Abstract
Bakgrunn
ekstracellulære matriks (ECM) ombygging hovedsakelig skjer ved fibroblaster ved hjelp av intracellulære og ekstracellulære veier. Selv om det er velkjent at ekstracellulære nedbrytning av ECM ved proteaser avledet fra kreftceller forenkler cellulær invasjon, har den intracellulære degradering av ECM-komponenter av kreftceller ikke er klarlagt. Hensikten med denne studien var å karakter kollagen intern, som er det første trinnet av den intracellulære nedbrytningsveien i bukspyttkjertelen kreftceller, i lys av epitelial-mesenchymale overgang (EMT).
Metodikk /hovedfunnene
Vi analyserte funksjon av kollagen intern i to bukspyttkjertelkreft cellelinjer, SUIT-2 og KP-2, og bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler) med Oregon Grønn 488-gelatin. PSC avtaler hadde en sterk evne til kollagen opptak, og kreft i bukspyttkjertelen celler også internalisert kollagen men mindre effektivt. De kollagen internalisering evner SUIT-2 og KP-2-celler ble fremmet av EMT indusert av menneskelige rekombinante transformerende vekstfaktor β1 (
P
0,05). Uttrykk for Endo180, en kollagen opptak reseptor, var høy i mesenkymale bukspyttkjertelkreft cellelinjer, som bestemmes av EMT markør uttrykk (
P
0,01). Kvantitativ RT-PCR og Western blot analyser viste at Endo180 uttrykk ble også økt med EMT induksjon i SUIT-2 og KP-2 celler. Endo180 knockdown av RNA interferens svekket kollagen opptak (
P
0,01) og invasive evner (
P
0,05). Dress-2 og KP-2 celler
Konklusjoner /Betydning
kreft i bukspyttkjertelen celler er i stand til kollagen intern, som forsterkes av EMT. Dette ECM klaring system kan være en ny mekanisme for cellulær invasjon og en potensiell terapeutisk mål i bukspyttkjertelkreft
Citation. Ikenaga N, Ohuchida K, Mizumoto K, Akagawa S, Fujiwara K, Eguchi D, et al. (2012) kreft i bukspyttkjertelen celler styrke evnen til Collagen Intern under Epitelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE syv (7): e40434. doi: 10,1371 /journal.pone.0040434
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 16 februar 2012; Akseptert: 6 juni 2012; Publisert: 05.07.2012
Copyright: © 2012 Ikenaga et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av en bevilgning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan, Uehara Memorial Foundation og Fukuoka Foundation for god helse. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de mest dødelige kreftformer, og sin 5-års overlevelse er bare 5% [1]. Det er preget av overdreven desmoplasia med rikelig ekstracellulære matriks (ECM), som spiller en avgjørende rolle i sin aggressive oppførsel [2], [3]. ECM innen pankreastumorer er hovedsakelig produsert av aktiverte fenotype av bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler), og ECM ombygging av PSC avtaler og kreft i bukspyttkjertelen celler er en av de viktigste trinnene under kreft progresjon [2], [4], [5]. Hittil har en rekke ekstracellulære proteaser avledet fra kreftceller blitt identifisert som bidragsytere til kreft invasjon og progresjon, inkludert matriksmetalloproteinaser (MMP), en disintegrinproteinet og metalloproteinaser (Adams) og urokinase plasminogen aktivator [6].
kollagener er de mest tallrike ECM komponentene i kroppen og er under kontinuerlig syntese og nedbrytning under fysiologiske og patologiske tilstander. Stromale fibroblaster, som er de primære celler for å opprettholde homeostase ECM, nedbrytes kollagen fibriller intracellulært i tillegg til den ekstracellulære nedbrytningen mediert av flere proteaser [7], [8]. Det første trinnet av kollagen opptaket i bindingen av kollagen til membran-reseptorer, slik som α
2β
1-inte [7], [9] og Endo180 [10], etterfulgt av påfølgende endocytose, transport til lysosomene og degradering av lysosomale cystein katepsin [11]. Endo180 er et medlem av makrofagen mannosereseptoren familie utsatt for konstitutiv internalisering og gjenvinning av [12] og er essensiell for cellulært opptak av kollagen i fibroblaster [10]. Nylig, Endo180 ble funnet å bli uttrykt i ikke bare fibroblaster men også en undergruppe av neoplasmer, inkludert glioblastom [13] og basal-lignende bryst-tumorer [14].
