Abstract
Ondartethet er et stort problem hos pasienter behandlet med immunsuppressive midler. Vi har vist at behandling med kalsineurinhemmere (CNIs) kan indusere aktivering av proto-onkogen Ras, og kan fremme en rask progresjon av human renal kreft ved overekspresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Interessant nok har vi funnet at CNI-indusert VEGF overekspresjon og kreftcelleformering ble inhibert med rapamycin behandling, noe som indikerer potensiell involvering av pattedyr målet for rapamycin (mTOR) vei i denne tumorigen prosessen. Her undersøkte vi hvilken rolle mTOR sti i formidling CNI- og Ras-indusert overekspresjon av VEGF i menneskelige nyrekreftceller (786-0 og Caki-1). Vi fant at knockdown av raptor (ved hjelp av siRNA) signifikant redusert CNI-indusert VEGF promoter aktivitet som observert av promoter-luciferase assay, tyder rollen mTOR complex1 (mTORC1) i CNI-indusert VEGF transkripsjon. Det er kjent at mTOR blir aktivert etter fosforylering av dets negative regulator PRAS40, som er en del av mTORC1. Vi observerte at CNI behandling og aktivering av H-Ras (ved transfeksjon av en aktiv H-Ras-plasmid) betydelig økt fosforylering av PRAS40, og transfeksjon av celler under anvendelse av en dominant-negativ plasmid av Ras, betydelig redusert PRAS40 fosforylering. Protein kinase C (PKC) -ζ og PKC-δ, som er kritiske mellomledd signalmolekyler for CNI-indusert tumorigent vei, dannet kompleks med PRAS40; og vi fant at CNI behandling økte kompleksdannelse mellom PRAS40 og PKC, spesielt (PKC) -ζ. Hemming av PKC aktivitet ved hjelp farmakologiske inhibitor markant redusert H-Ras-indusert fosforylering av PRAS40. Overekspresjon av PRAS40 hos nyrekreftceller signifikant nedregulert CNI- og H-Ras-indusert VEGF transkripsjonen aktivering. Endelig ble det observert at CNI behandlingen økte ekspresjonen av phosho-PRAS40 i nyre tumorvev
in vivo
. Sammen er avgjørende for aktivering av mTOR i CNI-indusert VEGF overekspresjon og nyrekreft progresjon fosforylering av PRAS40
Citation. Basu A, Banerjee P, Contreras AG, Flynn E, Pal S (2011) Calcineurin -hemmerindusert og Ras-mediert Overuttrykte VEGF i nyre kreft celler innebærer mTOR gjennom forskrift av PRAS40. PLoS ONE 6 (8): e23919. doi: 10,1371 /journal.pone.0023919
Redaktør: Sujit Basu, Ohio State University, USA
mottatt: 15 juli 2011; Godkjent: 01.08.2011; Publisert: 23 august 2011
Copyright: © 2011 Basu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av følgende: 1) National Institutes of Health Grant R01 CA131145 (SP); 2) John-Merrill Grant ASN-AST (til S.P.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nye forbedringer i immunsuppressiv behandling har redusert forekomsten av akutt avvisning av allograftene, og økt overlevelse av transplantasjonspasienter [1], [2]. Imidlertid kan disse midlene også bidra til høyere dødelighet på grunn av økt risiko for kreft [3], [4], [5], [6]. Det har blitt fastslått at kreft representerer den nest viktigste dødsårsaken i nyretransplanterte pasienter med normal funksjon av graftet [7]. Det er også blitt vist at transplantasjon miljø kan akselerere tilbakefall eller progresjon av kreft [3]. Dermed terapeutiske mål må utvikles for å hindre kreftutvikling hos pasienter under immunsuppressiv behandling.
