Abstract
Caveolin-1 er kjent for å fremme cellemigrasjon, og økt caveolin-1 uttrykk er knyttet til tumorprogresjon og metastasering. I fibroblaster, caveolin-en polarisering og fosforylering av tyrosin-14 er viktig for å fremme migrasjon. Men fortsatt rollen som caveolin-en i migrasjon av metastatiske celler dårlig definert. Her ble caveolin-en deltakelse i metastatisk celle migrasjon evaluert av shRNA målretting av endogen caveolin-1 i MDA-MB-231 humane brystkreftceller og ektopisk uttrykk i B16-F10 mus melanomceller. Uttømming av caveolin-1 i MDA-MB-231-celler reduseres, mens ekspresjon i B16-F10 celler fremmes overføringen, polarisering og fokal adhesjon omsetning i en sekvens av hendelser som er involvert fosforylering av tyrosin-14 og Rac-1-aktivering. I B16-F10 celler ekspresjon av et ikke-phosphorylatable tyrosin-14 til fenylalanin-mutanten ikke klarte å rekapitulere effektene observert med villtype caveolin-1. Alternativt kan behandling av MDA-MB-231-celler med Src-familie kinase inhibitor PP2 redusert caveolin-en fosforylering av tyrosin-14 og cellemigrasjon. Overraskende, i motsetning til for fibroblaster, caveolin-en polarisering og re-lokalisering til bakkanten ble ikke observert i migrere metastatiske celler. Dermed uttrykk og fosforylering, men ikke polarisering av caveolin-en fordel svært mobile fenotype av metastatiske celler
Citation. Urra H, Torres VA, Ortiz RJ, Lobos L, Díaz MI, Díaz N et al . (2012) Caveolin-en-Enhanced motilitet og Focal Heft Omsetningen Krev Tyrosin-14, men ikke Opphopning til Bakre i metastatisk kreft celler. PLoS ONE 7 (4): e33085. doi: 10,1371 /journal.pone.0033085
Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada
mottatt: 07.04.2011; Godkjent: 09.02.2012; Publisert: 10 april 2012
Copyright: © 2012 Urra et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Fondo de Financiamiento de Centros de Excelencia en INVESTIGACION # 15010006 (til AQ), Fond for vitenskapelig og teknologisk utvikling (FONDECYT) # 1110149 (til L. Leyton), FONDECYT # 1090071 (til AQ), Biomedical Neuroscience Institute P09 -015-F fra Iniciativas Científicas Milenio (til L. Leyton og SH), Fogarty International Research Collaboration Award-National Institutes of Health 5R03TW007810 (til L. Leyton), National Commission for Science and Technology (CONICYT) # 79090021 «Innsetting av Young postdoktor forskere i Academy «(VT), FONDECYT Initiation # 11100287 (VT) og CONICYT Stipendiater (til HU, ND, RO, MID og L. Lobos). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell migrasjon er viktig i et stort utvalg av biologiske prosesser, inkludert embryoutvikling, vev reparasjon og regenerering, samt hendelser assosiert med sykdommer som leddgikt, åreforkalkning og tumorcelle metastase [1]. I utgangspunktet cellene reagerer på ytre signaler (såret, kjemokiner og vekstfaktorer) ved reorientering av microtubule organiserende senter (MTOC) og Golgi mot forkanten (celle polarisering trinn) [2]. Deretter celler utvide bred (
lamellipodia
) og spike-lignende fremspring (
filopodia
) i en prosess som er etterfulgt av fokal adhesjon (FA) formasjon, cellekroppen sammentrekning og endelig tilbaketrekking av bakre ende av kappe fettsyrer [3]. Mange av disse hendelsene er organisert av Rho familien av små GTPases, som inkluderer RhoA, Rac1 og Cdc42. Signaler som aktiverer Rho GTPases føre til spatiotemporal regulering av FA montering, dynamikk og omsetning [4], [5].
Mange proteiner inkludert PI3K, PTEN [6], Rho-GTPases [4], [7] og caveolin-1 [8], [9], har vist seg å re-distribuere gjennom cellen under polarisert migrering. Caveolin-1 er av spesiell interesse, siden det er kjent for å fremme cellemigrering [10], invasjon [11], [12], [13], og er foreslått å være involvert i tumorcellemetastase (oversikt i [14], [ ,,,0],15]).
