Abstract
Kolesterol innhold kan variere betraktelig mellom normale celler og kreftceller, med forhøyede nivåer i kreftceller. Her, undersøkte vi kolesterol binding med metyl-β-cyklodekstrin (MCD), og pore-formasjon med ostreolysin A /pleurotolysin B (Olya /PlyB) proteinkompleks som bindes til kolesterol /sfingomyelin-rike membrandomener. Vi evaluerte effektene på levedyktighet T24 invasiv og RT4 invasiv menneskelige urothelial kreftceller og normale svin urothelial (NPU) celler. Kolesterolinnholdet sterkt korrelert med kreft transformasjon, som høyest i de T24 høyverdig invasive uroteliale kreftceller, og lavest i NPU celler. MCD behandling indusert fremtredende celledød av T24 celler, mens Olya /PlyB behandling resulterte i sterkt redusert levedyktighet RT4 lavgradige invasiv carcinoma celler. Biokjemiske og transmisjonselektronmikroskopi analyser viste at MCD og Olya /PlyB indusere nekrotisk celledød i disse kreftcellene, mens levedyktighet av NPU cellene ikke ble betydelig påvirket av enten behandling. Vi konkluderer med at MCD er mer giftig for T24 høyverdig invasive uroteliale kreftceller, og Olya /PlyB for RT4 lavgradige invasiv urothelial kreftceller, og verken er giftig for NPU celler. Kolesterol og kolesterol /sphingomyelin rike membrandomener i uroteliale kreftceller utgjør således en selektiv terapeutisk mål for eliminering av uroteliale kreftceller
Citation. Resnik N, Repnik U, Kreft ME, Sepčić K, Macek P, Turk B, et al. (2015) meget selektive anti-kreft aktivitet av kolesterol-veksel Agents metyl-β-syklodekstrin og Ostreolysin A /Pleurotolysin B-proteinkomplekset på urothelial kreftceller. PLoS ONE 10 (9): e0137878. doi: 10,1371 /journal.pone.0137878
Redaktør: Marie-Claude Potier, Institut du Cerveau et de la Moelle, FRANCE
mottatt: 02.12.2014; Godkjent: 24 august 2015; Publisert: 11.09.2015
Copyright: © 2015 Resnik et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av slovenske Forskning Agency (https://www.arrs.gov.si/en/agencija), tilskudd P3-0108, P1-0207, P1- 0140, og J1-4305. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de fleste eukaryote celler, representerer den plasmamembranen kolesterolinnholdet så mye som 90% av total cellekolesterol [1,2]. Kolesterol er en viktig komponent membran, og det påvirker membran struktur og funksjon, inkludert membranfluiditet og membranproteinaktivitet [3,4,5]. Sammen med sphingomyelin, akkumulerer kolesterol i membrandomener som er kjent som membran flåter. De spesifikke lipid og protein komposisjoner av disse kolesterol /sphingomyelin-rik membran domener er innblandet i mange viktige signalveier assosiert med cellevekst, migrasjon og apoptose [6,7].
Kolesterol metabolisme er strengt regulert, for å opprettholde riktig kolesterolinnholdet i friske celler. Klinisk og eksperimentell bevis tyder på at forstyrrelser i kolesterol stoffskiftet kan ha viktige roller i cancerogenesis og tumor utvikling (anmeldt i [8,9]). Slike forstyrrelser er vist i flere maligniteter [10,11,12], og kolesterol metabolitter kan fremme eller undertrykke kreft [13]. Forhøyet kolesterolnivå er observert i ikke-invasiv [10,14,15] og invasive [16] kreftceller, og disse kolesterol øker kan modulere membran-flåten dynamikk og flåte relaterte koordinering av ulike signalveier i kreftceller [17].