Epithelial-mesenchymale overgang (EMT) er en utviklingsprosess hvor polarisert epitelceller bytte til en svært bevegelige mesenchymale fenotype til å gjennomgå mange biokjemiske endringer [15]. I epithelial kreft, er EMT induksjons en sentral prosess i kreft progresjon, og gir kreftceller med invasive og metastaserende evner. Redusert ekspresjon av E-cadherin, en av de epiteliale markører, indikerer mesenchymale overgang av epiteliale kreftceller, og er involvert i dårlig prognose av kreft i bukspyttkjertelen [16]. EMT-relaterte molekyler er også forventet å være terapeutiske mål.
Basert på disse linjer av bevis for at fibroblaster har en sterk evne til å degradere kollagen og at mesenchymale fenotype er forbundet med kreft invasjon, vi antatt at kreft i bukspyttkjertelen celler også internal kollagen, som ligner på fibroblaster, og styrke deres invasive evne ved å gjennomgå EMT. Til dags dato har ekstracellulært degradering regulert av ekstracellulære proteaser, inkludert MMP, avledet fra kreft i bukspyttkjertelen celler blitt godt etablert. Imidlertid har den intracellulære nedbrytningen av kollagen ved kreft i bukspyttkjertelen celler ikke blitt dokumentert. Vi undersøkte om kreft i bukspyttkjertelen celler har evnen til å internalisere kollagen i en
in vitro
studie, og vurdert effekten av kollagen intern på bukspyttkjertelkreft invasjon i lys av EMT.
Resultater
Ikke bare PSC avtaler, men også kreft i bukspyttkjertelen celler har evnen til å internalisere kollagen
Vi etablerte
in vitro
pscs fra resected bukspyttkjertel kreft for å undersøke om PSC avtaler har funksjonen av kollagen opptak, tilsvar til fibroblaster. Identiteten til de aktiverte pscs ble bekreftet ved immunhistokjemisk farging for vimentin og α-glattmuskel aktin (α-SMA) som tidligere beskrevet [17]. Oregon Grønn 488-gelatin (OG-gelatin), en denaturert form av kollagen, ble visualisert i cytoplasma av pscs etter inkubasjon i 2 timer (figur 1A), og flowcytometri analyser viste at mer enn 95% av pscs hadde internalisert kollagen ( Figur 1B). Pancreatic kreft cellelinjer SUIT-2 og KP-2 var også i stand til å internalisere mors kollagen jeg, men mindre effektivt (figur 1B). Konfokalmikroskopi analyser bekreftet intracellulær lokalisering av OG-gelatin i kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 1C). Spesielt spindelformede cancerceller med et mesenchymale morfologi syntes å internal kollagen sterkt. Celler inkubert med fluorescens-konjugert bovint serumalbumin (fluorescein-BSA) som en kontroll inneholdt ingen signaler i både fluorescens mikrofotografering og flowcytometri (data ikke vist).