Caveolin-en er en integrert membran protein som er involvert i caveolae biogenesis, kolesterol homeostase, intracellulær trafficking og signaloverføring, blant andre funksjoner (anmeldt i [15]). Den nøyaktige rollen til caveolin-1 i tumorgenese fortsatt et spørsmål om intens debatt og hvorvidt proteinet virker som en tumor suppressor eller som en formidler av metastasering synes å være celletype og kontekstavhengige [14], [15]. Derfor, i kreft modeller, inkludert prostata, bryst og tykktarm, er caveolin-1 uttrykk kjent for å være oppregulert og proteinnivåer korrelerer med tumorprogresjon og metastase [15]. I overensstemmelse med en rolle i metastase, caveolin-1 ble rapportert å forbedre cellemigrering og invasivitet [11], [12], [16], [17]. Imidlertid er rollen til caveolin-en i løpet av cellemigrering er hovedsakelig kjennetegnet ved ikke-metastatiske celler. For eksempel, i mus embryonale fibroblaster (MEFs), caveolin-1-promo cellemotilitet involvert celle polarisering og økt hastighet og utholdenhet for cellevandring [18]. I tillegg caveolin-en synker Rac1 og Cdc42, men øker RhoA aktivitet ved å hemme Src /p190RhoGAP signalveien [10], [18]. Intriguingly, caveolin-1 i seg selv samler seg på baksiden av migrere fibroblaster, neuroner og endotelceller i 2D modeller [19], [20], [21], men i transmigrating endotelceller og nevroner, caveolin-1 fortrinnsvis akkumuleres i cellen fram [20], [22]. Caveolin-1-avhengig cellemigrasjon og akkumulering på baksiden av MEFs krever aminosyresekvensen 1-60, som omfatter en antatt N-terminal caveolin-en polarisasjon domene [21], [23].
Caveolin- 1 stabiliserer fokal adhesjonskinase (FAK) ved fettsyrer ved å redusere skyt mellom fettsyrer og cytosoliske bassenger, som vist ved fluorescens restitusjon etter fotoblekende analyse av den mobile fraksjon. Siden FAK, og mer spesifikt fosfo-Y397-FAK, er kjent for å forbedre FA omsetning, ble caveolin-1 foreslått å delta i reguleringen av denne prosessen [24]. Faktisk påfølgende studier viste at caveolin-1-avhengig stabilisering av FAK, cellemigrering og invasjon involvert Src /Rho /ROCK akse samt fosforylering av caveolin-1 på tyrosin-14 [11]. Snarere intrigere, caveolin-en ble også vist å øke stabiliteten av begynnende fettsyrer (eller fokale kontakter) og RhoA aktivering [18].
Interessant, Src kinase-mediert fosforylering av caveolin-en på tyrosin-14 vises å være avgjørende for caveolin-1-drevet celle migrasjon. I metastatisk brystkreft celler (MDA-MB-231), er caveolin-1 høyt uttrykt og fosforylert på tyrosin-14, sammenlignet med ikke-metastatiske kreftceller [11]. Selv om innledende studier antydet en antatt rolle for caveolin-en fosforylering på tyrosin-14, forblir kontroversielle spørsmål angående nøyaktig involvering av fosfor-caveolin-en i vedheft komplekser med den ekstracellulære matrise [25]. Viktigst er imidlertid rollen caveolin-en i migrasjon av metastatiske celler krever videre undersøkelser for å forstå hvordan dette proteinet kan bidra til prosesser som metastaser.
I denne studien har vi spesielt undersøkt hvilken rolle caveolin -1 i metastatisk cellemigrasjon ved å anvende to forskjellige modeller: MDA-MB-231 humane brystcancerceller og musemelanomcellelinje B16-F10. I begge cellelinjene, caveolin-en promo celle migrasjon ved å øke FA omsetning, polarisering, hastighet, utholdenhet og retningen. Disse funksjoner av caveolin-1 er alle blokkert ved å interferere med fosforylering av tyrosin-14, som vist ved farmakologisk hemning og mutasjonsanalyse. Forbløffende nok i begge metastatisk cellemodeller, caveolin-en lokalisering til cellen bak var ikke nødvendig å fremme migrasjon.