De immunsuppressive midler er tenkt å inngå kompromisser immun overvåking mekanisme (r) av tumorceller og /eller forstyrre normal DNA-reparasjon mekanismer [4], [5], [8]. Spesielt kalsineurinhemmere (CNIs) er gode immunsuppressive midler til hemmer allotransplantatavvisning; men de kan fremme veksten av forskjellige tumorer [9], [10], [11], [12]. Den kalsineurinhemmerindusert Komplekset består av tre underenheter, katalytisk A, regulatoriske B, og calmodulin [13]. Den cellulære kalsium aktiverer den katalytiske underenheten til sin funksjon som serin /treonin-fosfataser, noe som resulterer i aktivering av den nukleære faktor på aktiverte T-celler (NFAT) familie av transkripsjonsfaktorer [14]. Den CNI cyklosporin (CsA) binder til cyclophylin, en cytoplasmisk protein, og det resulterende komplekset binder til regulatoriske B-subenheten av kalsineurin og hindrer aktivisering av NFAT [15]. Men bortsett fra inhibering NFAT, den CNIs kan også regulere andre signalmolekyler som spiller viktige roller i tumorvekst [16], [17]. Hojo
et al.
[9] viser at CsA fremmer kreft progresjon og metastase ved direkte cellulær effekt (er) gjennom transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) produksjon, noe som er uavhengig av dens effekt på immun systemet til verten. Koehl
et al.
[18] rapporterte at CsA behandling fremmer utvikling av post-transplantasjon kreft, noe som er svært avhengig av prosessen med tumor angiogenese. Tilsvarende Guba
et al.
[19] har foreslått at CsA behandling kan indusere ekspresjon av angiogene cytokiner.
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en av de mest potente angiogene cytokiner som spiller viktig rolle i tumorvekst [20], [21]. Vi har nylig vist at behandling med CNIs induserer overekspresjon av VEGF, og fremmer en rask progresjon av human renal kreft [22]. CNI-indusert VEGF overekspresjon er regulert både transkripsjonen og post-transcriptional nivå [22], [23]. Vi har også funnet at CNIs kan aktivere proto-onkogene H-Ras i humane renale kreftceller [24]; og vi har vist at CNI-indusert VEGF overekspresjon er mediert gjennom aktivering av proteinkinase C (PKC) -ζ og PKC-δ [22], [23], som er potensielle mål for nedstrøms Ras [25].
i motsetning til CNIs, den mammalian target of rapamycin (mTOR) hemmer rapamycin (RAPA) kan ha en helt motsatt effekt i form av svulst utvikling [10], [19], [26]. De transplanterte pasienter som får RAPA behandling ikke utvikler kreft i samme takt som de får andre immunsuppressive midler som CNIs [27], [28]. Det har vist seg at RAPA behandling kan ha en anti-angiogen effekt [19]. Interessant, har vi nylig vist at RAPA behandling kan hemme CNI-indusert VEGF mRNA stabilitet [23], og CNI-indusert spredning av menneskelige nyrekreftceller [24]. Disse resultatene tyder helt klart en mulig rolle mTOR i CNI-indusert tumorigen veier. Til støtte for disse observasjonene, har det blitt rapportert at Akt-mTOR-reaksjonsveien er nødvendig for CNI-indusert tumorvekst [29]. I tillegg kan både PKC-ζ og PKC-δ aktivere Akt-mTOR vei [30], [31], [32], [33].
mTOR pathway spiller en nøkkelrolle i celle overlevelse , vekst, proteinsyntese, cellemetabolisme, og angiogenese [34], [35]. Endringer i veien regulere mTOR forekommer i mange solide maligniteter, inkludert nyrekreft [36], [37], [38]. mTOR, som er konstitutivt aktivert i mange kreftformer av deregulerte aktivering av onkogener eller tap av tumorsuppressorgener, fungerer som makromolekylære komplekser [39]. Den mTOR complex1 (mTORC1), som inneholder raptor, er RAPA følsom; mens mTOR complex2 (mTORC2), som inneholder rictor, er RAPA ufølsom [34], [39]. Det har nylig blitt fastslått at en prolin-rik Akt substrat på 40 kDa (PRAS40) kan ha en negativ regulere mTOR-aktivitet [40], [41]. Før du setter i fosforylert av Akt, PRAS40 binder seg til raptor og sequesters raptor fra mTORC1; Dette fører til avbrudd av mTORC1 tilsvarende effekten av RAPA [40], [42]. Samspillet mellom PRAS40 med raptor konkurrerer med samspillet mellom raptor med S6K1 og 4E-BP1 [42], [43]. I tillegg er dette samspillet PRAS40 svært spesifikke for mTORC1, som PRAS40 ikke omgås eller forstyrre mTORC2 [34].
