Abstract
Kreft kakeksi er en sløsing tilstand, drevet av systemisk inflammasjon og oksidativt stress. Denne studien undersøkte eikosapentaensyre (EPA) i kombinasjon med oksypurinol som en behandling i en musemodell av cancer cachexia. Mus med kreft kakeksi ble randomisert til 4 behandlingsgrupper (EPA (0,4 g /kg /dag), oksypurinol (1 mmol /L ad-lib), kombinasjon, eller kontroll), og avlives etter 29 dager. Analyse av oksidativ skade på DNA, mRNA analyse av pro-oksidanter, antioksidant og proteolytiske pathway komponenter, sammen med enzymaktivitet av pro- og antioksidanter ble gjennomført på gastrocnemius muskelen. Kontrollgruppen viste tidligere utbruddet av svulst i forhold til EPA og oksypurinol grupper (P 0,001). EPA gruppen opprettholdt kroppsvekt over en lengre varighet (20 dager) sammenlignet med oksypurinol (5 dager) og en kombinasjon (8 dager) gruppene (p 0,05). EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) og kombinert (18,4 ± 3,7 pg /ml) gruppene hadde betydelig høyere 8-OH-dG nivåer enn kontrollgruppen (12,9 ± 1,4 pg /ml, P≤0.05) indikerer økt oksidativ skade DNA. mRNA nivåer av GPx1, MURF1 og MAFbx ble høyere etter EPA behandling sammenlignet med kontrollgruppen (P≤0.05). Mens oksypurinol var assosiert med høyere GPx1, MnSOD, CAT, XDH, MURF1, MAFbx og UBB mRNA sammenlignet med kontroll (P≤0.05). Aktiviteten av den totale SOD var høyere i oksypurinol gruppen (32,2 ± 1,5 U /ml) sammenlignet med kontrollgruppen (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), GPX-aktivitet var lavere i EPA-gruppen (8,76 ± 2,0 U /ml) sammenlignet med kontrollgruppen (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05), og katalase-aktivitet var lavere i kombinasjonsgruppen (14,4 ± 2,8 U /ml) sammenlignet med kontrollgruppen (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01). Det var ingen endring i XO aktivitet. Den økte frekvensen av vekt nedgang i mus behandlet med oksypurinol indikerer at XO kan spille en beskyttende rolle under utviklingen av cancer cachexia, og dens inhibering er skadelig for utfall. I kombinasjon med EPA, var det lite vesentlig forbedring fra kontroll, noe som indikerer oksypurinol er usannsynlig å være en levedyktig behandling sammensatt i kreft kakeksi
Citation. Vaughan VC, Sullivan-Gunn M, Hinch E, Martin P, Lewandowski PA (2012) eikosapentaensyre og oksypurinol i behandling av muskelsvinn i en musemodell for Cancer kakeksi. PLoS ONE 7 (9): e45900. doi: 10,1371 /journal.pone.0045900
Redaktør: Atsushi Asakura, University of Minnesota Medical School, USA
mottatt: 3 mai 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 20.09.2012
Copyright: © Vaughan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. VV er mottakeren av den viktorianske Cancer Agency Palliativ og Supportive Care stipend gjennom den viktorianske Cancer Agency finansiert av staten regjeringen i Victoria, Australia, og Bellberry Support stipend gjennom Bellberry Ltd. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange former for kreft stede med en kompleks. metabolsk profil preget av tap av lean body mass og fettvev, kjent som kreft kakeksi. Omtrent halvparten av alle kreftpasienter utvikle kakeksi [1], med utbredelsen stiger så høyt som 86% i løpet av de siste 1-2 ukene av livet [2], og 20% av kreftdødsfall skyldes kakeksi [3]. Pasienter som lider kakeksi kan tape opp til 30% av sin opprinnelige kroppsvekt, med 45% av pasientene mister mer enn 10% av sin opprinnelige vekt i løpet av sykdomsprogresjon [4].