(A) Representative mikrofotografi av immunfluorescens farging av α- SMA i PSC avtaler. De PSC avtaler har en stellignende eller spindel-formet morfologi og hurtig α-SMA (rød). De PSC avtaler har internalisert mange kollagen molekyler (grønt). Skala: 100 mikrometer. Original forstørrelse: × 200. (B) Strømningscytometri analyser av pscs, Suit-2-celler og KP-2-celler etter inkubasjon med OG-gelatin i 2 timer. Hver prøve ble analysert i triplikat, og prosentandelene av kollagen-internalisert celler er vist som gjennomsnitt ± SD i de representative figurer. (C) konfokalmikroskopi bilder av kollagen i cytoplasma av SUIT-2 og KP-2 celler. Cellene ble inkubert med OG-gelatin (grønn), fiksert og farget med Alexa Fluor 647-konjugert phalloidin (rød) for å visualisere celle skisserer. Ortogonale seksjoner i XY, XZ og YZ flyene vises. Y og Z-aksene viser lokalisering av internalisert kollagen mer tydelig (pilspisser). Spesielt spindelformede cancerceller med et mesenchymale morfologi inneholder mange kollagenmolekyler (piler). Skala barer: 100 mikrometer. Original forstørrelse. × 400
EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler forbedrer deres kollagen intern
Vi har undersøkt om EMT i kreft i bukspyttkjertelen celler er assosiert med funksjonen av kollagen intern, fordi PSC avtaler, som har en mesenchymale fenotype, har en sterk evne til kollagen internalisering. For EMT induksjon i kreftceller, anvendte vi transformerende vekstfaktor (TGF) -β1, noe som er en vesentlig faktor under EMT med mange samvirkende roller [15]. Kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med TGF-β1 viste en spindel-formet fibroblastisk morfologi og celle spredning sammenlignet med ubehandlede kreftceller (figur 2A). Western blotting analyser viste at E-cadherin uttrykk ble redusert og vimentin uttrykk ble økt i SUIT-2 og KP-2 celler etter behandling med TGF-β1 (figur 2B). Disse funnene indikerer at kreft i bukspyttkjertelen celler endret til en mesenchymale fenotype, noe som betyr at EMT ble indusert av TGF-β1. De kollagen internalisering evner av Suit-2 og KP-2-celler ble fremmet av EMT induksjon med TGF-β1 behandling i 72 timer (
P
0,05, figur 2C, 2D).
(A) Suit-2 og KP-2-celler blir transformert til et spindelformet morfologi etter behandling med TGF-β1 i 72 timer. Skala barer: 100 mikrometer. Original forstørrelse: × 200. (B) Western blot-analyse som viser at E-cadherin ekspresjon blir redusert og vimentin ekspresjon økes inne farge-2 og KP-2-celler med TGF-β1 behandling. De fold forskjeller i de representative immunoblotter kvantifisert ved densitometri er vist under de respektive baner. unt: ubehandlet. (C) Suit-2 og KP-2-celler ble dyrket med eller uten TGF-β1 i 72 timer, etterfulgt av inkubasjon med OG-gelatin (grønn) i 2 timer. Cellene ble fiksert og farget med Alexa Fluor 647-konjugert phalloidin (rød) for å visualisere celle skisserer. Fluorescens mikroskopi avslører at kollagenet internalisert etter farge-2 og KP-2-celler økes etter behandling med TGF-β1. Skala barer: 100 mikrometer. Original forstørrelse: × 400. (D) Kvantitative data for kollagen internalisering ved hjelp av sort-2 og KP-2-celler bestemt ved strømningscytometri åpenbarer signifikante forskjeller i kollagen-opptaket evnen mellom ubehandlet og TGF-β1-behandlede kreftceller. Hver cellelinje ble analysert i triplikat og prosentandelene av kollagen-internalisert celler er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger mellom ubehandlede og TGF-ß1-behandlede celler ble utført ved anvendelse av Students
t
-test. Alle forsøkene ble utført mer enn tre ganger og representative bildene blir vist.
Endo180 uttrykk er forbundet med mesenchymale fenotype av kreft i bukspyttkjertelen celler
Neste, vi analyserte uttrykk nivåer av EMT markører, inkludert E-cadherin og vimentin, den store collagen reseptor α2β1-integrin og kollagen opptak reseptoren Endo180 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer for å avklare forholdet mellom EMT og kollagen internalisering. De bukspyttkjertelkreft cellelinjer uttrykte ulike nivåer av EMT markører, α2β1-integrin og Endo180 (figur 3A). Først brukte vi forholdet mellom E-cadherin til vimentin å klassifisere cellene som epitel eller mesenchymale fenotype, og deretter sammenlignet nivåene av α2-integrin, β1-integrin og Endo180 uttrykk mellom cellene klassifisert i de to fenotyper. Endo180 ble mer høyt uttrykt i mesenkymale bukspyttkjertelkreft cellelinjer enn i de epiteliale bukspyttkjertelkreft cellelinjer, mens uttrykket av β1-integrin og α2-inte ikke var korrelert med celle fenotyper (
P
0,01 Figur 3B). Ekspresjonen av Endo180 mRNA inne farge-2 og KP-2-celler ble oppregulert ved EMT induksjon med TGF-β1 behandling, sammen med økningen i celleoverflate-ekspresjon av Endo180 fra 9,3 ± 0,1% til 19,9 ± 2,4% i Suit-2-celler og fra 19,1 ± 1,0% til 24,8 ± 1,5% i KP-2 celler (
P
0,01, Figur 3C).
