Abstract
Aberrant uttrykk for mikroRNA-146a (MIR-146a) har blitt rapportert å være involvert i utvikling og progresjon av forskjellige typer kreft. Imidlertid har sin rolle i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ikke er klarlagt. Målet med denne studien var å undersøke bidraget fra MIR-146a til ulike sider ved ondartet fenotype av menneskelige NSCLCs. I funksjonelle eksperimenter, MIR-146a trykt cellevekst, indusert cellulær apoptose og hemmet EGFR nedstrøms signalisering i fem NSCLC cellelinjer (H358, H1650, H1975, HCC827 og H292). MIR-146a også hemmet vandringskapasitet på disse NSCLC celler. På den annen side, MIR-146a forbedret inhibering av celleproliferasjon av medikamenter som målretter EGFR, inkludert både TKI (gefitinib, erlotinib, og afatinib) og et monoklonalt antistoff (cetuximab). Disse effektene var uavhengig av EGFR-mutasjonstatus (villtype, sensibiliserende mutasjon eller motstand mutasjon), men var mindre potent enn effekten av siRNA som målretter av EGFR. Våre resultater tyder på at disse effektene av MIR-146a er på grunn av sin satsing på EGFR og NF-kB signalering. Vi fant også, i klinisk formalinfiksert parafin innebygd (FFPE) lungekreft prøvene, at lav uttrykk for MIR-146a ble korrelert med avansert klinisk TNM stadier og fjernmetastaser i NSCLC (
P
0,05). Pasientene med høy MIR-146a uttrykk i sine svulster viste lengre progresjonsfri overlevelse (25,6 uker i MIR-146a høye pasienter vs. 4,8 uker i MIR-146a lave pasienter,
P
0,05). MIR-146a er derfor en sterk kandidat prognostisk biomarkør i NSCLC. Dermed indusere MIR-146a kan være en terapeutisk strategi for NSCLC
Citation. Chen G, Umelo IA, Lv S, Teugels E, Fostier K, Kronenberger P, et al. (2013) MIR-146a Hemmer cellevekst, cellemigrasjon og induserer apoptose i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 8 (3): e60317. doi: 10,1371 /journal.pone.0060317
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 04.10.2012; Godkjent: 25 februar 2013; Publisert: 26 mars 2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av forsknings~~POS=TRUNC fondet~~POS=HEADCOMP av Boehringer Ingelheim GmbH. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne fikk støtte fra en kommersiell kilde: Boehringer Ingelheim GmbH. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) utgjør 75-85% av nydiagnostiserte lungekrefttilfellene. Over 70% av NSCLC pasienter til stede med avansert sykdom, og den samlede fem års overlevelse for NSCLC er bare 16%. For tidlig stadium eller lokalt avansert lungekreft, er kirurgi den mest effektive behandlingen, og kombinasjonskjemoterapi er standard adjuvant tilnærming. For stadium III /IV NSCLC, er platina-basert kombinert kjemoterapi dagens standard på omsorg, men med mye rom for forbedring [1], [2]. Lunge karsinogenese er en flertrinns prosess, som resulterer fra aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener. De molekylære mekanismene bak utviklingen av NSCLC er for tiden fortsatt dårlig forstått. Derfor vil en bedre forståelse av disse mekanismene være nyttig å utvikle nye terapeutiske mål og strategier for behandling av human NSCLC [3], [4], [5].
I de senere år microRNAs (mirnas) har fått økende oppmerksomhet i kreftforskning. Disse små, ikke-kodende RNA kan hemme target-genekspresjon ved å binde seg til det 3′-ikke-translaterte region av mål-mRNA, noe som resulterer i enten mRNA degradering eller inhibering av translasjon. Mirnas spiller viktige roller i mange normale biologiske prosesser som involverer celledeling, differensiering, apoptose, og stress motstand [6], [7]. Men studier har også vist at avvikende miRNA ekspresjon eller mutasjon er korrelert med utvikling og progresjon av kreft. De mirnas kan ha onkogene eller tumorsupressorproteinene aktiviteter, og dermed mirnas dukker opp som mål for terapi kreft [8]. I tillegg kunne mirnas brukes som prognostiske og diagnostiske biomarkører i kreft.