Resultater
Caveolin-en akkumulerer i bakkant av Migrating MEF-3T3 og DI-TNC1 Cells, men ikke metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10 Cells
Tidligere studier har vist at caveolin-en akkumulerer på baksiden av trekkende celler inkludert MEFs, HUVECs og nerveceller [19], [ ,,,0],20], [21]. Vi søkte å utvide disse observasjonene til raskt å migrere metastatiske celler, ved å vurdere lokalisering av caveolin-en i en sårhelende analyse etterfulgt av immunfluorescens analyse. Den humane brystkreftcellelinjen MDA-MB-231 og DI-TNC1, samt MEF-3T3-celler, alle uttrykte høye nivåer av endogene caveolin-1 (figur 1A). Uventet, caveolin-1 mislyktes i å samle seg på baksiden av MDA-MB-231-celler under trekket inn i såret område (figur 1B). I overensstemmelse med tidligere rapporter [8], [9], polarisering av caveolin-1 ble detektert i MEF-3T3 fibroblast celler, så vel som i astrocytic DI-TNC1 celler (figur 1B). For å vurdere omfanget av caveolin-en polarisering, ble fluorescensstyrkene på baksiden og forsiden kvantifisert innenfor diskrete soner med
Bilde J
programvare og /bak forholdstall ble beregnet ved ulike tidspunkt av migrasjon, som tidligere beskrevet [21], [23]. For både MEF-3T3 og DI-TNC1, men ikke MDA-MB-231-celler, ble tidsavhengige økninger i caveolin-en polarisasjon detekteres, hvorved opphopning på baksiden var nesten fullstendig etter 360 minutter ved migrasjon (figur 1C). Mangel på caveolin-en polarisering i MDA-MB-231 celler kan ikke tilskrives høye endogene uttrykk nivåer i disse cellene, siden, etter shRNA-mediert nedregulering av caveolin-1, rest caveolin-en klarte å polarisere i disse cellene ved migrasjon (se teksten nedenfor, Fig 2A, 2B og 2C).
(A) Totalt proteinekstrakter fra DI-TNC1, MEF-3T3 og MDA-MB-231-celler ble separert ved SDS-PAGE (35 pg totalt protein pr kjørefelt) og analysert ved Western blotting med antistoffer mot caveolin-1 og β-aktin. (B) Flytende monolag av DI-TNC1, MEF-3T3 og MDA-MB-231 celler ble såret med en pipette tips og satt til 0 (venstre panel) og 60 minutter (panel høyre) etter mono skade. Celler ble farget med et kanin polyklonalt anti-caveolin-1-antistoff, etterfulgt av et anti-kanin-IgG-antistoff (grønn) og kjerner ble visualisert med DAPI (blå). Det første lag av celler som vender mot såret område skiller seg fra resten av en hvit linje. Scale bar, 20 mikrometer. (C) Caveolin-en fordeling ble evaluert ved å måle fluorescens intensitet i fire tilfeldig valgte regioner av samme dimensjon foran og bak på cellen med
Bilde J
programvare, som beskrevet i Materialer og metoder . Data representerer forholdet mellom fluorescensintensiteten «/bak» (gjennomsnitt ± SEM; n = 3). Statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med tiden 0 minutter for hver celletype er angitt (**, P 0,01; *, P 0,05). (D) B16-F10 celler transfektert med enten pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-1 (cav1) ble behandlet eller ikke med 1 mM IPTG i 24 timer og totalt proteinekstrakter ble fremstilt, separert ved SDS-PAGE (35 ug totalprotein per bane) og analysert ved Western blotting. (E) Sammenflytende monolag av pLacIOP-caveolin-1 transfekterte B16-F10 celler i fravær eller nærvær av 1 mM IPTG ble såret med en pipettespiss og fiksert enten på 0 eller 60 minutter etter såret. Prøvene ble farget med anti-caveolin-1 polyklonalt antistoff (grønn) og DAPI (blå). Kanten av såret er skissert med en hvit linje. Scale bar, 20 mikrometer. (F) Caveolin-en lokalisering ble analysert ved ulike tidspunkt, slik det er beskrevet i C. Dataene er middelverdien ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
For å utvide våre funn i MDA-MB-231 celler , caveolin-en polarisasjon ble også evaluert i mus melanoma B16-F10 celler. Disse celler uttrykker lave endogene nivåer og derfor caveolin-en ble innført ved stabilt å transfektere celler med placIOP plasmid inneholdende et innskudd som koder for full-lengde protein. En fordel ved dette plasmid er at den tillater IPTG-induserbar ekspresjon [26]. Som vist, transfeksjon med pLacIOP-caveolin-en (
cav1 tilstand
) førte til en fem-dobling i caveolin-1-nivå sammenlignet med celler transfektert med tom vektor pLacIOP (
mock tilstand
, figur 1D). Expression ble ytterligere økt med 1 mM IPTG av en annen 5-ganger sammenlignet med ikke-induserte celler (figur 1D). Således ble caveolin-en lokalisering evaluert i både indusert (høy ekspresjon) og ikke-induserte celler (lav ekspresjon) ved migrasjon i en sårhelende analysen. Som for MDA-MB-231-celler, caveolin-1 mislyktes å re-lokalisere i migrere B16-F10 celler (figur 1E) og akkumulering på baksiden ble aldri observert på noe tidspunkt under trekket (figur 1F).
