket i ASPC-1 celler behandlet med PDGF-BB (Fig. 2A), noe som tyder på at Mir-221 uttrykk kan bli aktivert av PDGF signalering. En tids løpet av uttrykk for MIR-221-3p, MIR-221-5p, MIR-222-3p og MIR-222-5p ble undersøkt etter PDGF-BB behandling i ASPC-1 celler. MiR-221-3p og MIR-221-5p ble indusert 2,4 ganger og 1,7 ganger etter henholdsvis 4 timers behandling med PDGF og gradvis redusert med 10 h (Fig. 2B). Viktigere var robust induksjon av både primære transkriptene (Pri-MIR-221) og mellomproduktet (Pre-MIR-221) av MIR-221 observert så tidlig som 2 timer etter PDGF-behandling, hvilket antyder at MIR-221 er sannsynligvis vil være transkripsjonelt indusert av PDGF signalering (figur 2C).
A:. De relative miRNA nivåene i ASPC-1-celler behandlet med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer) B, C: Tid retters uttrykk for den relative uttrykk for MIR-221-3p, MIR-221-5p, MIR-222-3p og MIR-222-5p (B), og MIR-221 transkripsjoner (Pri-MIR-221), Pre- MIR-221 eller modne MIR-221 (C) normalisert til GAPDH (for Pri-MIR-221 eller Pre-MIR-221), eller U6 liten kjernefysiske RNA (for MIR-221-3p, MIR-221-5p, speil 222-3p, MIR-222-5p og modne MIR-221) i ASPC-1-celler behandlet med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml, 24 timer). D: ASPC-1-celler ble behandlet med bærer eller PDGF-BB (20 ng /ml), eller transfektert med en negativ kontroll, en MIR-221 ligner, anti-MIR-221, eller anti-MIR-221 og etterfulgt av PDGF -BB behandling., og underkastet QRT-PCR av miR221. Alle behandlinger i denne figuren ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD.
MIR-221 er avgjørende for PDGF-mediert Epitelial-mesenchymale Transition Phenotype, migrasjon og Vekst av ASPC-1 celler
Vi transfekterte ASPC-1 celler med syntetisk Mir-221 (MIR-221 etterligne) eller kontrollere etterligner (som inneholder en sekvens fra GFP) og undersøkt EMT fenotype. Eksogent MIR-221 oppregulert ekspresjonen av ZEB2 og vimentin mRNA og protein, og det reduserte ekspresjon av E-cadherin mRNA og protein, tilsvarende effekten av PDGF (Fig. 3A, B, C). Deretter RNA oligonukleotider mot Mir-221 (anti-MIR-221) ble transfektert inn ASPC-1 celler til å hemme MIR-221-funksjon. Anti-MIR-221 transfeksjon redusert både basal og PDGF-indusert ekspresjon av MIR-221 med mer enn 70% (Fig. 2C). Western blot-analyse (Fig. 3B) og real-time PCR (fig. 3C) indikerte at PDGF-BB-mediert EMT fenotype ble betydelig svekket når MIR-221 ble hemmet. Disse resultatene bekrefter at MIR-221 spiller en avgjørende rolle i PDGF-mediert EMT fenotype.
ASPC-1 celler ble transfektert med en negativ kontroll, Mir-221 etterligne, eller antisense oligonukleotider i Mir-221 ( anti-MIR-221). Cellene ble deretter behandlet med PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer og underkastet QRT-PCR (A, C) eller Western blot-analyse (B) av transkripsjonsfaktorer og EMT-spesifikke genetiske markører. ASPC-1-celler ble transfektert med en negativ kontroll, MIR-221 etterligner, eller antisense oligonukleotider til MIR-221 (anti-MIR-221) og underkastet den Matrigel transmembrane invasjon assay (D) i nærvær eller fravær av 20 ng /ml PDGF-BB. ASPC-1-celler ble transfektert med en negativ kontroll, ble MIR-221 etterligner, eller antisense oligonukleotider til MIR-221 (anti-MIR-221), etterfulgt av PDGF-BB-behandling i 24 timer, og deretter farget med et FITC- konjugert antistoff mot markør spredning PCNA og DAPI. I alt ble 150 celler tellet pr tilstand, og prosentandelen av PCNA-positive celler (E) er presentert. Alle behandlingsforsøk i denne figuren ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD.