kolesterol~~POS=TRUNC innholdet~~POS=HEADCOMP av kreftceller er vanligvis økes ved oppregulering av 3-hydroksy-3-metylglutaryl (HMG) -CoA reduktase, et regulatorisk enzym i kolesterolsyntesen, noe som fører til sammenflyting av membran flåter, og kan stimulerer cancerogenic trasé [18]. Omega-3 flerumettede fettsyrer undertrykke HMG-CoA reduktase og har anticancerogenic egenskaper gjennom induksjon av celle nekrose eller apoptose [19,20]. Andre kjente anticancerogenic lipider som forstyrrer membran-flåten funksjoner gjennom kolesterol homeostase er alkylphospholipids som edelfosine [21]. George Wu og foreslo at betydningen av den membran-flåten sammensetning og integritet for cellenes levedyktighet og proliferasjon er celletype spesifikk, på grunn av finjustering av de signalveier som kan føre til celledød eller celleoverlevelse [22]. Derfor kolesterol-beriket membrandomener er potensielle mål for flåten-forstyrrende agenter, for å påvirke cellevekst og levedyktighet. Cytotoksiske effektene av slike midler kan føre til minst tre former for celledød: apoptose, autophagic celledød, og nekrose [18,23,24]. Kolesterol uttynning med metyl-β-cyklodekstrin (MCD), som sequesters plasmamembranen kolesterol, gjengir melanom celler som er mottakelige for apoptose [25], og vil utløse apoptose i bryst og prostata cancercellelinjer, som har tallrike membranflåtene [18].
i kunstig og biologiske membraner, kolesterol /sphingomyelin rike membrandomener kan merkes med ostreolysin A /pleurotolysin B proteinkompleks (Olya /PlyB) begge veldig selektivt og med høy affinitet [26,27]. Olya og PlyB blir produsert av sopp
Pleurotus ostreatus
, og de montere inn et pore-dannende kompleks hvor hvert av proteinene har en spesiell rolle. Olya tjener som membran-bindende komponent, og det binder seg utelukkende til membrandomener som er anriket i sphingomyelin og steroler [26,27,28,29]. Denne bindingen kan rekruttere PlyB til membranoverflaten, noe som fører til dannelsen av den 13-ganger transmembrane pore, hvorved hver subenhet består av en PlyB molekyl plassert på en membran-bundet dimer Olya [26,30].
samspillet mellom Olya med kolesterol /sphingomyelin membraner er svært samarbeidsvillige med hensyn til membran kolesterol nivåer over en ~ 30 mol% grensen [28]. Når Olya rekrutteres til disse membranene, og dersom konsentrasjonen av Olya /PlyB er høy nok, har PlyB poredannende aktivitet [31]. Forbehandling av celler med enten MCD eller sfingomyelinasen dramatisk opphever bindingen av Olya [27] (og Olya /PlyB [3,32]) til membraner av forskjellige celler.
Så langt vår kunnskap, har det ikke vært noen rapporter om rollen som membran kolesterol som et potensielt mål for behandling av blærekreft. I den foreliggende studien undersøkte vi hvorvidt urotelialceller på ulike stadier av kreft transformasjon, og også ikke-transformerte normale porcint urothelial (NPU) celler, varierer i sine sensitiviteter til kolesterol-veksel midler i henhold til forskjeller i deres kolesterolnivåer. For å verifisere påvirkning av potensialet interspecies variasjon av kolesterolinnhold, målte vi kolesterolinnholdet også i invasive og ikke-invasive mus urothelial cellelinjer. Vi sammenlignet følsomheten til MCD og Olya /PlyB av T24 menneskelige uroteliale kreftceller (som en høyverdig invasiv urothelial karsinom modell), RT4 menneskelige uroteliale kreftceller (som en lavgradig invasiv papillær karsinom modell), og NPU celler, som morfologisk og fysiologisk likne normal menneskelig urothelium [33,34,35]. Vi benyttet den unik mekanisme for Olya /PlyB proteinkomplekset, slik at, på den ene side, effektiv immunolabeling av kolesterol /sfingomyelin-anriket membrandomener [3,32,36], og på den annen side, kontrollert pore-formasjonen i disse domenene [28,29,32]. Vår studie viser at disse T24 og RT4 menneskelig uroteliale kreftcellene har markert større følsomhet for både kolesterol lagring av MCD og pore-formasjon ved Olya /PlyB, sammenlignet med ikke-transformerte NPU celler. Videre disse dataene tilby en ny og svært selektiv tilnærming til behandling av livstruende uroteliale metastatiske celler og de mest hyppige ikke-invasiv blærekreft celler.