(A) Relative uttrykk nivåer av E-cadherin, vimentin , Endo180, β1-integrin og α2-integrin i 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer og fire PSC kulturer. Uttrykket nivåer av alle gener ble normalisert ved de tilsvarende uttrykk nivåer av β-aktin. Hver prøve ble analysert i triplikat, og dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. En femtedel av de oppkjøpte nivåer for E-cadherin og Endo180 vises i grafen for enkel referanse. (B) i pankreas kreft cellelinjer ble delt i to grupper som viser en epitelial fenotype (SW1990, HS766T, BxPC-3, CAPAN-en og ASPC-1) og en mesenchymale fenotype (SUIT-2, CFPAC-en, MIA PaCa- 2, Panc-1 og KP-2) på grunnlag av uttrykket forholdet mellom E-cadherin til vimentin. Endo180 er mer høyt uttrykt i cellelinjene med mesenchymale fenotype enn i de med epitelial fenotype, mens uttrykk for β1-integrin og α2-inte ikke er korrelert med celle fenotyper. Statistiske analyser ble utført med Mann-Whitney
U
-test. (C) Suit-2 og KP-2-celler ble inkubert med eller uten TGF-β1 i 72 timer, og uttrykket nivåer av Endo180, ble β1-integrin og α2-integrin bestemt ved kvantitativ RT-PCR (øvre panel). Uttrykket nivåer av alle gener ble normalisert ved de tilsvarende uttrykk nivåer av 18S rRNA. Brette endringer ble beregnet som den mRNA-nivåer i TGF-ß1-behandlede celler dividert med nivåene i ubehandlede celler. Endo180 mRNA uttrykk i SUIT-2 og KP-2 celler er mer høyt økt med EMT induksjon enn β1-integrin og α2-inte mRNA uttrykk. Økt celleoverflaten uttrykk for Endo180 i EMT-indusert SUIT-2 og KP-2 celler (røde linjer) sammenlignet med ubehandlet SUIT-2 og KP-2 celler (blå linjer), henholdsvis, ble bekreftet av flowcytometri analyser (
P
0,01 for hver; nedre paneler). Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer, og sammenligninger mellom ubehandlet og TGF-P1-behandlede celler ble utført ved hjelp av Student
t
-test.
knockdown av Endo180 i kreft i bukspyttkjertelen celler demper deres kollagen opptak og invasive evner
For å undersøke om Endo180 uttrykket er assosiert med kollagen opptak av kreft i bukspyttkjertelen celler, vi slått ned Endo180 mRNA i SUIT-2 og KP-2 cellene ved hjelp av RNA-interferens teknologi. Transient transfeksjon av siEndo180-1 og siEndo180-2 redusert Endo180 uttrykk på både mRNA og proteinnivå (Figur 4A). Cellen morfologi av Suit-2 og KP-2 celler ble ikke endret etter Endo180 knockdown. De kollagen internalisering evner SUIT-2 og KP-2 celler under behandling med TGF-β1 ble dramatisk svekket ved undertrykkelse av Endo180 uttrykk (
P
0,01; Figur 4B). I tillegg, 3D kollagen matrise analyser viste at EMT-indusert kreftceller vises en mindre invasiv fenotype når Endo180 uttrykk ble undertrykt med siRNA. TGF-β1 likevel forbedret invasjon av kreftceller i nærvær av kontroll siRNA (Figur 5A, 5B). På den annen side ble Endo180 uttrykk ikke er involvert i celle-proliferasjon og migrering av farge-2 og KP-2-celler (data ikke vist).