Oxidative stress kan spille en vesentlig rolle i kreft kakeksi, med bevis for oksidativ skade og høye nivåer av reaktive oksygenforbindelser (ROS) som finnes i mange krefttilstander [5]. Rollen til ROS i utviklingen av kreft kakeksi, og de mekanismene som forårsaker sykdommen fortsatt i stor grad ukjent, til tross for flere fremskritt i å identifisere sirkulasjonsfaktorer og veier som er aktive. En endring i balansen mellom reaktive oksidanter og antioksidanter kan indusere en tilstand av oksidativt stress som er skadelig for cellen, og kan være en av de viktigste faktorene i utviklingen av kakeksi.
Superoxide dismutase (SOD) er et enzym som er ansvarlig for dismutering av superoksid anion (O
2
– ·) i hydrogenperoksyd og oksygen. Det er vist aktiviteten av SOD til å bli redusert i den kakektiske tilstand [6], [7], indikerer at det er en manglende evne til å kompensere for økninger i ROS, og derfor en manglende evne til å beskytte cellen fra oksidativt stress i cachectic tilstand . Antioksidant enzymene katalase og glutation peroksidase (GPX) som brytes ned hydrogenperoksyd til oksygen og vann har også blitt funnet å ha lavere aktivitet i kreftkakeksi studier [8], noe som indikerer at systemene kan være viktige bidragsytere til oksidativt stress og skade observert hos kreft kakeksi.
Mens noen av de som er involvert i den overskytende produksjon av ROS veier har blitt studert i lengden kreft kakeksi, er det andre som har vist seg å spille en rolle i oksidativt fornærmelse i andre sykdommer, som har ennå ikke er studert i detalj i cancer cachexia. Xantin oksidoreduktase er et enzym med to forskjellige former som er ansvarlig for å katalysere omdannelsen av hypoxantin til xantin og xantin til urinsyre [9]. Xantin dehydrogenase (XDH) uttrykkes
in vivo
, og anvender NAD + som en elektronakseptor for reduksjonsreaksjonen, danner NADH. I nærvær av proinflammatoriske mediatorer, XDH lettest spalter til xantinoksydase (XO), hvilke i stedet anvender molekylært oksygen for omdannelse av hypoxantin til xantin og xantin til urinsyre, fremstilling av sterkt reaktive O
2
– ·, eller hydrogen peroxide [9]
data~~POS=TRUNC som gjennomsnitt ± SEM
Mens XO er vanligvis ikke tilstede på høye nivåer i skjelettmuskulatur, økte nivåer blir ofte sett.. i muskel vevsskade og iskemi-reperfusjonsskade [10]. Høye nivåer av XO er også blitt observert i blodet hos noen kreftpasienter sammenlignet med pasienter uten kreft [11], og det er blitt foreslått at kakektiske dyr reagerer positivt når de ble behandlet med XO-inhibitorer [12]. Overflod av pro-inflammatoriske faktorer tilstede i kakeksi, kan føre til en økning i spaltingen av XDH til XO form, som forklarer høye sirkulerende nivåer av XO. Økte nivåer av XO vil da føre til overflødig produksjon av ROS, og bidra til oksidativt stress i kreft kakeksi.
Datapresentert som gjennomsnitt ± SEM.
oksypurinol er en nonkompetitiv, irreversibel inhibitor av XO, ansett som mer potent enn allopurinol, hvorav det er en metabolitt [10]. For tiden oksypurinol blir brukt som behandling for tilstander hvor XO er en bidragsyter, og har vist seg å redusere vevsødeleggelse og øke hjertefunksjon i kakektiske dyr, [12], [13]. En reduksjon i purin produksjon og tilhørende stoffskifte- behov kan be reduksjon av XDH uttrykk, og derfor nedstrøms aktivitet av dette enzymet. Urinsyre, produsert av XO, øker omdannelsen av arachidonsyre til dets biologisk aktive metabolitter [14]. Dette vil igjen øke aktiveringen av NADPH oksidase, vedlikeholdende signaleringskaskade som resulterer i aktivering av økt transkripsjon av komponentene i ubiquitin-proteasom-system.
data presentert som gjennomsnitt ± SEM.
en signifikant forskjellig i forhold til kontroll,
b signifikant forskjellig i forhold til EPA,
c signifikant forskjellig i forhold til oksypurinol (P 0,05).