til sammen tyder disse resultater på at i motsetning til observasjoner i ikke-metastatiske celler evaluert her (MEF-3T3, DI-TNC1) og i litteraturen [19], [20], [21], caveolin-en ikke undergår polarisering under trekket av metastatiske celler. Siden konsekvensene av slike caveolin-en atferd for cellemigrasjon er ukjent, ble bidraget fra caveolin-en til flere migrasjons forbundet karakteristikker av MDA-MB-231 og B16-F10 celler evalueres på følgende eksperimenter.
Cell polarisering er det første trinnet som er nødvendig for cellemigrasjon og retningsbevegelse. Re-lokalisering av MTOC forkant av kjernene og bak Golgi er viktig å definere retningen av migrasjon [27]. For å undersøke hvilken rolle caveolin-1 i MDA-MB-231 celle polarisering, endogent protein ble nedregulert av shRNA (shRNA-caveolin-en # 5) (figur 2A). Som sett i figur 1, har endogen caveolin-en ikke hope seg opp på baksiden av migrerende celler (figurene 2B, 2C). Imidlertid polarisering av MDA-MB-231-celler med nedsatt caveolin-1-ekspresjon ble betydelig redusert, slik som vist ved Golgi-orientering (fig 2B, 2D, fig S1A, S1B). Kvantitativ analyse indikerte at shRNA-mediert nedregulering av caveolin-en forsinket MDA-MB-231 celle polarisering, fordi forskjellene var ikke lenger signifikant etter 360 minutter (figur 2D). Som kan forutsies for en doseavhengig caveolin-1-virkning, ble delvis tap av cellepolarisering observert med en annen shRNA (shRNA-caveolin-1, sekvens # 3) som var rettet mot caveolin-en med lavere effektivitet (figur S1A, fig S1C) . Således synes caveolin-en for å spille et tidlig, men forbigående rolle i polarisasjonen av metastatiske MDA-MB-231-celler. Likeledes økte B16-F10 celle polarisering i en tidsavhengig måte ved migrering inn i en såret område og antall polariserte celler som var betydelig høyere i caveolin-1-uttrykkende celler etter IPTG-induksjon (fig 2E, 2F, figur S2). En mindre økning i celle polarisering ble observert i lav caveolin-1-uttrykkende celler (uten IPTG-induksjon) sammenlignet med den mock-kontroll (figur 2F). Disse resultater indikerer at både B16-F10 melanoma mus og MDA-MB-231 humane brystcancerceller, caveolin-1 fremmer celle polarisering på en måte som ikke krever caveolin-en opphopning på celleiden.