Ekspresjon av MIR-146a har blitt funnet å være oppregulert i papillær thyroideakarsinom [9], anaplastisk tyreoideakreft [10] og livmorhalskreft [11], noe som tyder på MIR-146a kan fungere som en «onkogen» miRNA i disse kreftformene. Likevel ble lavere uttrykk for MIR-146a rapportert i prostata kreft [12], bukspyttkjertelkreft [13] og magekreft [14], [15]. Derfor kan rollen til mir-146a varierer i forskjellige typer kreft. I tillegg har MIR-146a nivå er funnet å korrelere med metastatisk progresjon i orale svulster [16]. Funksjonelt, viser MIR-146a-uttrykke celler markert svekket invasjon og migrasjon kapasitet i forhold til å kontrollere celler i både brystkreft [17] og bukspyttkjertelkreft [13]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at moduler MIR-146a nivåer har terapeutisk potensial til å undertrykke invasjoner og metastaser. Men til vår kunnskap, har ingen studier evaluert assosiasjonen mellom MIR-146a og NSCLC celler. Videre er det ingen tilgjengelige effektene av MIR-146a om biologi NSCLC celler data. MIR-146a kan målrette EGFR, basert på forutsagte baseparing ved hjelp av miRBase analyse [18], som er blitt funksjonelt bekreftet ved brystkreft [17], [19] og kreft i bukspyttkjertelen [13]. EGFR spiller en kritisk rolle i NSCLC og aktiviteten av EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) i NSCLC, spesielt i nærvær av aktiverende EGFR mutasjoner [20]. Komplekset EGFR signaltransduksjonsbane innebærer Ras /MAPK-kaskaden, fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K), signal transduser og aktivator av transkripsjon (stat), og nedstrøms protein kinase C (PKC) [21]. I tillegg aktiverer EGFR NF-kB ved fosforylering av IKB [22]. Videre spiller MIR-146a en rolle i regulering av NF-kB [13], [17], [19], [23] i forskjellige maligniteter, selv om NF-kB er ikke et direkte mål for MIR-146a. I tillegg har forholdet mellom MIR-146a og signalering av EGFR eller NF-kB ikke er klarlagt.
Den potensielle betydningen av denne miRNA, MIR-146a, kom til vår oppmerksomhet i eksperimenter vi har utført, og at antedated oppdagelsen av dets rolle i andre ondartede sykdommer eller forholdet til EGFR mRNA. I disse eksperimentene upubliserte, profilert vi miRNA ekspresjon i Ba /F3-celler transfektert med villtype og mutante EGFR-genene henholdsvis, ved hjelp av en væske kulebasert matrise tidligere beskrevet [24]. Sammenlignings miRNA profiler ble oppnådd i baselinjeforholdene og under behandling med EGFR TKI. Plattformen var en in-house proprietær plattform og inkludert 425 miRNAs. MIR-146a var miRNA det mest sterkt korrelert med mutasjonsstatus av EGFR, og hadde den største variasjon i respons til TKI behandling i EGFR mutante NSCLC-celler og BA /F3-celler transfektert med mutante EGFR i forhold til EGFR villtypeceller. Samtidig er det sekvenshomologi med EGFR ble identifisert [18].
Som følge av disse resultater vi undersøkt videre effekten av MIR-146a på cellevekst, apoptose og motilitet av humane NSCLC-celler. I tillegg ble effekten av en MIR-146a ligne undersøkt når den kombineres med EGFR TKI (gefitinib, erlotinib, og afatinib) og et monoklonalt antistoff (cetuximab) spesielt hos NSCLC cellelinjer som er resistente mot EGFR TKI. Til slutt, forholdet mellom MIR-146a uttrykk og kliniske parametre og prognose ble også undersøkt ved hjelp av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) lungekreftprøver.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
den menneskelige NSCLC cellelinjer H358, H1650, H1975, HCC827 og H292 ble hentet fra American Type Culture Collection (
ATCC, Nederland
) og dyrket som beskrevet tidligere [25], [ ,,,0],26]. EGFR-spesifikt monoklonalt antistoff cetuximab (2 mg /ml), EGFR TKI gefitinib og erlotinib, og en panHER inhibitor av EGFR, HER2 og HER4-kinaser, afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), ble fremstilt som beskrevet tidligere [25] [26].