Den progressive katabolisme av muskel i kreft kakeksi antyder en sentral rolle i systemer av protein degradering, slik som ubikvitin-reaksjonsvei proteolytiske (UPP). UPP har blitt funnet å være oppregulert både i eksperimentelle modeller og pasienter med kakeksi [15], [16], noe som indikerer bidrag til muskel tap og tilhørende negative resultater. Før proteiner brytes ned av UPP, må de være målrettet av konjugert til flere molekyler av ubiquitin. For at denne konjugering skal skje, må ubiquitin først aktiveres av et ubikvitin-aktiverende enzym (E1), og deretter overført til det aktive sete av en ubiquitin bærerprotein (E2). Den bundne E2 gjenkjenner ubiquitin konjugering av enzymer (E3 E3 eller protein ligase), som tillater konjugeringsreaksjoner å finne sted, som danner en kjede av ubiquitins knyttet til hverandre og proteinsubstratet. Bare når ubiquitin er rettet mot et valgt protein kan det da bli gjenkjent av proteasomet, og bearbeides til mindre peptider [17]. Flere E3 protein ligaser er blitt vist å være aktiv i løpet av proteolyse i muskel atrofi, spesielt muskel-spesifikke F-boksen (MAFbx) /atrogin-1 og muskel spesifikk ringfingeren 1 (Murf-1) [18].
data presentert som gjennomsnitt ± SEM.
en signifikant forskjellig i forhold til kontroll,
b signifikant forskjellig i forhold til EPA,
c signifikant forskjellig i forhold til oksypurinol (P 0,05).
eikosapentaensyre (EPA) er en naturlig forekommende omega-3 fettsyrer, som finnes i fet fisk og enkelte alger, allment ansett for å ha stort potensiale som antigenotoxic, antioksidant og chemopreventive agent. Administrering av EPA har vist seg å øke aktiviteten av ROS scavenging SOD [19], forsinke utvikling av visse typer kreft, og øke vektøkningen og livskvalitet i bukspyttkjertelcancerpasienter [20]. I de senere år har EPA blitt trialed som en behandling for kreft kakeksi på grunn av dens forskjellige roller som en agonist av SOD og i oppstrøms regulering av ekspresjon og aktivitet av UPP [20] – [22]. EPA erstatter arakidonsyre i fosfolipid-membraner når de konsumeres i store mengder [23], og har også vist seg å hemme 15-HETE produksjon av arachidonsyre, som har vært implisert i UPP regulering i murine modeller av kakeksi [24], [25] . Noen dyreforsøk av EPA har vært vellykket, som har sin kombinasjon med andre terapeutiske tilnærminger i menneskelige pasienter, for eksempel leucin tilskudd, høy protein diett og mosjon [26], [27].
Den nåværende studien var å fastslå om hemming av xantinoxidase av oksypurinol hadde en gunstig effekt i behandling av muskelsvinn i kreft kakeksi. Videre forskerne forsøkt å finne ut om EPA i kombinasjon med oksypurinol var en effektiv multimodal behandling for muskelsvinn i kreft kakeksi. Det ble antatt at den hemmende effekten av oksypurinol på XO kombinert med den agonistiske virkning av EPA på SOD vil redusere nærvær av overskudd O
2
– • I kakektiske muskel, noe som fører til en reduksjon i oksidativ fornærmelse og resulterende skade eller kaste bort sammenlignet med cachectic kontroller.
data~~POS=TRUNC som gjennomsnitt ± SEM.
en signifikant forskjellig i forhold til kontroll,
b signifikant forskjellig i forhold til EPA,
c signifikant forskjellig i forhold til oksypurinol (P 0,05).
Resultater
Animal Model
Fire dyr fra kontrollgruppen og ett hver fra oksypurinol og kombinasjonsbehandlingsgruppene ble hentet før avslutningen av rettssaken på grunn av etiske hensyn, og ble ikke inkludert i statistiske analyser.
Mus i kontrollgruppen viste begynnende svulstdannelse fra 6 ± 0,3 dager (figur 1), mens alder og vekt matchet EPA (10 ± 0,7 dager) og oksypurinol (9 ± 0,6 dager) behandlingsgruppene hadde en signifikant forsinkelse i tumor angrep av sammenlignings (P 0,001). Den EPA gruppen også hadde betydelig forsinket utbruddet i forhold til kombinasjonsgruppen (7 ± 0,7 dager, P 0,001). Den oksypurinol behandling forsinket begynnende svulstdannelse sammenlignet med kombinasjonen (P 0,01) gruppe. Det var ingen statistisk forskjell i størrelsen på slutt svulst mellom EPA (338 ± 67 mm
3) og kontroll (308 ± 28 mm
3) grupper, mens oksypurinol (489 ± 78 mm
3) og kombinasjon (515 ± 41 mm
3) behandlingsgrupper viste øket endelig tumorstørrelse sammenlignet med både kontroll (p 0,01) og EPA-grupper (p 0,05).