(A) Totalt proteinekstrakter ble fremstilt fra både foreldre MDA-MB-231 og celler som stabilt transduced med en kontroll shRNA targeting luciferase (sh-ctrl) eller en shRNA targeting caveolin-en (shRNA-caveolin-en # 5, sh-cav1 ). Ekstraktene ble separert ved SDS-PAGE (35 ug totalprotein per bane) og analysert ved Western blotting med antistoffer mot caveolin-1 og β-aktin. (B) Flytende monolag av foreldre, shRNA-kontroll (sh-ctrl) eller shRNA-caveolin-en (sh-cav1) behandlet MDA-MB-231 celler ble såret med en pipettespiss og fastsatt til 0 (venstre panel) og 60 minutter (høyre panel) etter mono skade. Prøvene ble farget med anti-caveolin-1 (grønn) og anti-Golgin-97 (rød) antistoffer, mens kjernene ble merket med DAPI (blå). Det første lag av celler som vender mot såret område skiller seg fra resten av en hvit linje. Scale bar, 20 mikrometer. (C) Caveolin-en lokalisering ble analysert som beskrevet i figur 1C, ved å måle forholdet mellom fluorescensintensiteten «/bak». Dataene er gjennomsnitt ± SEM, n = 3. (D) Polarisering av begge foreldre (-) og shRNA behandlet MDA-MB-231 celler med shRNA-luciferase (sh-ctrl) eller shRNA-caveolin-1 (sh-cav1) ble målt fra (C) som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder, ved å analysere det ytre lag av celler som vender mot såret område (B). Prosentandelen av polariserte celler ble evaluert på 0, 60 og 360 minutter etter såret. Data ble gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM). * Sammenligning med kontroll shRNA P 0,05. (E) B16-F10 celler transfektert med enten pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-en (cav1) ble behandlet eller ikke med 1 mM IPTG i 24 timer, dyrket i monolag og såret med en pipette tips å tillate migrasjon for 1 timer. Prøvene ble farget med anti-Gigantin-1 polyklonalt antistoff (blå), phalloidin-Alexa488® (grønn) og propidiumjodid (rød). Det ytre laget av celler som vender mot såret området er skissert med en hvit linje. (F) Celle polarisasjon ble målt som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder, ved å analysere det ytre lag av celler som vender mot såret område. Prosentandelen av polariserte celler ble evaluert 0-360 minutter etter såret monolaget. Data ble gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM). Statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med pLacIOP-transfektert B16-F10 (mock) celler er indikert (**, P 0,01 på tid 360 min; *, P 0,05 på tiden 60 min)
Caveolin. -1 Fremmer migrasjon av metastatisk Cells
rollen caveolin-1 i celle migrasjon er kontroversielt og ser ut til å være celle-kontekstavhengig, siden det har blitt beskrevet både som en positiv [18], [19] og negativ regulator av migrering [28], [29], [30]. I disse studiene hovedsakelig fibroblaster og endotelceller ble karakterisert. Således evaluerte vi virkningen av caveolin-1 i migrering av metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10 celler. I begge tilfeller caveolin-1-ekspresjon foretrekkes migrasjon, som observert i en Boyden kammer analyse (figur 3A, 4A) og ved analyse av time-lapse videomikroskopi i kombinasjon med individuell celle sporing (Figurene 3B, 4B). Caveolin-en ned-regulering i MDA-MB-231 celler ved shRNA redusert sporlengde og retningen på migrasjon sammenlignet med foreldre og kontrollceller (Figur 3B). Dataene støtter ideen om at caveolin-en tilstedeværelsen i disse celler favoriserer persistens av cellemigrering. Faktisk, redusert caveolin-en nedregulering cellemigrerings tilhørende parametre, herunder øyeblikkelig (figur 3C) og gjennomsnittshastighet (figur 3D), utholdenhet (oppnådd som forholdet mellom netto og total distanse, figur 3E) og retningen på migrasjon (uttrykt som prosentandelen av celler som beveger seg innenfor en 60 ° vinkel fra startpunktet) (figurene 3B, 3F). Lignende resultater ble oppnådd i B16-F10 celler, hvor caveolin-1-ekspresjon økt transmigrasjon i en Boyden kammer analyse (figur 4A) og migrasjon i en sårhelende analysen (figur 4B), så vel som den foreliggende og gjennomsnittshastighet, utholdenhet og retningen på migrasjon (figur 4C, Figur S3). Disse data er i overensstemmelse med tidligere observasjoner i MEF-3T3-celler [10], [11], [18], og antyder at caveolin-1 modulerer migrering av metastatisk MDA-MB-231 og B16-F10 celler, men gjør det selv i fravær av endringer i intracellulær fordeling.