I denne studien, viser vi at CNI-indusert og Ras-PKC-mediert VEGF overekspresjon kan kanaliseres gjennom mTORC1 signalveien, og dette er mediert gjennom regulering av PRAS40. Vi viser at CNI behandling og aktivering av H-Ras og PKC kan føre til fosforylering av PRAS40; og overekspresjon av PRAS40 fører til nedregulering av CNI- og Ras-indusert VEGF transkripsjonen aktivering. Resultatene fra vår studie antyder en ny krysstale mellom Ras, PKC og mTOR i å regulere CNI-indusert VEGF overekspresjon.
Resultater
Involvering av mTOR complex1 i kalsineurinhemmerindusert Induced VEGF Overuttrykte i human Nedsatt kreftceller
Vi har nylig vist at behandling med kalsineurinhemmere (CNIs) kan fremme VEGF overekspresjon i menneskelige nyrekreftceller gjennom både transkripsjons og post-transkripsjon forskrifter [22], [23]. Vi har også vist at CNI-indusert VEGF mRNA-stabilitet, og CNI-indusert renal cancer celleproliferasjon blir markert inhibert etter behandling med den mTOR-inhibitor rapamycin (RAPA) [23], [24]. Våre funn tydelig angitt hvilken rolle mTOR i CNI-indusert tumorigen veier. Her vi først undersøkt hvilken rolle mTOR i CNI-indusert VEGF transcriptional aktivering i menneskelige nyrekreftceller (786-0 og Caki-1). Celler ble transfektert med VEGF-promoteren-luciferase plasmid, og deretter behandlet med det CNI cyklosporin (CsA) i fravær eller nærvær av RAPA. Som vist i figur 1A, CsA behandling fremmet VEGF transkripsjonen aktivering i 786-0-celler, og RAPA behandling inhiberte signifikant CsA-indusert VEGF-promoter-aktivitet. Vi fant en lignende resultat (data ikke vist) i Caki-1 celler. Neste, vi også observert at CsA behandling indusert VEGF protein uttrykk som observert av Western blot analyse; og behandling med RAPA betydelig hemmet CsA-indusert VEGF uttrykk (figur 1B).
A, etter 786-0 celler ble transfektert med 2,6-kb VEGF promoter-luciferase konstruksjon (0,5 mikrogram /godt). Etter transfeksjon ble cellene dyrket i 12 timer, og deretter behandlet over natten (12 timer) med ulike kombinasjoner av CsA (5,0 ug /ml) og RAPA (10,0 ng /ml) eller bærer alene (kontroll). Etter 24 timers av transfeksjon, ble cellene høstet, og brette endring i luciferaseaktivitet ble beregnet som de relative luciferase tellinger fra hver gruppe av celler sammenlignet med den til celler behandlet med bærer alene. Dataene gjenspeiler tre uavhengige forsøk.
Columns, etter gjennomsnittet av tredoble målinger av to forskjellige prøver;
feilfelt; Eksporter SD.
B,
786-0 celler ble behandlet med forskjellige kombinasjoner av CsA (5,0 ug /ml) og RAPA (10,0 ng /ml) eller vehikkel alene (kontroll) i 24 time. Hele cellelysater ble fremstilt, og Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av anti-VEGF og anti-β-aktin for å kvantifisere protein ekspresjon av VEGF og β-aktin respektivt. Den søylediagram under Western blot illustrerer den relative ekspresjon av VEGF ved densitometri, karakterisert ved at de signaler som ble standardisert til ekspresjon av internkontrollen β-aktin. Representant for tre uavhengige eksperimenter.
Kolonner,
gjennomsnittlig relativ intensitet av VEGF uttrykk fra tre forskjellige blotter;
barer, etter SD.
C,
786-0 celler ble transfektert med enten raptor siRNA (25 nM) eller kontrollere siRNA. Etter 24 timers av siRNA transfeksjon, ble cellene transfektert med det 2,6-kb VEGF-promoter-luciferase-konstruksjon (0,5 ug /brønn). Etter 12 timers transfeksjon av plasmid ble cellene behandlet over natten (12 timer) med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikkel alene (kontroll). Cellene ble høstet, og brette endring i luciferaseaktivitet ble beregnet som de relative luciferase tellinger fra hver gruppe av celler sammenlignet med den til celler transfektert med kontroll siRNA og behandlet med bærer alene. Dataene viser to uavhengige forsøk.