Vekt-tap ble beregnet som en prosentandel av opprinnelige vekt, korrigert for tumormasse (figur 2). Kontrollgruppen opplevde betydelig vekttap i forhold til opprinnelig vekt fra dag 12 og fremover (P 0,05). EPA gruppen økte i kroppsvekt i løpet av pre-kakektiske fase, før vekt stabilisering, og opprettholdt denne pre-cachectic tilstand inntil dag 22, da vektene begynte å avta, med betydelig vekttap fra dag 25. oksypurinol gruppen fikk gradvis nedgang fra topp vekt fra dag 3, før en kraftig nedgang i vekt på dag 13. Vekttap var signifikant i denne gruppen fra dag 14 og gradvis redusert til endepunktet. Kombinasjonen gruppe utvinnes fra en kraftig nedgang i kroppsvekt på dag 4, betydelig økning i kroppsvekt fra innledende, og var stabil før opplever betydelig vekt-tap fra dag 17 (unntatt dag 19; P 0,01). Kontrollgruppen hadde gjennomsnittlig vekt endring av -9,06% ved aktiv dødshjelp, EPA gruppe -4,91%, oksypurinol -9,11% og kombinasjonsgruppen -5,03%, Det var ingen signifikante forskjeller i prosentvis vekttap mellom grupper på aktiv dødshjelp. EPA behandlingsgruppe viste vekttap betydelig lavere enn i kontrollgruppen (P 0,05) lengre varighet (dager 3-15, 17-23, totalt 20 dager) sammenlignet med både den oksypurinol (dag 3, 4, 7, 8, 10, totalt 5 dager) og kombinasjons (dager 6-12, 19, totalt 8 dager) behandlingsgruppene. Mens det var en meget sterk sammenheng mellom tumorstørrelse og vekttap i kontrollgruppen (R «> 2 = 0,94), mindre variasjon ble forklart ved korrelasjonen mellom vekttap og tumorstørrelse i EPA (R’> 2 = 0,72), oksypurinol (r
2 = 0,72), og kombinasjonen (r
2 = 0,70) behandlingsgruppene.
i EPA behandlingsgruppen, quadriceps, soleus, TA og gastrocnemius muskler utgjorde en betydelig høyere prosentandel av total kroppsvekt enn kontrollgruppen ved endepunktet (P≤0.05, figur 3). I oksypurinol behandlingsgruppen, TA og gastrocnemius var også en betydelig høyere prosentandel av total kroppsvekt sammenlignet med kontrollgruppen ved endepunktet (P≤0.05). Vekter av soleus, TA og gastrocnemius ble også større enn kontrollgruppen i dyr utsatt for kombinasjonsbehandling (P≤0.05). Kvadricep vektøkning i EPA behandlingsgruppen sammenlignet med både oksypurinol og kombinasjonsbehandlinger, men TA og plantarus ble også redusert sammenlignet oksypurinol og kombinasjonsgruppene.
Oksidativt stress
8-OH- dG-nivåer i gastrocnemius muskel fra kontrollgruppen var 12,9 ± 1,4 pg /ml. EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) og kombinert (18,4 ± 3,7 pg /ml) gruppene hadde signifikant høyere nivåer enn kontrollgruppen (P≤0.05, figur 4), noe som indikerer økt oksidativt stress i disse gruppene. Den oksypurinol gruppen ikke vise betydelig høyere 8-OH-dG nivåer sammenlignet med kontrollgruppen (14,9 ± 1,5 pg /ml, P≤0.07).