(A) Migrering av MDA-MB-231 celler behandlet med shRNA targeting enten luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-en (sh-cav1) ble vurdert i en Boyden kammeret analysen. Celler (5 x 10
4) ble sådd på fibronektin-belagte (2 ug /ml) Transwell plater og tillatt å migrere i 2 timer. Celler som migrerte til den undre side ble detektert med krystallfiolett farging (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). ** P 0,01. (B) Foreldre og shRNA behandlet MDA-MB-231 celler ble dyrket som konfluent monolag, såret med en pipettespiss og migrasjon ble spilt inn av time-lapse video mikroskopi (totalt 15 timer, 12 minutter rammeintervall). Celle sporene ble bestemt ved hjelp av
Bilde J
programvare (
«manuell tracking»
plug-in). Spor av enkeltceller på såret kanten vises (øvre panel). Kanten av såret er indikert med en hvit linje. Encellete spor er vist i et kartesisk koordinatsystem for hver celletype (nedre panel). (C) Øyeblikkelig hastigheten ble analysert for hver celletype i (B) og plottet som en funksjon av tid (0-15 timer). (D) Mean hastighetsverdier ble oppnådd fra (C) og plottet for hver celletype. (E) Avtagningsraten av migrering ble beregnet som forholdet mellom netto avstand og den totale avstand på migrasjon i (B). Gjennomsnittsverdier ble oppnådd for foreldre, SH-ctrl og SH-cav1 celler (gjennomsnitt ± SEM). (F) Directionality av migrering ble oppnådd fra analysen er vist i (B), nedre paneler. Spor som lå innenfor en 60 ° vinkel i forhold til retningen av celle bevegelse ble betraktet som orientert (skravert område). Prosentandelen av celler med orientert spor ble beregnet og plottet (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). * P. 0,05
tyrosinfosforylering på Caveolin-en er nødvendig for migrasjon av metastaserende celler
Caveolin-en gjennomgår Src-mediert fosforylering på tyrosin-14, som er tenkt å være avgjørende for fibroblast cellevandring [18]. Involvering av fosforylering av caveolin-en på tyrosin-14 for å fremme cellemigrasjon er videre støttet av observasjoner i brystkreft cellelinjer, inkludert MDA-MB-231 celler [11]. Således, vurderte vi rolle tyrosinfosforylering i B16-F10 melanomcellelinje. Forbløffende nok uttrykk for ikke-phosphorylatable caveolin-en (mutant Y14F) unnlot å fremme B16-F10 celle migrasjon (figur 4A, 4B). Selv om Y14F mutanten ikke ble uttrykt i samme grad som i villtype-proteinet, er det lite sannsynlig at en slik differensial uttrykk står for manglende evne av dette proteinet for å fremme cellemigrering (figur 4A), siden det for en populasjon av B16F10 (caveolin-1) -celler (klone 3) med sammenlignbare nivåer av caveolin-en til dem detektert i caveolin-1 (Y14F) celler (se figur S3), migrasjonsrater var lik dem detektert for den opprinnelige populasjon av B16F10 (caveolin-1) celler (figur 4A). Videomikroskopi-analyse viste at sporene mock kontroller og caveolin-1 (Y14F) celler var kortere enn dem som ble oppnådd fra celler som uttrykker villtype caveolin-1 (figur 4B). I tillegg migrasjon var mer tilfeldig i cellene mangler caveolin-en eller uttrykker caveolin-en (Y14F) og parametre for midlere hastighet, utholdenhet og retningen på migrasjon var lavere i caveolin-en (Y14F) celler sammenlignet med celler som uttrykker villtype caveolin -1 (figur 4C). Disse resultatene indikerer at caveolin-1 fremmer cellemigrering in B16-F10 celler ved å øke celle polarisering, hastighet, utholdenhet og retningen av celle bevegelse, og at evnen til å gjøre dette avhenger av tilstedeværelsen og antagelig fosforylering av tyrosin-14.