Materialer og Metoder
Cellekulturer
Den menneskelige urinblæren T24 og RT4 kreft cellelinjer (ATTC, Manassas, VA, USA) og mus urinblæren, NUC-1 og G /G-celler (en slags gave fra Prof de Boer, Leiden University Medical Center, The Nederland [37]) ble dyrket i avansert Dulbeccos modifiserte Eagles medium (A-DMEM) /F12 (1: 1), 5% føtalt kalveserum (FCS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (kontrollmedium for kreft urotelialceller) ved 37 ° C, i en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
sekundære kulturer av NPU celler fra det femte til tolvte passasjer ble fremstilt som beskrevet tidligere [33,38, 39]. De NPU-celler ble dyrket i MCDB153 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) /A-DMEM (1: 1), 2,5% FCS, 0,1 mM phosphoethanolamine (Sigma), 0,5 ug /ml hydrokortison, 5 ug /ml insulin (Sigma ), 4 mM Glutamax, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (kontroll medium for normale urotelialceller). De kulturmedier og kosttilskudd ble kjøpt fra Invitrogen (Wien, Østerrike), med mindre annet er oppgitt.
metyl-β-syklodekstrin og Olya /PlyB behandlinger
metyl-β-syklodekstrin (MCD) ble oppløst i kontrollmedium (for kreft eller normale urotelialceller) med kolesterol-fri FCS (Thermo Scientific Hyclon, Logan, UT, USA) i stedet for FCS med kolesterol.
En blanding av Olya /PlyB (molar ratio 9 : 1) ble fremstilt fra friske fruktlegemer av
P
.
ostreatus
som beskrevet tidligere [26,40]. Før cellebehandlingen ble Olya /PlyB fortynnet i kolesterol-fri kontrollmedium (for kreft eller normale urotelialceller). For membran-flåten merking, en nonlytic konsentrasjon på Olya /PlyB (2,5 ug /ml) ble påført på urotelialceller i 1 time og 3 timer ved 37 ° C. For studier av cytotoxity ble Olya /PlyB brukt på 30 mikrogram /ml for 1 time og 3 timer ved 37 ° C.
Total celle kolesterolinnholdet
T24, RT4, NUC-1 og g /G-celler ble sådd på 1 x 10
4 celler /cm
2, og NPU celler ved 1 x 10
5 celler /cm
2, og ble dyrket i kontrollmedium til 100% samløpet. De T24, RT4 og NPU-celler ble også behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og 250 ul cellesuspensjoner ble fremstilt. Lipidene ble ekstrahert fra 200 ul av disse cellesuspensjoner, etter fremgangsmåten til Bligh og Dyer [41]. Disse lipid ekstrakter ble tørket med N
2, og lipidene ble oppløst i 50 pl isopropylalkohol. Kvantifisering av fri kolesterol i disse lipidekstrakter var basert på bruken av kolesterol oksydase og koblingen av det hydrogenperoksyd som produseres med 4-hydroksybenzosyre og 4-aminopyridin med peroksidase-reaksjonen. Den quinoniminfargestoff som ble dannet som et resultat av peroksidase ble kvantifisert ved 560 nm (Konelab kolesterol kits, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Total proteinkonsentrasjon ble bestemt fra 50 ul cellesuspensjon aliquoter ved hjelp av Bradford-analyse [42]. Det totale cellekolesterolinnhold er gitt som mikrogram kolesterol /mg celleprotein.