Re-uttrykk og hemming av MIR-146a i NSCLC celler
NSCLC-celler ble sådd i en 24-brønns plate (2,5 × 10
4 celler per brønn ) eller en 96-brønns plate (2,5 x 10
3-celler per brønn) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Cellene ble deretter transfektert med en MIR-146a etterligne, en miRNA etterligne negativ kontroll, en Mir-146a hemmer, eller en miRNA hemmer negativ kontroll (
ambion, Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia
) henholdsvis en endelig konsentrasjon på 60 nmol /l ved hjelp av Lipofectamine
TM 2000 (
Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgia
). Cellene ble transfektert med miRNA etterligne eller miRNA inhibitor daglig. Etter 5 dager med transfeksjon, ble cellene delt og transfektert daglig igjen opp til dag 10 [13]. EGFR spesifikk siRNA ble beskrevet tidligere [25], [27] (sekvens: GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT). EGFR spesifikke siRNA ble transfektert inn NSCLC celler med samme metode som ovenfor
Vevsprøver
Vi har samlet vev fra 101 påfølgende pasienter. (I alderen fra 29 til 83 år, med en gjennomsnittlig 68,3 år) som hadde gjennomgått kirurgisk reseksjon eller biopsi for NSCLC ved de to institusjoner. En prøve av ikke-påvirkede normalt lungevev ble også samlet fra 76 pasienter og anvendt som kontroll sammenkoblet. Alle prøver ble behandlet for patologisk undersøkelse. Studien protokollen ble godkjent av de lokale etiske komiteer fra First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Kina og Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), Belgia. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. De clinicopathological parametere er beskrevet i Tabell 1.
RT-qPCR
For
in vitro
eksperimenter, RNA isolering, RNA normalisering, og revers transkripsjon var som tidligere beskrevet [25], [27], [28]. For klinisk FFPE vev, ble blokker seksjonert ved en tykkelse på 10 um (3 seksjonene for total RNA isolering). Vevet ble avvokset av xylen og etanol. Det totale RNA ble isolert fra tumorsnitt ved hjelp av miRNeasy FFPE Kit (
QIAGEN, KJ Venlo, Nederland
) i henhold til produsentens instruksjoner med modifikasjoner ved å endre inkubasjonstiden etter blanding med proteinase K i 36 timer ved 55 ° C, i mellomtiden, og legger proteinase K hver 12 timer for å opprettholde sin konsentrasjon. Avhengig av størrelsen av tumoren prøven, den RNA-konsentrasjonen varierte fra 20 ng /mL til 2 ug /ul detektert av Nanodrop 2000 (
Wilmington, DE 19810 USA
). Intron-spenner RT-PCR-primere som er spesifikke for EGFR eller GAPDH mRNA ble tidligere beskrevet [25], [28], [29]. De primere for MIR-146a og RNU6B ble inkludert i TaqMan
® mikroRNA Analyser (
4427975-000468, Applied Biosystems, Life Technologies Europe B.V., Gent, Belgia
). De reverse primere ble også brukt i revers transkripsjon takt med TaqMan
® mikroRNA Reverse Transcription Kit (
4366596, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Belgia
), i et totalvolum på 10 ul . Sanntids qPCR for EGFR mRNA ble utført på Roche LightCycler
® 1,5 instrument med SYBR grønn deteksjon og smeltekurve analyse, som beskrevet tidligere [28] og for miRNA, Applied Biosystems PCR7900 ble anvendt. Målet mRNA eller miRNA overflod i hver prøve ble normalisert til referanse GAPDH eller RUN6B som rapportert [25], [27], [30].
Cell vekst
Cellevekst ble vurdert ved hjelp en kolo tetrazolium (MTS) assay (
CellTiter96 vandige løsning Cell Proliferation assay G3580, Promega, Madison, USA
). Den miRNA etterligne, miRNA hemmer eller siRNA ble transfektert daglig for 0, 5 og 10 dager. For forsøkene kombinerer MIR-146a ligne og andre agenter (EGFR TKI og mAb), ble Mir-146a ligne utgangspunktet transfektert inn i cellene, og senere cellene ble dyrket i 7 dager. De andre agenter ble lagt på 7
th dag, og cellekultur ble forlenget i ytterligere 3 dager. Protokollen ble som tidligere beskrevet [25].