Columns, etter gjennomsnittet av tredoble målinger av prøver;
feilfelt; Eksporter SD. Knockdown av raptor ble bekreftet ved Western blot analyse etter 48 timers av siRNA transfeksjon (
panel høyre) product: (A-B) *,
p
. 0,01 sammenlignet med kjøretøy-behandlede celler ; **,
p
0,01 sammenlignet med bare CsA-behandlede celler. (C) *,
p
0,01 sammenlignet med kontroll siRNA-transfektert og kjøretøy-behandlede celler; **,
p
0,05 sammenlignet med kontroll siRNA-transfektert og CsA-behandlede celler
Vi neste undersøkt hvilken rolle mTOR complex1 (mTORC1) i CNI-indusert VEGF. transkripsjon. Som omtalt tidligere, er raptor en del av mTORC1 [34], [39]. Her observerte vi at knockdown av raptor hjelp siRNA signifikant nedregulert CNI-indusert VEGF promoter aktivitet (figur 1C). Knockdown of raptor (~70%) ble bekreftet ved Western blot analyse (figur 1C,
høyre panel
). Sammen utgjør disse observasjonene klart tyder på involvering av mTORC1 i CNI-indusert VEGF overekspresjon i nyrekreftceller.
Behandling med CNI, og Aktivering av H-Ras Fremmer Fosforylering av PRAS40
Vi har nylig vist at CNI behandling kan indusere aktivering av H-Ras i nyrekreftceller [24]. I en nylig rapport [44], er det blitt vist at aktivering av Ras kan fremme mTOR signalering. Som diskutert tidligere, PRAS40 virker som en negativ regulator av mTORC1, og inhiberer dets aktivitet for nedstrøms signaleringshendelser [34], [40], [41]. Etter fosforylering, blir PRAS40 disassociated fra raptor av mTORC1, og dermed mTOR blir aktivert. Som vår tidligere forsøk indikerte involvering av raptor i CNI-indusert VEGF transkripsjon, her ønsket vi å vurdere om CNI behandling og aktivering av H-Ras kunne regulere PRAS40 fosforylering. Først sjekkes vi ekspresjonen av fosfo-PRAS40 i normale renale epitelceller (RPTEC), og i 786-0 og Caki-1 nyrekreftceller. Gjennom Western blot analyse, fant vi at uttrykket av fosfor-PRAS40 var markert høyere i 786-0 og Caki-1 celler sammenlignet med RPTEC (figur 2A,
øvre panel
); Det var imidlertid ingen signifikant endring i ekspresjonen av total PRAS40 i disse cellene (figur 2A,
nedre panel
). Denne observasjonen tyder på at mTOR veien er aktiv i nyrekreftceller.
A,
uttrykk for fosfor-PRAS40 og PRAS40 ble målt i helcellelysater av RPTEC, 786-0, og Caki-en med Western blot analyse ved hjelp av anti-fosfor-PRAS40 og anti-PRAS40.
B, etter 786-0 cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner (1,0 og 5,0 ug /ml) av CsA eller med bærer alene (kontroll) i tre timer. Celler ble lysert, og ekspresjon av fosfo-PRAS40 og PRAS40 ble målt ved Western blot-analyse.
C, etter Caki-1 celler ble transfektert med enten økende konsentrasjoner (0,1-1,0 mikrogram /brønn) av H-Ras (12V) eller tom uttrykk vektor (kontroll) for 24-timers. Celler ble lysert, og ekspresjon av fosfo-PRAS40, PRAS40, Ras, og β-aktin i cellelysatene ble målt ved Western blot-analyse.
D,
Caki-1 celler ble transfektert med enten forskjellige konsentrasjoner (0,5 og 1,0 ug /brønn) av den dominerende-negativ Ras (17N) eller tom ekspresjonsvektor (kontroll) i 24 time. Celler ble lysert, og ekspresjon av fosfo-PRAS40, og PRAS40 ble målt ved Western blot-analyse. (A-D) Representant for tre uavhengige eksperimenter med lignende funn.