Olya og HMG-CoA-reduktasehemmere immunolabelings og fluorescens intensitet målinger
T24 og RT4 cellene ble dyrket på Dekk og NPU celler på 0,4-um porøse membraner (BD Falcon, Pharmingen, San Diego, CA, USA). For Olya immunomerking, ble celler inkubert med 2,5 ug /ml Olya /PlyB i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og fiksert i 4% formaldehyd (FA) i 10 minutter ved 4 ° C. Etter 30 min for å blokkere med 2% bovint serumalbumin (BSA) ved 37 ° C ble cellene inkubert med kanin polyklonale anti- Olya antistoff (1: 2500) i 1 time ved 37 ° C, deretter vasket med PBS og inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin sekundære antistoffer (1: 600, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) for 30 min ved 37 ° C. For HMG-CoA-reduktase immunomerking ble cellene fiksert i 4% FA i 10 minutter ved 4 ° C, og satt på blokaden av 2% BSA ved 37 ° C i 30 minutter. Deretter ble cellene inkubert med kanin anti-HMG-CoA-reduktase-polyklonale antistoffer (1: 200, Merck Millipore 09-356) i 1 time ved 37 ° C, vasket med PBS og inkubert med Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin-antistoffer for sekundære 30 minutter ved 37 ° C
cellene ble montert i Vectashield inneholder 4,6-diamidino-to-phenylindole. (DAPI, Vector Laboratories, Burlingamme, CA, USA) og analysert under fluorescerende mikroskopi (AxioImager Z1) ved hjelp av en olje-neddykking objektiv (63 x olje /NA 1,40), og med en ApoTome anordning for optisk seksjon generasjon. Bildene ble kjøpt med AxioVision program (Carl Zeiss, Tyskland).
Vi analyserte 13-20 bilder per kultur tilstand og målte gjennomsnitts grønn fluorescens intensitet per synsfelt (AxioVision program). Bildene ble tatt på samme eksponeringstid (469 ms) for hver cellekultur tilstand.
Immunoblotting analyse
Etter MCD behandling ble cellene lysert med 2 mM EDTA, 150 mM NaCl , 100 mM Tris, 1% Triton X-100, 1 mM aprotinin, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, og 1 mM Na
3VO
4, i 30 minutter ved 4 ° C. Like mengder av protein (20 pg) ble løst ved hjelp av SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner, som så ble probet med kanin-anti-LC3 polyklonale antistoffer (1: 1000; MBL, PM036), kanin anti-PARP polyklonale antistoffer (1: 1000; Roche Life Science, 11835238001), og kanin anti-p-aktin polyklonale antistoffer (1: 1000, Sigma, A2066). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin polyklonale sekundære antistoffer (1: 1000, Sigma) ble oppdaget ved hjelp av den forbedrede chemiluminescence teknikk (Pierce ECL Western blotting substrat, Thermo Scientific)
Måling av caspase aktivitet
kaspase-aktivitet ble bestemt ved å måle spaltning av acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (Ac-DEVD-AFC; Bachem, Bubendorf, Sveits) i behandlede (kontroll) og MCD -behandlet T24, RT4, og NPU-celler som tidligere beskrevet [43]. For den positive kontroll av kaspase-aktivering, ble RT4 cellene utsettes for UV-bestråling i 30 sek for å indusere apoptose, og deretter inkubert i ytterligere 6 timer. Den DEVD-ase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Safire; Tecan, Mannedorf, Sveits). De første tallene for reaksjonene ble beregnet og er presentert som relative fluorescerende enheter per sekund (RFU /s).
flowcytometri
De behandlede og ubehandlede uroteliale celler ble dyrket i 24-brønners plater (1 × 10
5 celler /brønn) og dyrket til konfluens for MCD og Olya /PlyB behandlinger. De høstede celler ble inkubert med annexin V-PE-reagens (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, USA) og med 0,2 ug /ml propidiumjodid (PI; Sigma) .De celler ble analysert for annexin V-PE og PI fluorescens med en FACSCalibur flowcytometer og Cellquest programvare (både Becton Dickinson San Jose, CA, USA). Vi diskriminert fraksjonene av levedyktige (annexin V negative og PI negative), tidlig apoptotisk (annexin V positiv, PI negative), og døde (PI positive) celle populasjoner. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, med hver utført i duplikat.
Transmisjonselektronmikros
celler behandlet med MCD og Olya /PlyB og ubehandlede celler ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd i kakodylatbuffer i 3 timer ved 4 ° C. Etter vasking ble cellene inkubert med 1% OsO
4 og 3% K
4Fe (CN)
6, fremstilt i kakodylatbuffer, i 1 time ved romtemperatur. Deretter 0,3% thiocarbohydrozide i kakodylat-buffer ble tilsatt i 5 minutter ved romtemperatur. Etter vasking, ble 1% OsO
4 tilsatt i 20 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter dehydrert og innstøpt i Epon (Serva, Heidelberg, Tyskland). Ultratynne snitt ble farget med uranylacetat og bly citrate (begge fra Merck, Darmstadt, Tyskland). Disse avsnittene ble undersøkt under transmisjons-elektronmikroskopi (TEM) ved hjelp av en Phillips-CM100 elektronmikroskop.