Gene Expression
genuttrykk i gastrocnemius muskelen er vist i tabell 1. den antioksidanten komponent GPx1 økt 3,1 ganger i EPA-gruppen og 4,1 ganger i oksypurinol gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,01), som gjorde uttrykk for ubiquitin E3-ligaser MURF1 og MAFbx, 2,5 ganger i EPA-gruppen, og 2,8 ganger og 3,6 ganger i oksypurinol gruppen henholdsvis (P 0,05). Oksypurinol økte også ekspresjon av antioksydant komponenter MnSOD 1,9 ganger (P 0,05) og CAT med 2,4 ganger (P 0,01) sammenlignet med kontrollgruppen, mens XDH økte 2,7-ganger (P 0,01) og en 1,3 ganger økning i proteasome subenhet UBB (P 0,05) ble observert. Behandlingene i kombinasjon reduksjon EcSOD ekspresjon 0,3 ganger i forhold til kontrollverdiene (P 0,05).
enzymanalyser
Aktiviteten av den totale SOD betydelig økt i oksypurinol gruppen (32,2 ± 1,5 U /ml, figur 5) sammenlignet med kontrollgruppen (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), kombinasjonen (25,0 ± 3,4 U /ml, P 0,01) og EPA grupper (28,3 ± 1,5 U /ml, P 0,05). Det var ingen endring mellom andre grupper. Aktivitet av GPX var signifikant redusert i EPA-gruppen (8,76 ± 2,0 U /ml) sammenlignet med både kontroll (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05) og kombinasjonsgrupper (13,6 ± 2,0 U /ml, P 0,05) . Katalase-aktivitet ble redusert i kombinasjonsgruppen (14,4 ± 2,8 U /ml) sammenlignet med både kontroll (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01) og oksypurinol grupper (24,3 ± 4,7 U /ml, P 0,05). Det var ingen andre vesentlige endringer mellom gruppene. Det var ingen signifikant forskjell i aktivitet mellom XO grupper.
diskusjon
EPA har blitt generelt akseptert å ha potensial til å hjelpe i behandlingen av cancer cachexia, spesielt som en del av en kombinert tilnærming til terapi [26], [27], men ytterligere belysning av de nøyaktige mekanismer som er nødvendig. I denne studien, hadde dyr behandlet med EPA vesentlig forsinket tumorutvikling, og derfor forbedrede resultater, som kan ha vært grunnet EPA er tidligere beskrevet anti-tumor-virkning [28], i stedet for anti-cachectic virkning alene. Men mens hemmet tumorvekst kan delvis forklare demping av vekttap, viser tidligere forskning at anti-cachectic effekten av EPA er større enn det som forventes gis størrelsen av tumor reduksjon [29], og ser ut til å utløse en respons forskjellig fra anti-tumor effekt [30], som støtter det syn at den økte variasjon sett i EPA gruppen i denne studien kan skyldes annet enn hemmet tumorvekst faktorer. Fremtidige studier ville ha nytte av at dyrene avlives ved vekt-tap eller tumor størrelse grenser, i stedet for vilkårlige datoer, for å fastslå om dyrene behandlet med EPA erfaring tilsvarende vekttap for ubehandlede dyr med lignende tumorstørrelse og masse, til tross for forsinket inntreden .
Langkjedede n-3 flerumettede fettsyrer, slik som EPA, er kjent for å bli svekket av oksidativt stress, som danner lipid hydroperoxydasene og fettsyreradikaler peroxyl noe som igjen kan skade lipidmembraner [31]. Inkorporering av EPA inn i lipidmembraner av celler i dyr som gjennomgår supplemente [23] kan øke følsomheten av disse membraner til oksydativ skade, inkludert celle og nukleære membraner, og videre å utsette celleinnhold, inkludert DNA, til økt oksidativ tilstand, og kan forklare økt oksidativ skade på DNA indikert ved nivåene av 8-OH-dG i EPA gruppen. 8-OH-dG er den dominerende formen for fri radikal-induced oxidative lesjon, og er ofte brukt som biomarkør for oksidativt stress [32]. 8-OH-dG frembringes under oksidativ skade på DNA, forårsaket av vekselvirkning mellom hydroksylradikalet og nukleotid-baser av DNA-tråder, og er ansett som en godt karakterisert og følsom markør for slik skade [32].