(A) B16-F10 celler transfektert med pLacIOP (mock), ble pLacIOP-caveolin-1 (WT) eller den pLacIOP-caveolin-1 /Y14F mutant (Y14F) ble behandlet med 1 mM IPTG i 24 timer. Deretter ble cellemigrering vurdert i en Boyden kammer analysen ved såing-celler (5 x 10
4) på fibronektin-belagte (2 ug /ml) Transwell plater og tillater migrasjon i 2 timer. Celler som migrerte til den undre side ble påvist ved krystallfiolett farging (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). * P 0,05. Bunnfeltene viser total proteinekstrakter, adskilt ved hjelp av SDS-PAGE (35 ug totalt protein per bane) og analysert ved Western blotting. Tallene nedenfor paneler indikere relative caveolin-1-nivå (caveolin-1 /WT = 22,0 ± 1,8, caveolin-1 /Y14F = 16,6 ± 3,8; verdier sammenlignet med modell tilstand og oppnådd som gjennomsnittet fra tre uavhengige målinger ± SEM). (B) Flytende monolag av B16-F10 celler transfektert med pLacIOP (mock), pLacIOP-caveolin-en (WT) eller pLacIOP-caveolin-1 /Y14F (Y14F) ble såret med en pipettespiss og spilt inn av time-lapse video mikroskopi for 10 timer (12-min ramme intervall). Celle spor ble bestemt som angitt i figur legende 3B. Spor av enkeltceller på såret kanten vises (øvre panel). Kanten av såret er skissert av en hvit linje. Encellete spor er vist i et kartesisk koordinatsystem for hver celletype (nedre panel). (C) Den midlere hastighet (um /min) var avledet fra det øyeblikk hastighet (fig S3), som beskrevet i (D). Den utholdenhet og retningen av migrering ble oppnådd som beskrevet i figurene 3E og 3F, henholdsvis. Dataene som vises er middelverdien ± SEM (n = 3). * P. 0,05
Opplysninger i B16-F10 celler ble ytterligere validert av farmakologisk hemming av Src-familie kinaser, som fosforylerer caveolin-en på tyrosin-14 [31]. Cellemigrering og fosforylering av caveolin-1 ble undersøkt i nærvær eller fravær av den selektive Src-kinase-inhibitor, PP2 (4-amino-5- (4-klorfenyl) -7- (dimetyletyl) pyrazolo [3,4-d] pyrimidin ), både i MDA-MB-231 og B16-F10 celler. Serum stimulering økt sårheling i både MDA-MB-231 og B16-F10 celler. Sårheling ble modulert av caveolin-1 uttrykk, som shRNA mediert nedregulering i MDA-MB-231 celler ble redusert (figur 5A, histogram barer), mens ektopisk uttrykk i B16-F10 celler økte lukking av sår (Figur 5B, histogram barer) . Viktigere, behandling med PP2, men ikke kontrollere kjøretøy (dimetylsulfoksyd DMSO) forhindret caveolin-en forbedret lukking av sår både i MDA-MB-231 (figur 5A) og B16-F10 celler (figur 5B). Videre, både endogene og ectopically uttrykt caveolin-1 mislyktes i å gjennomgå fosforylering i nærvær av denne inhibitor (figurene 5A, 5B, Western blot). Det skal bemerkes at lite pY14-caveolin-1 var påvisbar i mock-transfekterte B16-F10 celler, antagelig fordi endogene nivåer av caveolin-en var for lave. Viktigere, ble det ikke observert noen signifikante endringer i spredning for begge cellelinjer i nærvær av inhibitor (data ikke vist). Disse resultatene er i overensstemmelse med ideen om at evnen til caveolin-en for å forbedre metastatisk cellemigrering er avhengig av tyrosin-fosforylering av 14 Src-familie kinaser.