statistikker og
Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil av to eller tre uavhengige eksperimenter som hver ble utført i kopiere eller tre eksemplarer, og ble evaluert ved bruk av Studentenes t-tester, og enveis ANOVA eller Kruskal-Wallis en enveis variansanalyse. Hvor parvise multiple sammenligninger var nødvendig, ble Holm-Sidak metoden eller Dunn metode brukes (Sigma Plot programvare, Systat Software Inc, CA, USA). P-verdier 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Pearsons korrelasjonskoeffisient mellom kolesterolinnholdet og HMG-CoA reduktase protein uttrykk ble beregnet (Microsoft Office Excel).
Resultater
Kolesterol innholdet er høyere i invasive uroteliale kreftceller sammenlignet med ikke-invasive urotelialceller av mennesker og mus opprinnelse
for de menneskelige urotelialceller, analyse av kolesterolinnholdet avslørte de høyeste nivåene i T24 invasive urothelial kreftceller, som var signifikant lavere i RT4 invasiv uroteliale kreftceller, og lavest i NPU celler ( 28,0 ± 0,51, 22,9 ± 1,3, 16,6 ± 1,9 ug kolesterol /mg celleprotein, henholdsvis, fig 1A). Det var en positiv korrelasjon mellom kolesterolinnhold og HMG CoA-reduktase-proteinekspresjon, beregnet som Pearsons korrelasjonskoeffisient r = 0,945 blir målt fra den midlere intensitet av den immunfluorescens (figur 1B). Dette immunfluorescens var den høyeste i T24 celler og lavest i NPU celler.
A. Kvantifisering av kolesterolinnholdet i invasiv T24 human og NUC-1-museceller, i noninvasive RT4 human og g /g museceller, og i NPU-celler. B. Representative optiske deler av HMG-CoA reduktase immunolabeling (grønn) i T24, RT4 og NPU celler. DAPI nukleær farging er også sett (blå). Scale barer 20 mikrometer. C. Kvantifisering av den midlere intensitet av HMG-CoA immunfluorescens av T24, RT4 humane celler og NPU-celler, som illustrert i (B). A, C. Dataene er gjennomsnitt ± standardfeil av tre uavhengige eksperimenter. NS, ikke signifikant; * P 0,05, ** p. 0,005
Som disse transformerte NPU cellene er av svin opprinnelse, for å vurdere eventuelle artsforskjeller i kolesterolinnholdet, analyserte vi kolesterolinnholdet i invasiv og ikke-invasiv urothelial celler av mus opprinnelse. Her testet vi NUC-1 og g /G urotelialceller, som gjenspeiler de forskjellige faser i urothelial cancerogenesis hos mus [37]. NUC-1-celler er tumorigen og invasive, og som sådan, gir de et nært forhold til T24 humane celler, og g /G mus urotelialceller er ikke-invasiv, og er således sammenlignbare med RT4 humane celler. Kolesterolinnholdet i de invasive NUC-1-celler var signifikant høyere enn i den ikke-invasive g /G-celler (26,3 ± 1,5, 21,8 ± 1,4 ug kolesterol /mg celleprotein, henholdsvis; Fig 1A). På den annen side, kolesterolinnholdet av T24 humane og NUC-1 mus invasive urotelialceller ikke signifikant forskjellig, som også sett for kolesterolinnholdet i RT4 human og g /G mus noninvasive urotelialceller. Disse data indikerer at innholdet av kolesterol har en omvendt korrelasjon med graden av urothelial kreft transformasjon (figur 1A).
MCD induserer tidsavhengig og doseavhengig død av kreftceller urothelial
effekten av MCD-behandling på cellelevedyktighet ble undersøkt ved anvendelse av annexin V og PI farging i kombinasjon med flowcytometri analyse. De representative dot plots i figur 2A viser T24, RT4 og NPU celleprøver ble behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og dette ledsages av kvantifisering av virkningen ved forskjellige konsentrasjoner av MCD (3, 5, 7 mM) anvendt for å øke inkubasjon tider (1, 3, 6 timer). Ved 3 mM MCD, ingen eller bare mindre virkninger på de viabilities ble observert i alle tre celletyper, uavhengig av inkubasjonstiden (figur 2A).