EPA behandling forårsaket en reduksjon i GPX-aktivitet sammenlignet med kontrollgruppen ved endepunktet. Denne reduksjonen i antioksidant kapasitet kan også være en indikasjon på et redusert behov for antioksyderende virkning, enten på grunn av redusert ROS nærvær eller økes ROS scavenging av andre enzymer. Det var heller ingen endring i SOD eller katalase-aktivitet. Sammen indikerer dette at EPA handling er ikke som en agonist av antioksidantaktivitet som en hypotese, og at ved endepunktet, potensialet for økt antioksidant handling indikeres av økningen i GPx1 genuttrykk blir dempet i denne gruppen. Således til tross for endringer i genekspresjon som i fravær av sykdom kan ha forårsaket økt aktivitet av antioksidantenzymer som GPX, nærværet av kreft kakeksi bygges slike funksjonelle forandringer oppstår. Ved fullføring av studien, hadde EPA gruppen begynt å avta i vekt, og det er derfor mulig at en tidligere virkning av EPA videre antioksidant funksjon som skyldes den forsinkede inntreden av vekt-tap; imidlertid ytterligere tid-retters studier er nødvendig for å bekrefte denne hypotesen. Nedgangen i kroppsvekt i EPA gruppen ved slutten av studien var en indikasjon på cancer cachexia er til stede.
En tidligere studie har vist at inhibering av XO av oksypurinol behandling reduserte tap av total kroppsvekt og lean body masse, og redusert produksjon av ROS sammenlignet med kontroller [12]. Imidlertid tyder denne studien som oksypurinol behandling kan forårsake uønskede resultater i gnagermodellen, spesielt den raske nedgangen av ytelse indikert ved vekt-tap sett tidlig i sykdommen. Oppregulering av komponentene i UPP foreslår også en dreining mot muskelsvinn i denne gruppen. Faktisk, oksypurinol, snarere enn å redusere aktiviteten til XO, forårsaket ingen generell endring sammenlignet med kontrollgruppen. Når den ses i sammenheng med den økte genekspresjon av XDH, indikerer dette at det kan være en inhiberende effekt, som blir kompensert for ved økt produksjon av XOR. Den oksypurinol behandlingsgruppen også utstilt en trend mot økt oksidativ skade sammenlignet med kontrollgruppen ( 0,07) indikerer at det kan være en økt overflod av ROS. Økt aktivitet av SOD i denne gruppen sammenlignet med kontroll viser økt scavenging av ROS, mest sannsynlig på grunn av økningen i oksidativ skade. Disse forskjeller i responsen kan skyldes en lav biotilgjengelighet av oksypurinol i den administrasjonsmåte som brukes i denne undersøkelsen [13], og alternativt, høyere potenspreparater eller måter levering bør vurderes i fremtidige studier. Fremtidige studier i rollen som XOR og purinmetabolismen i kakeksi kan også dra nytte av hemming av denne veien på et punkt oppstrøms XOR. Men på grunn av forskjeller mellom gnagere og primater metabolismen av puriner, er det viktig at denne veien være fullt undersøkt i en modell som gjør at kliniske paralleller til å bli trukket.
I løpet av studieprogresjon, vises kombinasjonsgruppen vekt-tap fase lignende egenskaper som både EPA og oksypurinol grupper. For eksempel, den første vektøkning og stabilisering reflekterer EPA gruppen, den kraftige nedgangen ved 12 dager gjenspeiler den for oksypurinol gruppen på 14 dager. Mengden av vekttapet ved kombinasjonen gruppe er for det meste ikke like ekstrem som oksypurinol gruppe, men vekt er ikke så godt bevart som EPA gruppen. Disse vekttap mønstre er også forskjellig fra kontrollgruppen, noe som indikerer at det er kombinasjonen av de to gruppene, i stedet for en manglende effekt, forårsaker dette mønsteret av nedgang. Et samspill mellom de to behandlingene er videre støttet av genuttrykk og enzymaktivitetsdata, der effekten i kombinasjonsgruppen skiller seg vesentlig fra effekten av hver behandling alene.