Celleviabilitet
For ytterligere å bekrefte dataene fra MTS analysen, ble celleviabilitet oppdaget av fluorimetrisk påvisning av resorufin (
CellTiter-Blue Cell levedyktighet analysen, G8080, Promega, Madison, USA
) som beskrevet tidligere [25].
Caspase-3/7 aktivitetsregistrering
Caspase-3/7 aktivitet ble målt ved hjelp av en syntetisk rhodamin merket caspase-3/7 substrat utføres umiddelbart etter påvisning av cellelevedyktighet på de samme brønnene som tidligere beskrevet [25].
Fluorescent mikros evaluering av celle apoptose og morfologi
effekter av MIR-146a etterligne eller hemmer eller EGFR siRNA på apoptose og kjernefysisk morfologi i cellene ble vurdert av Hoechst 33342 og propidiumjodid (PI) dobbel fluorescerende kromatin flekker som beskrevet tidligere [25].
Wound- healing analysen
Celler ble sådd i individuelle brønner i en 6-brønn kultur plate. Transfeksjon ble utført som ovenfor. Før transfeksjon, ble en steril 10 ul pipettespiss som brukes til å lage riper i lengderetningen en konstant diameter stripe i sammenflytende monolag. Mediet og celleavfall ble sugd bort og erstattet med 2 ml friskt medium. Bildene ble tatt på 0, 36, 72 og 108 timer etter såret. For statistisk analyse ble ti tilfeldig valgte felt langs hvert sår merket, og det område av såret ble målt og gjennomsnittet ble beregnet som sårområdet av denne såret. Den sårhelende område = viklet rundt 0-t-sår område på 36, 72 eller 108 timer, henholdsvis, sårhelende område ble først sammenlignet med sårområdet til 0 timer, og til slutt sammenlignet med mock-kontroll.
Western blot-analyse
etter å ha blitt behandlet for de angitte perioder, ble cellene vasket med PBS og lysert i en buffer inneholdende Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), Triton-X 1% Na-pyrofosfat 2,5 mM natrium ortovanadat (Na3VO4) 1 mM, leupeptin 1 ug /ml, proteasehemmere cocktails 1% og fosfatase-hemmer cocktails 1% (
Sigma -Aldrich NV /SA, Bornem, Belgia
). Lysatene ble sentrifugert ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og kokt i 5 minutter. Proteinkonsentrasjonen av løsningen ble gjenkjent av Bio-Rad Bradford proteinanalyse (
Nazareth Eke, Belgia
) og 25 ug av denaturert protein ble underkastet SDS-PAGE (10% SDS-akrylamid gel) med en loading buffer inneholdende 80 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% SDS, 10% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8), 5% 2-merkaptoetanol, 0,2% bromfenolblått og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid som tidligere beskrevet [25]. Membranen ble inkubert med følgende primære antistoffer som indikert: EGFR (
Cell Signa
), fosfor-EGFR (Tyr1173, klone 9H2,
Upstate
), fosfor-ERK1 /2 (pTpY185 /187,
Invitrogen
), fosfor-AKT /PKB (Ser473,
Invitrogen
), fosfor-STAT3 (Tyr705, 3E2,
Cell Signa
), fosfor-stat5 ( Tyr694,
BD Biosciences
), fosfor-IκBα (Ser32 /36, 5A5,
Cell Signa
), IκBα (L35A5,
Cell Signa
), fosfor-NF- kB p65 (Ser536,
Cell Signa
), NF-kB (
Cell Signa
), fosfor-IRAK-1 (Ser376,
Santa Cruz Biotechnology
), IRAK- 1 (
Santa Cruz Bioteknologi
) og β-aktin (
Sigma-Aldrich NV
.).