Vi bestemmes ved effekten av CsA behandling på PRAS40 fosforylering. 786-0 celler ble behandlet med enten økende konsentrasjoner av CsA eller bærer alene; og ekspresjon av fosfo-PRAS40 ble undersøkt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 2B, CsA behandling markert øket ekspresjonsnivået av fosfo-PRAS40 sammenlignet med vehikkel-behandlet kontroll (
øvre panel
); Det var imidlertid ingen signifikant endring i uttrykket av total PRAS40 følgende CsA behandling (
nedre panel
).
Deretter søkte vi å evaluere effekten av H-Ras-aktivering på PRAS40 fosforylering. For dette formål ble Caki-1 celler transfektert med enten økende konsentrasjoner av plasmidet som uttrykker aktivert form av H-Ras, H-Ras (12V), eller den tomme ekspresjonsvektor. Etter transfeksjon, ble ekspresjonen av fosfo-PRAS40 og total PRAS40 målt. Vi har funnet at aktivering av H-Ras betydelig øket nivå av phosho-PRAS40 sammenlignet med vektor-transfektert kontroll (figur 2C,
første panel
); Det var ingen signifikant endring i total PRAS40 følgende H-Ras-aktivering (figur 2C,
andre panel
). Overekspresjon av H-Ras (12V) i disse cellene ble bekreftet ved Western blot-analyse (figur 2C,
tredje panel
).
Til slutt sjekkes vi effekten av inhibering av endogen Ras på PRAS40 fosforylering. De Caki-1 celler ble transfektert enten med dominant-negativ mutant av Ras, ble Ras (17N) eller tom vektor, og ekspresjon av fosfo-PRAS40 målt. Som vist i figur 2D, inhibering av Ras redusert ekspresjon av fosfo-PRAS40 (
øvre panel
); Det var imidlertid ingen signifikant endring i uttrykket av total PRAS40 (
nedre panel
). Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at CNI behandling og aktivering av H-Ras sti i humane nyrekreftceller kan indusere mTOR gjennom økt fosforylering av PRAS40.
PKC Skjemaer Complex med PRAS40, og kan indusere sin Fosforylering
I vår forrige rapport [22], vi har vist at både PKC-ζ og PKC-δ er avgjørende mellomledd signalmolekyler for CNI-induced VEGF transkripsjonen aktivering; og disse PKC isoformer kan tjene som potensielle nedstrøms mål for aktiv Ras [25]. Her søkte vi å finne ut om PKC kunne regulere fosforylering av PRAS40. Først sjekket vi om det var en kompleks formasjon mellom PRAS40 og enten PKC-C, og PKC-S i RPTEC og 786-0 celler i henhold basal tilstand. Ved immunoprecipitation, observerte vi at faktisk både PKC-ζ og PKC-δ kan gjøre kompleks med PRAS40 (figur 3A); imidlertid intensiteten av komplekset var mye sterkere i kreftceller i forhold til normale renale epitelceller. Vi neste undersøkt om CNI behandling kan modulere kompleksdannelse mellom PRAS40 og PKC-ζ og PKC-δ i 786-0 celler. Som vist i figur 3B, ved behandling med CsA markert øket komplekset mellom PRAS40 og PKC-ζ sammenlignet med vehikkel-behandlet kontroll; Men var det ingen signifikant endring (data ikke vist) i komplekset dannelse mellom PRAS40 og PKC-δ.
A, etter Lysates av RPTEC og 786-0 celler ble immunopresipitert med anti- PRAS40.
B,
786-0 cellene ble behandlet med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikkel alene (kontroll) i 2 timer. Cellelysater ble immunoutfelt med anti-PRAS40. (A-B) immunpresipitater (IP) ble tatt av protein A-Sepharose-kuler, kokt i SDS-buffer, og separert ved SDS-PAGE. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av enten anti-PKCζ, eller anti-PKCδ, eller anti-PRAS40.
C,
786-0 cellene ble behandlet med enten økende konsentrasjoner (50-250 nmol /L) av calphostin C eller bæreren alene (kontroll) i tre timer. Celler ble lysert, og ekspresjon av fosfo-PRAS40 og PRAS40 ble målt ved Western blot-analyse.