(A) Suit-2 og KP-2-celler ble transfektert med siEndo180-1 eller siEndo180-2, og knockdown av Endo180 ekspresjon sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler ble bekreftet ved kvantitativ RT-PCR (øvre panel) og western-blotting-analyse (nedre panel) i minst 3 dager. (B) Ved å følge EMT induksjon med 10 ng /ml TGF-β1, ble dress 2 og KP-2-celler inkubert med OG-gelatin i 2 timer. Prosentandelene av OG-gelatin-internaliserte celler ble evaluert ved flow cytometri. Dot tomter viser representative flowcytometri data for ubehandlet SUIT-2 og KP-2 celler og celler transfektert med kontroll siRNA, siEndo180-1 eller siEndo180-2 (øverste panelene). De kollagen internalise score representerer de relative forholdene mellom kollagen internalisert celler blant celler transfektert med kontroll siRNA, siEndo180-1 eller siEndo180-2 til de i ubehandlede celler. De forbedrede kollagen internalisering evner i SUIT-2 og KP-2 celler etter TGF-β behandling er dramatisk redusert med knockdown av Endo180 uttrykk (nedre panel). Hver prøve ble analysert i triplikat, og sammenligninger mellom TGF-ß1-behandlede celler transfektert med kontroll siRNA og andre celler ble utført ved anvendelse av Students
t
-test. *
P
0,01; **
P
. 0,001
SUIT-2 og KP-2 celler (4 × 10
4 celler /brønn) transected med sirnas ble suspendert i 50 mikrogram 3D type i kollagen matriks, og sådd ut i de øvre kamrene, med eller uten TGF-β1. Etter gel-dannelse av inkubering ved 37 ° C i 30 minutter, ble den øvre kammer plassert i brønnene av en 24-brønners kulturskål inneholdende 750 ul 10% FBS /DMEM. Cellene som invaderte til den nedre overflate av hver øvre kammer membran gjennom kollagen-matriksen ble fiksert, farget med hematoksylin og eosin, og telles. (A) Representative photomicrographs av invaderende SUIT-2 og KP-2 celler transfektert med kontroll siRNA, siEndo180-1 eller siEndo180-2. Skala barer, 100 mikrometer. Original forstørrelse, × 200. (B) De invasive evnene til Suit-2 og KP-2-celler blir økt med EMT induksjon, men dempes ved knockdown av Endo180 uttrykk. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer, og sammenligninger mellom to grupper ble utført ved hjelp av Student
t
-test. *
P
0,05; **
P
0,01; ***
P
0,001. (C) Kollagen internalise score i SUIT-2 og KP-2 celler etter coculture med PSC avtaler i 72 timer. De kollagen internalisering evner er noe forbedret i Suit-2 og KP-2 celler via kreft-stroma interaksjoner. Forsøkene ble utført i tre eksemplarer, og sammenligninger mellom data ble utført ved hjelp av Student
t
-test. *
P
0,05; **
P
. 0,01
PSC avtaler forbedre kollagen intern av kreft i bukspyttkjertelen celler
Til slutt undersøkte vi om pscs hadde en innvirkning på kollagen intern ved kreft i bukspyttkjertelen celler, siden pscs er kjent for å fremme utviklingen og EMT av kreft i bukspyttkjertelen via kreft-stromaceller interaksjoner [18], [19]. De kollagen internalisering evner SUIT-2 og KP-2 celler cocultured med PSC avtaler ble litt forbedret sammenlignet med de i de monocultured kreftceller (
P
0,05 og
P
0,01, henholdsvis figur 5C). Disse funnene tyder på at kreft-stroma interaksjoner også fremme kollagen opptak av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Diskusjoner
Invasjon av kreftceller, et avgjørende skritt i kreft progresjon, består av ECM degradering og påfølgende migrasjon av kreftceller til nydannede ekstracellulære rom. MMP’er har vært ansett som de store proteaser som er i stand til å nedbryte forskjellige komponenter ECM å hjelpe til tumorprogresjon, og anses å være lovende mål for cancerterapi [20], [21]. Men de fleste kliniske studier av MMP-hemmere gitt skuffende resultater med begrenset suksess [22], [23]. I denne studien, har vi vist at ikke bare ekstracellulære nedbrytningen av ECM men også intracellulært opptak av ECM-komponenter kan være involvert i cellulær invasjon. En proteolyse system som involverer nedbrytning av internalisert kollagen ved lysosomal cystein katepsin har også blitt observert i flere maligniteter og ble rapportert å være knyttet til tumorinvasjon og metastase [24], [25], [26]. Quintanilla-Dieck et al. [27] viste at cathepsin K i melanom regulerer invasjon av medier intracellulær degradering av ECM-komponenter. Immunhistokjemiske analyser av kreft i bukspyttkjertelen vev viste at uttrykk for cathepsin B og cathepsin L er indikatorer på en dårlig prognose [28]. Disse linjene av bevis kan tyde på at for cellulær invasjon, er det nødvendig å skape et rom for å flytte inn ved å internal og nedverdigende ECM komponenter intracellulært i tillegg til sin pericellulær degradering. Clearance system av ECM komponenter utstilt ved kreftcellene er potensielt en ny mekanisme for invasjonen i bukspyttkjertelkreft.