Gitt de betydelige endringene i mange parametere opplevde i som fikk kombinasjonsterapi sammenlignet med hver komponent isolert, er det mulig at trasé forandret av EPA og oksypurinol er koblet sammen. Selv om EPA har tidligere vist seg å undertrykke urat krystall-indusert inflammasjon i Sprague-Dawley-rotter [33], dette har ikke tidligere vært vist i en modell av kakeksi. Ytterligere forskning er nødvendig, men i skjæringspunktet mellom disse to baner ved arachidonsyre er den mest sannsynlige punktet for interaksjon [14], [23], [24]. Den kombinerte hemming av UPP av EPA og oksypurinol støttes av reduksjonen i gen-ekspresjon av Ubb, MURF1, og MAFbx i denne undersøkelsen (se tabell 1). Inhiberte virkningen av reaksjonsveien oppstrøms for NADPH oksidase av EPA og oksypurinol er videre støttet av trenden mot en nedgang i ekspresjon av NOX2 i kombinasjonsbehandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (P 0,06), og den reduserte ekspresjon av NOX2 i kombinasjonsgruppen sammenlignet med EPA gruppe angir at forbindelsen effekten av kombinasjonsbehandlingen øker inhibering av denne reaksjonsveien, mest sannsynlig via den tidligere foreslåtte mekanisme. En reduksjon i purin produksjon og tilhørende metabolisme krav, utløst ved tilbake inhibering av amidophosphoribosyl transferase [13], kan be reduksjon av XDH ekspresjon sett i kombinasjonsgruppen. De betydelige endringer sett i kombinasjonsgruppen kan også være forårsaket av økt opptak av oksypurinol på grunn av endret permeabiliteten til cellemembraner som følge av EPA tilskudd, og kan være årsaken til den tilsynelatende interaksjon. Altered flyt og fosfolipidpreparatet av cellemembranene er observert etter n-3 PUFA tilskudd [34], endre opptaket av hydrofobe legemidler. Gitt den relativt høy lipid-løselighet av oksypurinol [13], vil denne endringen tillate medikamentet å passere via passiv diffusjon.
Konklusjon
EPA fortsetter å vise lovende som en del av en multi-modal behandling for kakeksi, med en positiv dreining mot vedlikehold av muskelmasse, og forsinket utbruddet av vekttap hos dyr som gjennomgår EPA behandling sammenlignet med de som fikk annen behandling. Mekanismer for beskyttelse var ikke lenger aktiv på endepunktet undersøkt, derfor tid-retters studier er nødvendig for å fastslå de ansvarlige for den beskyttende effekten observert. Oksypurinol ser ut til å føre til en økt forekomst av vekt nedgang i mus med kreft kakeksi sammenlignet med alle andre behandlingsgruppene. Dette indikerer at XO kan spille en beskyttende rolle under utviklingen av cancer cachexia, og dens inhibering er skadelig for utfall. Imidlertid bevaring av masse i visse muskler medfører at oksypurinol kan være fordelaktig i å opprettholde muskelmasse. Den økte effekter i kombinasjonsgruppen sammenlignet med EPA eller oksypurinol behandlinger foreslå et skjæringspunkt mellom de to mekanistiske baner, eller at det i et økt opptak av oksypurinol i nærvær av EPA tilskudd, forårsaker den tilsynelatende interaksjon. Videre undersøkelser er nødvendig for å fullt ut belyse interaktive effekten av oksypurinol og EPA, og rollen til XO i kreft kakeksi.
Materialer og metoder
Cell Culture
murine adenokarsinom 16 (MAC16) cellelinje ble dyrket i RPMI med 10% FBS og 0,5% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Mulgrave, Australia). Celler ble dyrket til 80% konfluens, sentrifugeres ved 500
g
i 5 minutter ved 4 ° C, og isolert fra vekstmediet. Cellene ble deretter resuspendert i steril PBS, og trukket inn i en 25-gauge nål for injeksjon.