D,
Caki-1 celler ble forbehandlet med enten calphostin C (100 nmol /L) eller bærer alene; og cellene ble så transfektert med enten H-Ras (12V) (1,0 ug /brønn) eller vektor alene i 24 timer, i fravær eller nærvær av calphostin C. Cellene ble lysert, og ekspresjon av fosfo-PRAS40 og PRAS40 ble målt etter Western blot-analyse. (A-D) Representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende funn.
Deretter testet vi om hemming av PKC ved behandling av farmakologiske inhibitor kunne redusere fosforylering av PRAS40. 786-0 Cellene ble behandlet enten med økende konsentrasjoner av calphostin C eller kjøretøyet alene. Etter behandling, ble ekspresjonen av fosfo-PRAS40 og total PRAS40 målt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 3C, ved behandling med calphostin C markert redusert nivået av phosho-PRAS40 sammenlignet med vehikkel-behandlet kontroll (
øvre panel
); Det var imidlertid ingen signifikant endring i uttrykket av total PRAS40 (
nedre panel
). Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at PKC kan assosiere med PRAS40, og regulere fosforylering. Imidlertid kan det ikke konkluderes hvis det er en direkte kompleksdannelse mellom PKC og PRAS40, og hvorvidt noen andre tilhørende molekyler er involvert i PKC-mediert fosforylering PRAS40.
Inhibering av PKC nedregulerer H-Ras-Induced fosforylering av PRAS40
i våre tidligere forsøk, har vi vist at H-Ras-aktivering kan indusere PRAS40 fosforylering. Her ønsket vi å undersøke om hemming av PKC kunne nedregulerer H-Ras-indusert fosforylering av PRAS40 hos nyrekreftceller. For dette formål ble Caki-1 celler transfektert med enten H-Ras (12V) eller den tomme ekspresjonsvektoren i fravær eller nærvær av PKC-inhibitoren calphostin C. Etter transfeksjon, ekspresjonen av fosfo-PRAS40 og total PRAS40 ble målt. Som vist i figur 3D (
øvre panel
), aktivering av H-Ras indusert fosforylering av PRAS40 sammenlignet med vektor-transfektert kontroll; og inhibering av PKC signifikant nedregulert H-Ras-indusert PRAS40 fosforylering. Det var ingen signifikant endring i ekspresjonen av total PRAS40 følgende H-Ras-aktivering og PKC-inhibering (figur 3D,
nedre panel)
. Disse observasjonene tyder klart på at Ras-PKC veien, noe som er avgjørende for CNI-indusert tumorigen signal hendelser, kan fosforylere PRAS40, og kan dermed aktivere mTOR.
Overuttrykte PRAS40 hemmer CNI- og H-Ras-Induced transcriptional Aktivering av VEGF
Våre tidligere eksperimenter antydet at CNI-indusert og Ras-mediert signalveier kan inaktivere PRAS40 gjennom økt fosforylering. Her har vi først undersøkt om overekspresjon av PRAS40 kunne hemme CNI-indusert overekspresjon av VEGF hos nyrekreftceller. 786-0 celler ble ko-transfektert med VEGF-promoteren-luciferase-konstruksjon og enten PRAS40 overekspresjon plasmid eller den tomme ekspresjonsvektor. Celler ble behandlet med enten CsA eller kjøretøyet alene. Som vist i figur 4A, CsA behandlingen økte VEGF transkripsjonen aktivering sammenlignet med vehikkel-behandlet kontroll; og overekspresjon av PRAS40 redusert CsA-indusert VEGF-promoter-aktivitet betydelig. Overekspresjon av PRAS40 i transfekterte celler ble bekreftet ved Western blot analyse (figur 4A,
nedre panel
).
A, topp,
786-0 celler var co- transfektert med 2,6-kb VEGF promoter-luciferase konstruksjon (0,5 mikrogram /brønn) og enten en PRAS40 overekspresjon plasmid (myc-PRAS40) (0,5 mikrogram /brønn) eller tom vektor. Etter transfeksjon ble cellene dyrket i 12 timer, og deretter behandlet over natten (12 timer) med enten CsA (5,0 ug /ml) eller vehikkel alene (kontroll). Etter CsA-behandling, ble cellene høstet, og brette endring i luciferaseaktivitet ble beregnet som de relative luciferase tellinger fra hver gruppe av celler sammenlignet med den til celler transfektert med tom vektor og behandlet med bærer alene.