EMT anses å være et viktig skritt i kreft progresjon, selv om dens betydning og relevans har vært en del debatt [15]. Tap av celle-celle adhesjon, endringer i celleform og økt bevegelighet fører til invasjon av kreftceller gjennom basalmembranen inn i stromal vev [15], [29]. EMT-indusert celler blir vanligvis sett på invasiv foran primære svulster, og utvikle seg til etterfølgende trinn av dyp migrasjon inn i ECM, intravasation, transport gjennom sirkulasjonen og dannelse av mikrometastaser [30]. I tykktarmskreft, har små aggregater av tumorceller som strekker seg fra tumormassen inn i den tilstøtende stroma er vist som morfologiske tegn på EMT ved invasiv fronter av kreft hos mennesker [31]. Rhim et al. [32] viste at det merkede ondartede epitelceller invadert inn i stroma via EMT og blandet med stromale celler ved anvendelse av en genetisk musemodell med spontan kreft i bukspyttkjertelen. Vi fant at EMT-indusert kreft i bukspyttkjertelen celler kan fremme deres invasive evne ved ikke bare å øke bevegelighet, men også styrke kollagen intern. Kollagen intern kan være en av de medvirkende faktorer til kreft progresjon som tilbys av EMT, og disse cellepopulasjoner i stand til kollagen opptak kan være ledende celler for invasjon. I fibroblaster, α
2β
1-integrin er ansett å være viktig for cellulære interaksjoner med kollagen og har blitt foreslått å spille en rolle i internalisering prosessen [33]. Men i vår studie, α
2β
1-inte uttrykk ble ikke involvert i celle fenotyper av bukspyttkjertelkreft cellelinjer og ble ikke økt i EMT-indusert SUIT-2 og KP-2 celler. I henhold til eksperimenter ved bruk av et anti-β
1-integrin-antistoff og Endo180-manglende fibroblaster [8], er det Endo180-mediert adhesjon av fibroblaster til kollagen matriser et β
1-integrin-uavhengig prosess. Til sammen kan cellular invasjon forsterket av EMT tilskrives Endo180 alene og ikke til a
2β
1-inte.
desmoplasia i bukspyttkjertelkreft manifesterer seg som band av fibrøst stroma som omgir kreftceller, noe som resulterer i en økning i fibrillære kollagener. Dette fibrøse stroma er hovedsakelig sammensatt av kollagen type I, som ble rapportert å fremme proliferasjon, migrering og chemoresistance i kreft i bukspyttkjertelen celler [2], [34]. På den annen side, viste tumor utsatt mus med Endo180-manglende fibroblaster økt akkumulering av kollagen i tumorene [35], og mus implantert med brystcancer-celler som uttrykker en internalise-defekt mutant Endo180 hadde øket intratumoral fibrose [14]. Disse funnene ble korrelert med en reduksjon i kollagen internalisering og redusert kollagen omsetning, til slutt resulterer i begrenset tumorvekst. I vår studie, pscs hadde en sterk evne til kollagen intern, og Endo180-tilstrekkelige kreft i bukspyttkjertelen celler viste sterkere invasjon enn Endo180-manglende celler. Derfor kan ECM omsetningen mediert ved Endo180 være avgjørende for svulstvekst og progresjon av kreft.