PDGF ikke bare kan formidle EMT fenotype, men også kan fremme celle migrasjon og spredning. Derfor ble ASPC-1-celler transfektert med en MIR-221 ligner, anti-MIR-221, eller anti-GFP (kontroll) for å undersøke hvorvidt induksjon av MIR-221 ved PDGF spiller en rolle i cellemigrering og proliferasjon. Når MIR-221 funksjonen ble blokkert av anti-MIR-221, hadde PDGF ikke endre nivået av cellevandring og spredning, noe som tyder på at induksjon av MIR-221 er viktig for PDGF-avhengige celle migrasjon (Fig. 3D) og spredning (Fig . 3E). Omvendt, transfeksjon av MIR-221 etterligne alene signifikant forhøyet cellevandring (Fig. 3D) og proliferasjon (fig. 3E) til et nivå lik den til ikke-transfekterte celler behandlet med PDGF. Disse resultatene indikerer at PDGF-avhengig induksjon av mir-221 er nødvendig for å fremme cellemigrering og proliferasjon.
Således MIR-221 medierer effektene av PDGF på migrering, proliferasjon og differensiering av ASPC-1-celler . Dette resultatet reiser spørsmålet om hvorvidt en enkelt Mir-221 mål kan være ansvarlig for alle disse fenomenene eller om MIR-221 kan sende signalet gjennom flere funksjonelt og fysisk forskjellige mål.
MiR-221 Fremmer EMT ved målretting TRPS1
En tidligere studie har vist at GATA familien transcriptional repressor TRPS1 kan hemme EMT ved å redusere ZEB2 uttrykk [16], [22]. MiR-221 har tidligere blitt vist å målrette TRPS1 mRNA, som fører til redusert ekspresjon av genprodukter gjennom mRNA degradering og /eller translasjonelle inhibering [16]. Vi først undersøkt om TRPS1 mRNA eller protein nivåer er modulert av PDGF-BB i ASPC-1 celler. Den TRPS1 mRNA-nivået ble redusert med ca 55% (fig. 4A) ved behandling av ASPC-1 celler med PDGF-BB i 24 timer under forhold som vesentlig hemmet uttrykket av EMT markører (Fig. 3B, C). Derfor er TRPS1 regulert av PDGF-signalering. For å vurdere om MIR-221 er ansvarlig for PDGF-avhengige nedregulering av TRPS1, ble Mir-221 etterligne transfektert inn ASPC-1 celler, og deretter protein og mRNA-nivåer av TRPS1, ZEB2, E-cadherin og vimentin var undersøkt ved Western blot-analyse og real-time PCR. Eksogent MIR-221 signifikant reduksjon i ekspresjonen av TRPS1 og E-cadherin og økt ekspresjon av ZEB2 og vimentin (fig. 4B, C, D, E). Tvert imot, når mer enn 70% av endogen MIR-221 ble oppbrukt av anti-MIR-221, ble nivåene av TRPS1 mRNA og protein forhøyet (fig. 4A, B), og de ASPC-1-celler presentert EMT fenotype (fig. 4F, G). Videre observerte vi at eksogent MIR-221 ikke lenger forandre ekspresjonen av det EMT fenotype etter TRPS1 knockdown etter siRNA. Enda viktigere, har PDGF-BB-behandling ikke undertrykke TRPS1 i nærvær av anti-MIR-221 (fig. 4A). Resultatene viste at MIR-221 direkte rettet mot TRPS1 mRNA, som tidligere observert [16].