A, bunn,
overekspresjon av myc-PRAS40 plasmid i transfekterte celler ble bekreftet ved Western blot analyse ved hjelp av anti-PRAS40; og ekspresjonen av β-actin ble målt som intern kontroll.
B,
Caki-1 celler ble ko-transfektert med det 2,6-kb VEGF-promoter-luciferase-konstruksjon (0,5 ug /brønn), og forskjellige kombinasjoner av H-Ras (12V), myc-PRAS40 og den tomme vektoren (0,5 ug /brønn av hvert plasmid). Etter 24 timers av transfeksjon, ble cellene høstet, og brette endring i luciferaseaktivitet ble beregnet som de relative luciferase tellinger fra hver gruppe av celler sammenlignet med den til celler transfektert med tom vektor. (A-B) Dataene reflekterer tre uavhengige eksperimenter.
Columns, etter gjennomsnittet av tredoble målinger av to forskjellige prøver;
feilfelt; Eksporter SD. I A, *,
p
0,01 sammenlignet med tom vektor-transfektert og kjøretøy-behandlede celler; **,
p
0,01 sammenlignet med tom vektor-transfektert og CsA-behandlede celler. I B, *
p
0,01 sammenlignet med vektor transfekterte celler; **,
p
. 0,01 sammenlignet med vektor- og H-Ras (12V) -transfected celler
Neste, vi bestemt om overekspresjon av PRAS40 kunne hemme H- Ras-indusert VEGF transkripsjon. Caki-1 celler ble ko-transfektert med VEGF-promoteren-luciferase-konstruksjonen og H-Ras (12V) i fravær eller nærvær av PRAS40 overekspresjon plasmidet. Kontrollceller ble transfektert med tom ekspresjonsvektorer. Som vist i figur 4B, aktivering av H-Ras øket VEGF transkripsjonen aktivering sammenlignet med vektor-transfekterte celler; og overekspresjon av PRAS40 signifikant redusert H-Ras-indusert VEGF-promoter-aktivitet. Sammen utgjør disse funnene tyder på at CNI- og Ras-induserte signale hendelser kan fremme VEGF transcriptional aktivering i en mTOR-avhengige veien gjennom regulering av PRAS40.
CNI Behandling Øker Fosforylering av PRAS40 i nyre tumorvev
i Vivo
Vi har nylig vist at i immunodeficient (
nu /nu
) mus, CNI (CsA) behandling betydelig akselerert vekst av menneskelige nyresvulster (786-0) via VEGF-indusert angiogenese, sammenlignet med vehikkelbehandlede kontroller [22]. Vi har imidlertid ikke behandle uttrykket nivået av fosfor-PRAS40 i svulstene. Således, her undersøkte vi status for fosfo-PRAS40 i disse tumorvev fra CsA-behandling, så vel som kontrollmusene. Som vist i figur 5, ble ekspresjonen av fosfo-PRAS40 markert øket (som observert av flekker av mørkerøde flekker) i nyretumor vev oppnådd fra CsA-behandlede mus (
øverst til høyre panel
), sammenlignet med tumor vev fra kjøretøyet behandlede kontrollgruppen (
øverst til venstre panel
). Men det var ingen signifikant endring i uttrykket av total PRAS40 i tumorvev hentet fra CsA behandlede pasienter (
midten til høyre panel
) eller kjøretøy-behandlede gruppen (
midten venstre panel
). Vår
in vivo
data er lik våre
in vitro
funn, og det tyder på at CNI-mediert og VEGF-indusert akselerert vekst av menneskelige nyresvulster kan innebære økt fosforylering av PRAS40, som kan fører til aktivering av mTOR veien
humane renale kreftceller (1,0 x 10
6, 786-0). ble injisert sc i naken (
nu /nu
) mus (
n
= 5 i hver gruppe), og de ble behandlet enten med CsA (10 mg /kg /dag) eller med kjøretøyet som kontroll . Svulster ble høstet på dag 25 etter tumorinjeksjon. Representative mikrofotografier illustrere immunhistokjemisk uttrykk for fosfor-PRAS40 (
toppfeltene
) og PRAS40 (
midterste paneler
) i høstes nyre tumorvev (forstørrelse X400).