A. Venstre: Representative dot plots fra flowcytometri analyse av T24, RT4 og NPU-celler dyrket i kontrollmedia og etter 7 mM MCD behandling i 6 timer. Annexin V-PE og PI ble brukt til å diskriminere mellom levedyktig (dobbel negativ), tidlig apoptotiske (single annexin V positiv) og døde (PI positive) celler. Høyre: Kvantifisering av cellelevedyktighet fra flowcytometri analyse av T24, RT4 og NPU-celler etter tre mM, 5 mM, og 7 mM MCD behandlinger for 1 time, 3 timer og 6 timer. B. Kvantifisering av celle kolesterol uttømming i T24, RT4 og NPU celler etter 7 mM MCD behandling i 6 timer. Dataene er midler ± standardfeil av dupliserte målinger fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001
I T24 celler, som var den mest følsomme for MCD av disse tre celletyper, celleviabilitet var. betydelig redusert etter 5 mM, og 7 mM MCD behandling i 3 timer, til 92% og 89%, respektivt. Seks timer etter behandlingen levedyktighet ble ytterligere redusert til 77% ved 5 mM MCD og til bare 47% ved 7 mM MCD (figur 2A). I RT4 celler, det eneste betydelige reduksjon i levedyktigheten over et område av MCD-konsentrasjoner og inkubasjonstidene var etter 6 timer med 7 mM MCD (til 82%, fig 2A). En enda mindre effekt ble observert for NPU celler, hvor bare ved behandling med 7 mM MCD i 6 timer viste en mindre reduksjon i celleviabilitet (til 92%, figur 2A). Sammenlignet med T24 og RT4 celler, effekten av seks-timers behandling med 7 mM MCD på cellelevedyktigheten var statistisk lavere i NPU celler (figur 2A). I tillegg, kan vi observere at døende, PI-positive celler ble annexin V negativt eller positivt, mens en populasjon av enkelt annexin V-positive celler var aldri fremtredende, noe som tyder på at celledød er nekrotisk snarere enn apoptotisk (figur 2A).
Interessant, etter 7 mM MCD behandling i 6 timer, det totale kolesterolinnhold av T24, RT4, og NPU-celler ble redusert i forhold til de respektive ubehandlede celler, med 86%, 57% og 29%, henholdsvis ( figur 2B).
analysen av cellelevedyktighet viste således at graden av cytotoksisitet av MCD øket med konsentrasjonen og varigheten av behandlingen. For ytterligere å definere disse forskjellige følsomhet for MCD behandling av disse tre typer av urotelialceller, ble cellemorfologi analysert etter 7 mM MCD behandling, hvor en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet ble sett. T24 celler behandlet med 7 mM MCD i 3 timer, og RT4 celler behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, ble avrundet og ble svakt festet (figur 3). T24 cellene løsnet etter 7 mM MCD behandling i 6 timer (fig 3). Omfanget av celle avrunding ble størst i T24 celler, og mindre uttalt i RT4 og NPU celler, hvor bare mindre morfologiske effekter ble observert. Disse dataene korrelerer godt med celledødsanalyser.
T24, RT4 og NPU-celler (som angitt) var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 7 mM MCD i 3 timer og 6 timer, og deretter undersøkt under et invertert mikroskop. Cell avrunding var celletype avhengig (T24 RT4 NPU) og tidsavhengig (kontroll 3 h 6 timer). T24 og RT4 cellene forandret form fra flat og polygonal (kontroll) til sfæriske (T24-celler, tre timer, seks timer behandling, RT4 celler, 6H behandling, pilhoder). Målestokk, 20 um.
I alle tilfeller, med PI-positiv farging indikerer at cellelevedyktigheten ble redusert på grunn av nekrose, ultrastructural analyse av TEM gitt ytterligere bevis på nekrotisk celledød (Fig 4) . Plasmamembraner T24 og RT4 celler etter 7 mM MCD behandling i 6 timer ble sprengt og cytoplasma ble lansert, selv om kjernefysisk konvolutt forble intakt (fig 4). Imidlertid NPU-celler viste ingen kjennetegn ved nekrose etter denne MCD behandling (fig 4).