Statistisk analyse
SPSS19.0 ble brukt for Statistisk analyse. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter med mindre annet er angitt. Verdier ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Én-veis analyse av varians (ANOVA) test ble brukt til å analysere betydning mellom gruppene. De minst signifikant forskjell (LSD) metode for multiple sammenligninger med foreldregruppen og kontrollgruppen ble brukt da sannsynligheten for ANOVA var statistisk signifikant. Survival analyse ble utført ved hjelp av log-rank test og Kaplan-Meier plott tilnærming. Statistisk signifikans ble bestemt på et
P
0,05 nivå. I analysen av additivitet og synergisme, den teoretiske null-interaksjon (nøyaktig additiv) dose-responskurven for hver enkelt MIR-146a mimic + medikamentkombinasjonen ble beregnet ved å anvende Bliss uavhengighet kriterier [31], [32]. Den statistiske evaluering av additiv eller synergistisk effekt ble gjort ved å sammenligne hvert MIR-146a mimic + medikament dose-responskurve med den Bliss uavhengighet kurve. Synergisme er sluttet når MIR-146a mimic + medikament dose-responskurve er høyere enn 95% konfidensintervaller for den respektive Bliss uavhengighet kurve, mens additivitet er når MIR-146a mimic + medikament dose-responskurve er lavere enn den til Bliss uavhengighet kurve og høyere enn den individuelle behandling kurve. Analysen av additivity og synergisme ble også vurdert av Biosoft CalcuSyn program (Ferguson, MO, USA). Kombinasjonen Index (CI) ble brukt til å uttrykke synergisme (CI 1), additiv effekt (CI = 1), eller antagonisme (CI 1). [33]
Resultater
MIR -146a hemmer cellevekst og induserer celle apoptose hos NSCLC celler
Først grunnlinjen uttrykk for MIR-146a ble vurdert i alle cellelinjene studert av real time RT-qPCR analyse. Transfeksjon effektiviteten av MIR-146a ligne og inhibitor ble også først bekreftet av RT-qPCR analyse. Mir-146a uttrykk nivå på 5 og 10 dager etter transfeksjon ble analysert. Etter transfeksjon med MIR-146a hemmer, ΔΔCq var 1,82 (71,68% MIR-146a knock-down) for H358, 1,09 (53,02% knock-down) for H1650, 2,4 (81,05% knock-down) for H1975, 1,92 (73,57 % MIR-146a knock-down) for HCC827, og 1,89 (73,02% knock-down) for H292 10 dager etter transfeksjon. Etter trans Mir-146a ligne i 10 dager, ble Mir-146a nivåer alvorlig økt, med ΔΔCq -14,69 (26431.0372 folder) for H358, -10.97 (2005,8528 folder) for H1650, -12.78 (7032,3681 folder) for H1975, -13,25 (9741.9847 folder) for HCC827 og -13,81 (14362.3081 folder) for H292. Negative kontroller hadde ingen endring av nivået av MIR-146a (data ikke vist). Med MIR-146a-inhibitor, ble celleformering noe forbedret i alle cellelinjene som ble testet, men uten vesentlig forskjell sammenliknet med simulerte kontroller. Etter transfeksjon med MIR-146a ligner, ble en betydelig reduksjon i proliferasjon noteres på 10
th dag i alle fem cellelinjer, men mindre enn det som er observert med siRNA rettet mot EGFR (Figur 1, figur 2). For å bekrefte disse resultatene, ble effekten på levedyktighet vurdert ved hjelp av en fluorimetrisk resorufin levedyktighet analysen (CellTiter Blå, Promega, data ikke vist), og ved mikroskopisk telling av levedyktige (Hoechst 33342 positiv /PI negative) celler (figur 3, figur 4) . I begge analysene resultatene i stor grad avspeilet de MTS tetrazolium analyseresultatene. For å kontrollere om MIR-146a er i stand til å indusere apoptose ble CellTiter Blå analysen multiplekset med et fluorescerende caspase 3/7 analysen (Apo One, Promega). Resultatene viser at den MIR-146a-inhibitoren ikke økte caspase-3/7-aktivitet. Imidlertid MIR-146a mimic betydelig forbedret caspase-3/7-aktivitet i alle de fem NSCLC-cellelinjene som ble testet, men effekten var mye mindre enn det som ses med siRNA rettet mot EGFR (figur 5, figur 6). Effekten på apoptose ble bekreftet mikroskopisk av Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farging (figur 3, figur 7).