ASPC-1 celler ble transfektert med en negativ kontroll etterligne, Mir-221 etterligne, antisensoligonukleotider i Mir-221 ( anti-MIR-221) eller TRPS1 siRNA. Cellene ble deretter behandlet med PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer og underkastet QRT-PCR av TRPS1. ASPC-1-celler ble transfektert med en negativ kontroll ligner, og MIR-221 etterligner, antisensoligonukleotider i Mir-221 (anti-MIR-221) eller TRPS1 siRNA i 3 dager underkastet Western blot-analyse av TRPS1, ZEB2, E- cadherin og vimentin. ASPC-1 celler ble transfektert med antisensoligonukleotider i Mir-221 (anti-MIR-221). Cellene ble deretter behandlet med en negativ kontroll eller MIR-221 mimic i 3 dager og underkastet QRT-PCR for ZEB2 (C), E-cadherin (D) og vimentin (E). ASPC-1 celler ble transfektert med en negativ kontroll ligne, Mir-221 etterligne eller antisensoligonukleotider i Mir-221 (anti-MIR-221). Cellene ble deretter behandlet med PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer og utsatt for immunofluorescens farging for vimentin (F) og E-cadherin (G) Alle behandlinger i denne figur ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD.
PDGF-mediert hemming av p27Kip1 av MIR-221 Fremmer Cell Proliferation
p27Kip1 er medlem av Cip /Kip familie av cyclin-avhengig kinase (CDK) inhibitorer som funksjon å negativt regulere cellesyklusprogresjon fra G1 til S-fasen ved å binde seg til CDK2 og cyclin E komplekser [23]. For å teste hvilken rolle p27Kip1 i ASPC-en celleproliferasjon, reduserte vi den endogene nivået p27Kip1 av siRNA (si-p27Kip1) (Fig. 5A, B) og målt vekst celle over 4 dager (Fig. 5C). Spredning av si-p27Kip1-transfekterte celler ble betydelig økt i forhold til å kontrollere celler, noe som tyder på at redusert uttrykk for p27Kip1 kan fremme cellevekst i ASPC-1 celler. Derfor hypotese vi at PDGF-avhengig fremming av ASPC-1-celleproliferasjon kan være mediert gjennom nedregulering av p27Kip1. Kvantitativ analyse av PCNA farging viste at p27Kip1 ekspresjon ble inhibert med PDGF-BB (20 ng /ml) etter 24 timer med behandling, og transfeksjon av Si-p27Kip1 økt antall prolifererende celler i en lignende grad som PDGF behandling (Fig. 5 C, D, E). MiR-221 har tidligere blitt vist å inhibere p27Kip1 og fremme celleproliferasjon [13], [24], [25]. Derfor undersøkte vi om PDGF-mediert spredning av ASPC-1 celler påvirkes av MIR-221-mediert hemming av p27Kip1. Transfeksjon av MIR-221 etterligne betydelig redusert ekspresjon av p27Kip1 (Fig. 5A, B) og forhøyet celleproliferasjon (fig. 5D, E), i likhet med celler transfektert med Si-p27Kip1 (Fig. 5A, B, D, E ). Når endogen MIR-221 ble oppbrukt av anti-MIR-221, hadde PDGF-BB behandling ikke undertrykke uttrykk for p27Kip1 (Fig. 5A, B). Dermed blir PDGF-avhengig økning i celleproliferasjon ser ut til å være formidlet av en hemming av en spesifikk mål for MIR-221 og nedregulering av p27Kip1
(A, B). ASPC-1-celler ble transfektert med en negativ kontroll ligne, Mir-221 etterligne, antisensoligonukleotider i Mir-221 (anti-MIR-221) eller p27Kip1 siRNA. Cellene ble deretter behandlet med PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer og underkastet QRT-PCR (A) og Western blot-analyse (B) for p27Kip1. (C): ASPC-1-celler ble transfektert med negativ kontroll eller p27Kip1 siRNA og utsatt for MTT-celleproliferasjonsanalyse (Resultatene er angitt som absorbans-avlesninger ved 490 nm). (C) (D, E): ASPC-1-celler ble transfektert med en negativ kontroll ligner, MIR-221 ligner, antisense oligonukleotider til MIR-221 (anti-MIR-221) eller p27Kip1 siRNA. Cellene ble deretter behandlet med PDGF-BB (20 ng /ml) i 24 timer og underkastes farging med et FITC-konjugert antistoff mot markør spredning PCNA og DAPI (E). I alt ble 150 celler tellet pr tilstand, og prosentandelen av PCNA-positive celler er presentert (D). Alle eksperimentene i dette tallet ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD.