T24, RT4 og NPU-celler var ubehandlet (kontroll) eller behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og deretter bearbeidet for TEM . Nekrotiske endringer ble sett i enkelt T24 celler (stjerne) og RT4 celler, inkludert plasma-membran avbrudd (pilspisser) og frigjøring av celleinnhold. NPU cellene forble intakt etter denne MCD behandling, med glycocalyx fortsatt til stede (åpne pilspisser). n, kjernen. Skala barer, en mikrometer.
For mer spesifikt undersøke involvering av apoptose etter MCD behandling, ble aktivering av kaspaser analysert. Ved å overvåke spaltning av det fluorogene Ac-DEVD-AFC substrat ingen signifikant kaspase-aktivering ble observert etter 6 timers inkubering med 3 mM, 5 mM eller 7 mM MCD enten i T24, RT4 eller NPU celler. (Fig 5A). Vi var også ute av stand til å detektere caspaseaktivering i celler inkubert med 5 og 7 mM MCD i 6 timer ved immunblotting av PARP-P85-fragment (figur 5B), som er fremstilt ved hjelp av aktiverte caspaser [44]. Til sammenligning, UV-stråling som skyldes spaltning av både DEVD peptidet og PARP-proteinet i T24 og RT4 celler. Mangelen på kaspase-aktivering kombinert med fravær av annexin V signal og ultra forandringer som er karakteristiske for nekrose kollektivt antydet at MCD behandling av urotelialceller utløst nekrotisk stedet for apoptotisk celledød.
T24, RT4 og NPU-celler ble behandlet med 3 mM (A), 5 mM (A) eller 7 mM (AC) MCD i 6 timer. A. caspase aktivitetsmålinger av Ac-DEVD-AFC cleavage viste ingen økning i caspase aktivitet. De positive kontroller (UV 30s) viste apoptose-relatert caspase aktiviteter indusert i T24 og RT4 celler på 6 timer. B. Immunoblotting analyse viste ingen spaltning av full-lengde PARP (120 kDa) inn i et 85-kDa-fragmentet. C. Immunoblotting analyse viste ingen omdannelse av LC3-I (18 kDa) til LC3-II (16 kDa). Aktin ble anvendt som kontroll lasting. Dataene er midler ± standard feil av tredoble målinger.
Western blotting av T24, RT4 og NPU celler etter behandling med 7 mm MCD for 6 timer viste ingen konvertering av LC3-I til LC3-II (fig 5C). Dette indikerte at MCD ikke indusere autofagi. Videre observasjon av T24, RT4 og NPU celler ved TEM avdekket ingen typiske autophagic strukturer, slik som dobbel-membran vesikler eller autophagosomes (fig 4).
Olya /PlyB-behandling induserer nekrose av uroteliale kreftceller
Olya /PlyB ble brukt for to forskjellige programmer. En nonlytic konsentrasjon på Olya /PlyB (2,5 ug /ml) ble anvendt for å merke kolesterol /sfingomyelin-rike domener av plasmamembraner (figur 6C), og en lytisk konsentrasjon (30 ug /ml) ble påført på permeabilize plasmamembraner. Den mest fremtredende Olya immunolabeling (antistoffer ble reist mot Olya henholdsvis) ble sett for RT4 celler og avslørt av kvantifisering av Olya fluorescens (figur 6C). Dette Olya merking var mer ensartet over plasmamembranen i RT4 celler. I motsetning til dette Olya fordeling i T24-celler var mindre selv, og dens fordeling var diskontinuerlig. Merking av NPU celler viste færre Olya-positive celler som vesentlig avviker fra T24 og RT4 celler (figur 6C).