Animal Model
Alle dyreforsøk utført i denne studien ble godkjent av Animal Welfare Committee, til Deakin University (godkjenningsnummer A13 /2010). Kvinne Balb /c
Nu Nu
mus i alderen 8 uker (Animal Resource Centre, Canning Vale, Australia) ble plassert i grupper på fem, med fri tilgang til standard chow og vann gjennom hele studien, veies ukentlig for å bestemme forbruket . Omgivelsestemperaturen ble kontrollert ved 22 ° C ± 2 ° C ved 40-60% fuktighet, med en 12-timers lys /mørke syklus. Mus ble injisert med tidligere fremstilte celler, og tilfeldig delt inn i 4 grupper, bestående av EPA behandling (EPAX, Ålesund, Norge, 0,4 g /kg /dag, n = 9 [EPA]), oksypurinol behandling (Sigma-Aldritch, Castle-Hill , Australia, 1 mmol /liter i drikkevann, n = 9), slik kombinasjonsbehandling (i henhold til EPA og oksypurinol grupper n = 9), eller cancer cachexia kontrollgruppen (n = 13). Dyrene ble overvåket daglig for endringer i kroppsvekt og tumorstørrelser målt ved bruk av målepunktene. Mus ble avsluttet ved sodium pentobarbital injeksjon (30 mg /kg) (Virbac Animal Health, Regents Park, Australia) på 29 dager, da vekttap nådd 25%, eller tumorstørrelse nådde 1000 mm
3, avhengig av hva som skjedde først. Muskelvev, inkludert gastrocnemius, soleus, plantarus, tibialis anterior (TA), og quadriceps, ble fjernet og veid. Alle prøver ble hurtigfrosset og lagret ved -80
° C for videre analyse.
oksidativt stress
En ELISA-kit ble anvendt for å måle DNA-oksydasjon biprodukt 8-hydroksy-2-deoksy guanosine (8-OH-2DG) (StressMarq biovitenskap, Victoria, Canada) som en markør for oksidativt stress [32]. DNA ble ekstrahert fra 10 mg gastrocnemius muskelen ved anvendelse av en DNA isolasjonskit (Promega, Sydney, Australia). Hver prøve ble deretter fortynnet slik at 50 ug DNA ble anvendt i 8-OH-2DG analysen. Den konkurrerende immunoanalyse involverer binding av fri 8-OH-2DG til et antistoff belagte 96-brønners plate. Analysen og prøve konsentrasjonen av 8-OH-2DG ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
Gene Expression
Total RNA ble ekstrahert fra 10 mg av frossen gastrocnemius muskelen bruker TRI reagens (Astral Scientific, Sydney, Australia) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Den totale RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved A260 /A280 måling. Ett mikrogram av total RNA ble revers transkribert til cDNA ved anvendelse av AMV revers transkriptase første tråd cDNA syntese kit ifølge produsentens protokoll (Märligen Biosciences, Sydney, Australia). Real-Time PCR ble utført ved hjelp av en Bio-Rad IQ5 deteksjonssystem, med reaksjoner utføres med SYBR Grønn Supermix (Bio-Rad, Sydney, Australia). Primere ble utformet ved hjelp av Primer 3, og hentet fra GeneWorks (Hindmarsh, Australia, se tabell 2). Forsterkningen av cDNA prøvene ble utført ved hjelp av IQ SYBR grønn ™ etter produsentens protokoller (BioRad, Sydney, Australia) Fluorescent utslippsdata ble fanget og mRNA nivåer ble analysert ved hjelp av den kritiske terskelen (CT) verdi [35]. Termisk sykling og fluorescens deteksjon ble utført ved hjelp av BioRad IQ5 sekvens deteksjonssystem (BioRad, Sydney, Australia). Prøvene ble normalisert for cDNA konsentrasjonen bestemmes med OliGreen (Invitrogen, Mulgrave, Australia) [36]
Protein Enzymaktivitetsanalyse
gastrocnemius muskelen vevsprøver (20 mg) ble homogenisert og sentrifugert ved 10 000
g
ved 4 ° C i 10 minutter. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden (BioRad, Sydney, Australia). Total SOD, glutationperoksidase (gpx), ble katalase, og XO aktivitet målt med kommersielle enzym analysesett som per produsentens instruksjoner (Sapphire Bioscience, Waterloo, Australia, Invitrogen, Mulgrave, Australia).
Statistikk
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistikk versjon 17.0 (IBM, Chicago, USA) eller GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA), med resultater uttrykt som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM) og vurderes statistisk signifikant hvis p 0,05, med mindre annet er angitt. Data ble analysert ved bruk av to-veis ANOVA, med en Tukey test post hoc-analyse utført for å bestemme forskjeller mellom gruppene når det er hensiktsmessig. Korrelasjon ble analysert ved hjelp av Pearsons Test vekt-tap av data ble analysert ved hjelp av gjentatte målinger ANOVA med Bonferroni post hoc-analyse.