NSCLC celler (H358, H1650 og H1975) ble inkubert i nærvær av MIR-146a hemmer, mimikk , EGFR siRNA og forskjellige kontroller, for 0, 5 og 10 dager. Celleveksten ble målt ved anvendelse av den kolorimetriske tetrazolium (MTS) analyse (CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay). Negativ kontroll 1 er miRNA hemmer negativ kontroll og negativ kontroll 2 er miRNA etterligne negativ kontroll. *
P
. 0,05, sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
NSCLC celler ble behandlet som nevnt i figur 1. *
P
. 0,05 sammenlignet med blindprøve på samme tidspunkt
NSCLC-celler ble behandlet som omtalt i figur 1, og virkningen på apoptose ble bestemt og sammenlignet med mock-kontroll ved 0, 5 og 10 dager etter transfeksjon med Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farging.
effekten av MIR-146a på cellevekst (H358, H1650 og H1975) ble analysert med Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farging. *
P
0,05, **
P
. 0,01 sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
NSCLC celler ble behandlet som nevnt i Figur 1, og caspase-3/7-aktivitet ble undersøkt og sammenliknet med simulerte kontroller. *
P
0,05, **
P
. 0,01 sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
NSCLC celler (HCC827 og H292) ble behandlet som nevnt ovenfor. *
P
0,05, **
P
. 0,01 sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
Effekten av MIR-146a på apoptose i H358, H1650 og H1975 ble undersøkt med Hoechst 33342 og PI dobbel fluorescerende farging. *
P
0,05, **
P
0,01 sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
MIR-146a undertrykker motilitet. NSCLC celler
Deretter vurderte vi effekten av MIR-146a funksjonen på motilitet av tre NSCLC cellelinjer H358, H1650 og H1975. I mock kontrollene, utransfekterte H358 cellene trenger lengst tid å helbrede ( 108 timer). Tvert imot, H1975-celler helbredet den raskeste ( 72 timer). Mir-146a hemmer forårsaket en markert akselerert sårhelende rate i H358-celler, og hadde liten effekt i H1650 og H1975 celler. Mir-146a ligne førte til en moderat nedgang sårhelende rate i H358 og H1650 celler henholdsvis. Men Mir-146a ligne hadde ingen innflytelse på cellemotilitet i H1975 celler. SiRNA rettet mot EGFR inhiberte sårhelende hastighet i alle cellelinjene som ble testet, med en mye sterkere virkning enn den MIR-146a mimic (figur 8, figur 9).
NSCLC-celler ble inkubert i nærvær av MIR-146a hemmer, MIR-146a etterligne, EGFR siRNA og forskjellige kontroller for 0, 36, 72 og 108 timer etter transfeksjon. Motilitet ble påvist ved anvendelse av den sårhelende analysen. Bildene fra ett felt av et godt representativt for ti felt av visjon i en brønn er vist (× 100). M: mock kontroll; C: Negativ kontroll for miRNA etterligne; Inhi: MIR-146a hemmer; Mimi: MIR-146a ligne; Si: EGFR-spesifikke siRNA. Den sårhelende hastighet er uttrykt i forhold til den mock-kontroll.
NSCLC-celler ble behandlet som i forsøkene som er representert på figur 8. Den sårhelende hastighet er uttrykt i forhold til den mock-kontroll. Den gjennomsnittlige forholdet ble beregnet ut fra ti felter og forsøk ble gjentatt i tre uavhengige brønner. *
P
0,05, **
P
0,01 sammenlignet med blank kontroll på samme tidspunkt
MIR-146a fører hemming av EGFR. og NF-kB signalering i NSCLC celler
for å undersøke hvilken rolle MIR-146a i reguleringen av cellesignalering, transfekterte vi NSCLC celler med MIR-146a hemmer og etterligne, og dyrket cellene for en periode på inntil til 10 dager. Vi har funnet at den økte ekspresjon av MIR-146a i NSCLC-celler resulterte i nedregulering av EGFR både på mRNA (data ikke vist), og proteinnivåer (figur 10). Viktigere, fant vi ut at fosforylert EGFR ble også nedregulert etter MIR-146a ligne transfeksjon lik EGFR-spesifikke siRNA i ulike cellelinjer (figur 10). På samme tid, nedstrøms signalering (AKT, ERK og statistiske trasé) ble også nedregulert ved MIR-146a ligner, med en svakere virkning sammenlignet med EGFR-spesifikk siRNA. For å bekrefte effektene av MIR-146a på EGFR, transfiserte vi NSCLC-celler med MIR-146a-inhibitor og funnet at inhibering av MIR-146a økte nivåene av p-EGFR, EGFR og nedstrøms signalisering (figur 10). Disse resultatene støtter hemmende effekter av MIR-146a om EGFR autofosforyleringsaktivitet og nedstrøms signalering. Fordi MIR-146a ble rapportert til også å regulere ekspresjonen av IRAK-1, som kan aktivere NF-kB-signalering [13], [34], [35], undersøkte vi effekten av MIR-146a på NF-kB signalveier i NSCLC cellelinjer. MIR-146a ligne redusert fosforylering av NF-kB-inhibitor IκBα, men ikke den totale IκBα. Videre er nivået av fosfo-NF-kB, total NF-kB og total IRAK-1 ble også redusert etter MIR-146a ligne transfeksjon (Figur 11, Figur 12), noe som indikerer at MIR-146a regulerer NF-kB og IRAK-1 signalering.