Diskusjoner
En økende mengde litteratur tyder på at PDGF kan fungere som en sentral aktør i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker ved å regulere prosesser av celleproliferasjon, apoptose, migrasjon, invasjon, angiogenese og metastasering. Det har blitt rapportert at PDGF-signalisering er ofte deregulert i humane ondartede sykdommer, og oppregulert ekspresjon av PDGF ble funnet i pankreas, prostata, lunge, nyre, ovarie og hjernekreft [6]. I de senere årene har PDGF signal vist seg å spille en viktig rolle i oppkjøpet av EMT fenotype i kreftceller [6], [8], [26]. Videre har det blitt stadig klarere at den EMT spiller en viktig rolle i progresjon av kreft og er også ansvarlig for motstanden av kreftceller til konvensjonelle kjemoterapeutika. Derfor har PDGF signal vært ansett for å være viktig i menneskelige kreftformer, og dermed kan PDGF signal representere en roman terapeutisk mål, noe som tyder på at utviklingen av agenter som er rettet mot PDGF signal er sannsynlig å ha en betydelig terapeutisk effekt på kreft hos mennesker. Vår nåværende studie viste tydelig at PDGF-BB behandling fremmet celle migrasjon og spredning og resulterte i oppkjøpet av EMT fenotype ved oppregulering av mesenchymale cellemarkører (ZEB1, ZEB2, Snail2, og vimentin) og nedregulering av en epitelceller markør (E-cadherin) i ASPC-1 celler. Dermed rettet mot PDGF signal kan hemme oppkjøpet av EMT fenotype, som vil resultere i reversering av legemiddelresistens i behandling av metastatisk sykdom.
I denne studien har vi videre vist at MIR-221-genet transkripsjon regulert av PDGF-signalering. PDGF veien er vel kjent som en modulator av ekspresjonen av forskjellige protein gener, men MIR-221 er den første miRNA-genet funnet å være regulert av PDGF. Det er interessant å spekulere i at PDGF kan aktivere MIR-221 transkripsjon gjennom rekruttering av mikroftalmi assosierte transkripsjonsfaktor eller andre E-box bindende proteiner. Vi fant at MIR-221 ble fremkalt 2,5 ganger etter 4 timers behandling med PDGF, og både primære transkriptene og mellomprodukter fra MIR-221 ble observert så tidlig som 2 timer etter PDGF-behandling, hvilket antyder at MIR-221 uttrykk er aktivert av PDGF signalering. MIR-221 er høyt uttrykt i ulike kreft-avledede celler, inkludert pankreatisk karsinom, prostatakarsinom, og thyroid karsinom-celler [14], [15]. Dessuten har MIR-221 er vist å stimulere flere aspekter av kreft patogenesen, inkludert metastaser, invasjon, og selvfornyelse [27], [28], [29]. Når MIR-221 funksjonen ble blokkert av anti-MIR-221, fant vi at PDGF ikke endre nivået av cellevandring og spredning og resultere i oppkjøpet av EMT fenotype. Disse resultatene bekrefter at MIR-221 spiller en avgjørende rolle i PDGF-mediert epitelial-mesenchymale overgang fenotype, migrering og vekst av ASPC-1 celler. MiR-221 og MIR-222 har samme frø-sekvensen, noe som indikerer en stor grad av funksjonell overlapping mellom disse to mRNA.