MDA-MB-231-celler som stabilt transdusert med shRNA enten målretting Luciferase ( sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-cav1) ble pre-inkubert med DMSO (D) eller 10 pM PP2 i 30 minutter, såret med en pipettespiss, stimulert (+) eller ikke (-) med 3% av serum og bildene ble tatt opp på 0 og 16 timer etter såret. De sårede området ble målt med
Bilde J
programvare og andelen for sårheling ble plottet (øvre panel). Totalt proteinekstrakter ble utarbeidet og analysert ved Western blotting med antistoffer mot caveolin-en, pY14-caveolin-en og aktin. (B) Sammenflytende monolag av B16-F10 celler transfektert med enten pLacIOP eller pLacIOP-caveolin-1 ble pre-inkubert med 1 mM IPTG i 24 timer. Deretter ble cellene behandlet med DMSO (D) eller PP2, såret med en pipettespiss, stimulert med 3% av serum og analysert ved 0 og 7 timer etter såret, som beskrevet i (A). Total proteinekstrakter ble fremstilt og analysert ved Western blotting. Verdier i (A) og (B) ble tatt i gjennomsnitt fra 3 uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM). * P. 0,05
Caveolin-en Fremmer Focal Heft Omsetningen ved metastatisk Cells
Caveolin-en reduserer skyt av FAK mellom fokale heft og cytosoliske bassenger, noe som tyder på en rolle for caveolin -1 i omsetningen av fettsyrer [24]. Viktigst er cellemigrasjon stramt regulert i høyde med FA omsetningen [32], [33]. Derfor vurderte vi effekten av caveolin-en på FA omsetningen med metastatisk kreft celler ved transfeksjon med GFP-vinculin fulgt av time-lapse videomicroscopy analyse. GFP-vinculin var forbundet med fettsyrer av både mock og caveolin-1 som uttrykker B16-F10 celler (Figur 6A). Selv om en liten prosentandel av den totale fettsyrer gikk omsetning i B16-F10 celler (5-10% av totale fettsyrer), ble det observert en signifikant økning i kinetikken av FA demontering i caveolin-1-uttrykkende celler i forhold til den mock-kontroll (figur 6A , piler, figur 6B, topp graf). Viktigere, uttrykk for caveolin-en økt fokus kontakt (FC) levetid (Figur 6A, pilspisser, figur 6B, bunn graf), i samsvar med tidligere observasjoner [18]
(A) B16-F10 celler transfektert. med pLacIOP (mock) eller pLacIOP-caveolin-1 (cav1) ble transfektert med pEGFP-vinculin i 24 timer, utsådd på fibronektin-belagte dekkglass (2 ug /ml) og dyrket i nærvær av 1 mM IPTG i 24 timer (se Materialer og metoder). Deretter ble cellene i serum-sultet i 4 timer, pulsert med 10% serum og registrert av time-lapse videomikroskopi i 60 minutter (1-min rammeintervall). Zoomet områdene er vist på utvalgte tider for mock og cav1 celler. Focal voksninger (FA, piler) og fokale kontakter (FC, pilspisser) ble definert av størrelse. Bildene er representative for 3 uavhengige eksperimenter. (B) Kinetikk av fettsyrer og FCS ble målt fra forsøkene er vist i A. FA demontering og FC levetid ble målt i minst 6 strukturer per eksperiment (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). * P 0,05. (C) B16-F10 håne eller cav1 celler ble sådd ut på fibronektin-belagte dekkglass (2 ug /ml), dyrket i nærvær av 1 mM IPTG i 24 timer og behandlet med 10 uM nocodazol i serumfritt medium i 4 timer. Deretter, nocodazol ble fjernet ved utvasking med serumfritt medium, og cellene ble inkubert ved 0-20 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene fiksert og farget med anti-vinculin antistoff (rød) og DAPI (blå) til å merke fettsyrer og kjerner, respektivt. (D) fotballforbund ble kvantifisert fra forsøkene beskrevet i (C) ved å bruke
Bilde J
programvare. Minst 10 bilder per tidspunkt ble analysert. Data ble gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). (E) B16-F10 mock (-), cav1 (WT) eller cav1 /Y14F (Y14F) celler ble behandlet med 10 uM nocodazol, som beskrevet i figur 6C. Nocodazol ble deretter utvasket i 60 minutter og fettsyrer ble analysert med et anti-vinculin antistoff (rød) og kjerner med DAPI (blå). Fotballforbund ble kvantifisert som i (D). Data er fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM). * P 0,05. (F) MDA-MB-231 celler stabilt transduced med shRNA enten målretting Luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-en (sh-cav1) ble transfektert med pEGFP-vinculin for 24 timer, serum-sultet i 4 timer, pulset med 10 % serum og registrert av time-lapse videomikroskopi som beskrevet i (A). FA demontering og FC levetid ble målt i 5 strukturer per eksperiment. Data ble gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnitt ± SEM, n = 3). (G) fokal adhesjon demontering ble målt etter nocodazol fjernelse i MDA-MB-231-celler behandlet med shRNA målretting luciferase (sh-ctrl) eller caveolin-1 (sh-cav1), som beskrevet i (C) og (D). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter.