NSCLC cellelinjer ble transfektert med MIR-146a hemmer, MIR-146a etterligne, EGFR-spesifikke siRNA og forskjellige negative kontroller og western blot ble analysert 10 dager etter transfeksjon. Antistoffer omfattet fosfo-EGFR (p-EGFR), EGFR, p-ERK1 /2, p-AKT, p-STAT3, p-stat5 og β-aktin. M: mock kontroll; C1: Negativ kontroll for miRNA inhibitor; C2: Negativ kontroll for miRNA etterligne; Inhi: MIR-146a hemmer; Mimi: MIR-146a ligne; Si:. EGFR-spesifikke siRNA
NSCLC cellelinjer ble behandlet som i figur 4. Antistoffer inkludert fosfor-IκBα (p-IκBα), IκBα, p-NF-kB, NF-kB og β aktin. M: mock kontroll; C1: Negativ kontroll for miRNA inhibitor; C2: Negativ kontroll for miRNA etterligne; Inhi: MIR-146a hemmer; Mimi: MIR-146a ligne; Si:. EGFR-spesifikke siRNA
NSCLC cellelinjer ble behandlet som i figur 4. Antistoffer inkludert fosfor-IRAK-1 (S
376), IRAK-1 og β-Actin. C1: Negativ kontroll for miRNA inhibitor; C2: Negativ kontroll for miRNA etterligne; Inhi: MIR-146a hemmer; Mimi: MIR-146a ligne; Si:. EGFR-spesifikke siRNA
MIR-146a ligne forbedrer celleproliferasjon hemmende effekt av TKI og cetuximab
I tidligere arbeider har vi undersøkt effekten av å gre EGFR siRNA med EGFR TKI eller cetuximab. Blant alle de midler som ble testet, afatinib, en ErbB familie inhibitor, hadde den sterkeste veksthemmende virkning [25]. Vi ønsket å undersøke hvordan dette ville i forhold til effekten av å kombinere Mir-146a etterligne og TKI (gefitinib, erlotinib, afatinib) eller cetuximab ved hjelp av kolorimetriske MTS formazanforbindelsen spredning analysen. Inhibering av celleproliferasjon var mye høyere når MIR-146a mimic ble kombinert med afatinib, sammenlignet med enkelt medikament eller enkelt MIR-146a mimic i alle testede cellelinjer, spesielt ved lavere, sub-molare konsentrasjoner av afatinib. Imidlertid ikke hele cellevekstkurve av proliferasjonen var høyere enn den Bliss uavhengighet kurve, noe som indikerte at kombinasjonen effekten var additiv (figur 13). Kombinasjonseffekter av MIR-146a ligne med andre TKI eller cetuximab var like, men svakere enn for afatinib (data ikke vist). Dermed MIR-146a ligne forbedrer celleproliferasjon hemmende effekt av TKI og cetuximab. For å verifisere additiv eller synergistiske natur kombinere TKI /cetuximab med MIR-146a etterligne, ble en CI beregnet [31], [32]. Dette viser entydig at effekten er additiv (data ikke vist).