Flekker av mørk rød farge, etter uttrykk for phosho-PRAS40, som markert ble økt i tumorvev fra CsA-behandlede mus. H E, hematoxylin og eosin. Representant for tre ulike vevsprøver av både CsA- og kjøretøy-behandlede grupper.
Diskusjoner
Utviklingen samt rask progresjon av kreft er et stort problem hos pasienter som behandles med immunsuppressive midler [3], [4], [5]. Vi har nylig vist at kalsineurinhemmere (CNIs) kan fremme rask progresjon av menneskelig nyrekreft gjennom overekspresjon av VEGF [22], [23]; og H-Ras og PKC kan fungere som kritiske formidler signalmolekyler for CNI-induced VEGF overekspresjon [22], [24]. I denne studien viser vi en ny sti, der CNI-indusert og Ras-PKC-mediert signaler kan innebære mTORC1 gjennom regulering av sin hemmende molekyl PRAS40, og fremme VEGF overekspresjon.
Som omtalt tidligere, CNIs megle deres immundempende funksjon ved å hemme kalsineurin-NFAT vei [15]. Imidlertid kan CNIs også regulere andre signaliseringsmolekyler som er involvert i ekspresjonen av VEGF og andre gener [16], [17]. Vi har nylig vist at CNI behandling kan aktivere H-Ras, og kan også indusere fosforylering av nedstrøms mål, PKC-C, og PKC-S; og fremmer overekspresjon av VEGF i humane renale kreftceller [22], [23]. Chen
et al.
[45] har rapportert at CsA-induced oxidative stress kan opp-regulerer og aktiverer PKC-ζ i virusinfiserte humane B-celler, som kan føre til induksjon av lymfoproliferative sykdommer hos transplantasjonspasienter.
Interessant nok har vi vist at den induserte CNI-VEGF overekspresjon og renal cancer celleproliferasjon hemmes av RAPA behandling, noe som tyder på en mulig rolle av mTOR i CNI-induserte tumorigene veier som involverer Ras-aktivering [23], [ ,,,0],24]. . I støtte til våre observasjoner, Carriere
et al product: [44] har nylig rapportert at mitogen og onkogen aktivering av Ras veien kan indusere mTORC1; Det har også vist seg at den Akt-mTOR-reaksjonsveien er nødvendig for CNI-indusert tumorvekst [29]. I tillegg kan både PKC-ζ og PKC-δ fremme induksjon av Akt-mTOR-reaksjonsveien [30], [31], [32], [33]; og PI-3K /Akt /mTOR-mediert signaler kan kanaliseres gjennom HIF og SP1 [46], [47], to store transkripsjonsfaktorer for VEGF uttrykk [25], [48].
I studien finner vi at raptor, som er en del av mTORC1 er kritisk for CNI-indusert VEGF transkripsjonen aktivering. Vi viser at CNI /Ras-indusert og PKC-mediert overekspresjon av VEGF i menneskelige nyrekreftceller innebærer PRAS40, en negativ regulator av mTORC1 [34], [40], [41]. Den CNI behandling, så vel som aktivering av Ras og PKC fremmer fosforylering av PRAS40, noe som kan føre til induksjon av mTOR-signalreaksjonsveien. Vår studie tyder på rollen som H-Ras i regulering PRAS40 fosforylering; Men vi kan ikke utelukke rollene som to andre Ras isoformer (K-Ras og N-Ras) i denne prosessen. Tidligere viste vi at CNI behandling formidler en rask progresjon av menneskelig nyre tumor gjennom VEGF-indusert angiogenese [22]; her viser vi at uttrykket av fosfor-PRAS40 er markert økt i disse nyre tumorvev følgende CNI behandling. Overekspresjon av PRAS40 betydelig redusert CNI- og Ras-indusert VEGF transkripsjonen aktivering. Dermed vår studie antyder klart at mTOR er en viktig signalmolekyl i CNI-indusert tumorigent sti (er) som kan føre til VEGF overekspresjon av nyrekreft.