A. Representative fordeling av PI farging av T24, RT4 og NPU-celler behandlet med 30 ug /ml Oly /PlyB i 1 time. Åpne histogrammet representerer ubehandlede celler, mens fylte histogrammer betegne Olya /PlyB-behandlede celler. Prosenter av levende og døde celler vises på venstre og høyre del av histogrammene, henholdsvis. B. Levedyktighet av T24, RT4 og NPU celler etter 1-h og 3-H-behandling med 30 ug /ml Olya /PlyB, som bestemt ved strømningscytometri-analyse. Dataene er middel ± SE av dupliserte målinger fra to uavhengige forsøk. C. Immunolabeling av kolesterol /sphingomyelin rik membran domener i urotelialceller med Olya. Den innfelt bilde av optiske seksjoner gjennom hele celler representerer omfanget og fordelingen av Olya immunolabeled kolesterol /sphingomyelin rik membran domener i T24, RT4 og NPU celler. Green, Olya-merking; blå, DAPI farging av atomkjerner. Skala barer, 20 mikrometer. C. Kvantifisering av Olya immunolabeling presenteres som gjennomsnittlig fluorescens intensitet per synsfelt (i vilkårlige enheter, A.U.). * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001
Celleviabilitet etter en-h og 3-h behandlinger med 30 mikrogram /ml Olya /PlyB var. analysert ved hjelp av strømningscytometri. Celle viabilities etter 30 ug /ml Olya /PlyB behandlinger for 1 time og 3 timer ble bestemt som ovenfor, ved strømningscytometri-analyse. Som annexin-V-merking var negative i alle cellene, ble fraksjoner av PI-positiv (dvs. død) og PI-negative celler bestemt som indikert av de representative histogrammer som er vist i fig 6A. Etter at 30 mikrogram /ml Olya /PlyB behandling i 1 time, ble cellelevedyktigheten av T24 cellene betydelig redusert til 75% (p 0,005), og etter 3-h, til 65% (p 0,001). Tilsvarende cellelevedyktighet RT4 celler ble redusert til 58% (p 0,001) etter 1 time, selv om dette ikke endres ytterligere for den 3-timers behandling. I motsetning til dette, ble cellelevedyktigheten av NPU cellene ikke vesentlig påvirket av 30 ug /ml Olya /PlyB behandlinger for enten 1 time eller 3 timer (figur 6B). I alle disse tre celletyper som ble testet, forskjellene i celle viabilities mellom 30 mikrogram /ml Olya /PlyB behandlinger for 1 time og 3 timer nådde ikke signifikans. Resultatene av immunolabeling av kolesterol /sfingomyelin rik membrandomener med Olya var i samsvar med analyse av cellenes levedyktighet.
Nekrotisk celledød av T24 og RT4 celler etter 30 ug /ml Olya /PlyB behandling i 1 time var indikert med PI-positive celler (figur 6A) og deres karakteristiske ultra endringer (figur 7). For disse cellene, ble de mest fremtredende endringene ses som økte plasma-membran permeabilitet og lekkasje av cytoplasma, sammen med organ hevelse (Fig 7). Den ultra av NPU-celler ble ikke påvirket av 30 ug /ml Olya /PlyB behandling i 1 time, med disse kontroll og behandlede celler og med samme morfologi og med intakt plasmamembranen (figur 7).
T24, RT4 og NPU-celler ble behandlet med 30 ug /ml Olya /PlyB i 1 time og deretter behandlet for TEM. RT4 og T24 celler viser tap av membranintegritet (pilspisser), frigjøring av cytoplasma, og organ hevelse (stjerner), som indikerer celle nekrose. Den ultra av behandlede NPU celler likner på ubehandlede NPU celler, med rikelig glycocalyx (åpne pilspisser). n, kjernen. Skala barer, en mikrometer.
Diskusjoner
Blærekreft er den fjerde vanligste kreftdiagnose hos menn [45]. Men på grunn av den høye tilbakefall og behovet for løpende invasiv monitorering, det har de høyeste levetid behandlingskostnadene per pasient av alle kreft [46]. Faktisk opptil 70% av pasientene har lokale tilbakefall etter intravesikal kjemoterapi eller immunterapi [47]. Det er sannsynlig at den lave herdehastighet er på grunn av mikrometa sykdom som kan induseres ved transuretral reseksjon eller cystektomi, hvilket resulterer i tilbakefall av urothelial tumorer eller metastaser i lymfeknuter, ben, lunger, hud og lever [48]. Videre er dødeligheten hovedsakelig forårsaket av invasive, metastatisk uroteliale karsinom som blir resistent mot kjemoterapi.