MTS ble utført som ovenfor og spredning inhibering ble beregnet. *
P
0,05, sammenlignet med middel alene. Bliss uavhengighet kriterium ble utført for å beregne den teoretiske additive effekt. – – – – -, Lykke uavhengighet kurve, som angir den teoretiske situasjon hvor den kombinerte effekten av MIR-146a etterligne og andre midlet er nøyaktig additiv. •, narkotika + MIR-146a ligne. ▾drugs + Negativ kontroll ligne. ▪ medikamenter alene. ◊miR-146a ligne alene (60 nM). Datapunkter representerer gjennomsnittsverdier fra tredoble brønner, og feilfelt er SD
Første utforskning av den kliniske betydningen av MIR-146a uttrykk hos NSCLC tilfeller
Vi neste undersøkte MIR-146a uttrykk i FFPE biopsier fra 101 tilfeller av NSCLC. De biopsier ble innhentet før noen systemisk behandling. I serien, 76 tilfeller var tilgjengelig med tilsvarende tilstøtende normalt lungevev. Den relative MIR-146a uttrykk var samlet signifikant lavere hos NSCLC vev enn i normal lunge vev (5.20 vs 14.01,
P
0,001) (figur 14). I serien av 76 pasienter med en sammenkoblet prøve, det var også en betydelig lavere MIR-146a uttrykk i kreftvevet i forhold til normal lunge (5,91 vs 14,01,
P
= 0,005, Figur 14). MIR-146a nivåene var signifikant høyere (
P
= 0,001) i tilfellene med en klinisk TNM stadium I og II i forhold til trinn III og IV (tabell 1, figur 15A). Videre MIR-146a uttrykk var betydelig høyere (
P
= 0,001) i de tilfeller uten fjernmetastaser enn de med metastaser (tabell 1, figur 15B). Videre er 32 pasienter med høyere MIR-146a uttrykk (høyere enn det gjennomsnittlige nivået) hadde en lengre progresjonsfri overlevelse enn pasienter med lav uttrykk. Samlet overlevelse av pasienter med høyt MIR-146a uttrykk var lengre enn for pasienter med lav uttrykk (25,6 uker i MIR-146a høye pasienter vs. 4,8 uker i MIR-146a lave pasienter,
P
= 0,038, Figur 15C). Mir-146a uttrykk var ikke relatert til andre clinicopathological parametere, slik som kjønn, alder, EGFR protein uttrykk, EGFR genamplifikasjon eller EGFR mutasjonsstatus (tabell 1).
MIR-146a nivåer (normalisert til RNU6B) nås ved RT-qPCR i 101 tilfeller av NSCLC kreft vev og 76 tilfeller av ikke-kreft lunge vev (Panel A). MIR-146a uttrykk ble sammenlignet i de sammenkoblede 7 saker. *
P
. 0,05
MIR-146a nivåer nås ved RT-qPCR i etapper I og II vs etapper III og IV (panel A), uten fjernmetastaser og med metastaser (panel B). Kaplan-Meier generelle overlevelseskurver i henhold til Mir-146a nivå i panel C.
Diskusjoner
I dagens arbeidet vi har utforsket rollen MIR-146a i menneskelige NSCLCs. Først vi uavhengig identifisert miRNA-146a som det sterkeste korrelert miRNA med EGFR aktiveringsstatusen og farmakologisk EGFR-inhibering i en skjerm som er involvert en rekke 425 mirnas i en serie av NSCLC cellelinjer og BA /F3-transfektanter med forskjellige EGFR genomisk status (upubliserte data på fil). Dette fikk den pågående etterforskningen for å bekrefte disse funnene og videre undersøke hvilken rolle denne miRNA i NSCLC. Funksjonelt, MIR-146a trykkes cellevekst hemmet cellemigrering, celleinduserte apoptose og hemmet EGFR nedstrøms signalisering i NSCLC-cellelinjer. Videre MIR-146a forbedret hemming av celleproliferasjon forårsaket av medikamenter rettet mot EGFR, inkludert TKI (gefitinib, erlotinib, og afatinib) og et monoklonalt antistoff (cetuximab). Vi har også funnet i kliniske FFPE- prøver som lav uttrykk for MIR-146a ble korrelert med avansert klinisk TNM stadier og fjernmetastaser i NSCLC.