Som konklusjon, ikke bare mesenchymale pscs men også kreft i bukspyttkjertelen celler har evnen til å internal kollagen. Kollagen internalisering av kreftceller ble forbedret i forbindelse med EMT. Knockdown av kollagen opptak reseptoren Endo180 opphevet kollagen intern av kreftceller og redusert sine invasive evner. Denne tidligere verdsatt invasiv mekanismen for kreft i bukspyttkjertelen celler må videre avklares for å identifisere nye terapeutiske mål for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Cells og kulturforhold
Følgende 10 bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble brukt: ASPC-en, KP-2, Panc-1, SUIT-2, BxPC-3 (Dr. H. Iguchi, National Shikoku Cancer Center, Matsuyama, Japan), MIA Paca-2 (japansk Cancer Resource Bank), CAPAN-en, CFPAC-en, HS766T og SW1990 (American Type Culture Collection). Humane pscs ble isolert fra frisk pankreas cancer kirurgiske prøver ved hjelp av utveksten metoden som er beskrevet tidligere [36], [37]. Primære kulturer av humane pscs avledet fra fire pasienter med invasive bukspyttkjertel kreft ble etablert i vårt laboratorium med skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av etikkomiteen av Kyushu University og gjennomført i henhold til de etiske retningslinjene for Human Genome /Gene Forskning vedtatt av den japanske regjeringen og Helsinki-deklarasjonen. Identiteten til pscs ble bekreftet ved immunofluorescens farging for α-SMA (positive rate: nesten 100%) og vimentin (positiv hastighet: nesten 100%) og morfologi (stellignende eller spindelformede celler) [17]. Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin (100 ug /ml) og penicillin (100 ug /ml) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære innehold 10% CO
2.
Collagen internalise assay
cellene ble sådd ut i 90-mm skåler i en tetthet på 1 x 10
5-celler /skål og inkubert i 1% FBS /DMEM med eller uten 10 ng /ml rekombinant humant TGF-β1 (R 1:100 fortynning) i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon med Alexa Fluor 647-konjugert anti-kanin-IgG (Molecular Probes) i 1 time. Nukleær DNA ble motfarget med 0,05 ug /ml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol. En laser-scanning confocal fluorescens mikroskop (A1R, Nikon) ble brukt for immunfluorescens mikrofotografering. Bilder ble administrert ved hjelp av NIS-Elements (Nikon).
Isolering av RNA
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp av en høy Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) med DNase (Roche diagnostikk) behandling. Det ekstraherte RNA ble kvantifisert ved absorbansen ved 260 nm, og dets renhet ble bedømt fra den 260/280 forholdet mellom absorbans med et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies).
kvantitativ revers-transkripsjon-polymerasekjedereaksjon reaksjon (RT-PCR)
Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av en QuantiTect SYBR Grønn Reverse-transkripsjon PCR Kit (Qiagen) og en Chromo4 real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Vi har utformet spesifikke primere for E-cadherin og vimentin hjelp Primer 3 programvare og utført BLAST søker å sikre primer særegen. Primere for Endo180, β1-integrin, α2-integrin, β-actin og 18S rRNA ble innkjøpt fra Takara Bio Inc. Sekvensene til primerne som anvendes i denne studien er vist i tabell 1. Hver reaksjonsblanding ble først inkubert ved 50 ° C C i 30 min for å tillate revers transkripsjon, hvor første-tråd cDNA ble syntetisert ved priming av total RNA med en gen-spesifikk primer. PCR ble initiert ved inkubering ved 95 ° C i 15 min for å aktivere polymerase, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sekunder (for E-cadherin og vimentin) eller 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 20 s og 72 ° C i 30 sekunder (for Endo180, β1-integrin, α2-integrin, β-actin og 18S rRNA). Uttrykket nivåer av genene ble beregnet på grunnlag av standard kurver konstruert med total RNA fra SUIT-2-celler. Uttrykket nivåer ble normalisert ved β-aktin eller 18S rRNA uttrykk og uttrykt som forholdet av ekspresjon av målgenet som for β-aktin eller 18S rRNA. Alle prøver ble kjørt i triplikat. Ingen påvisbare PCR produktene ble forsterket uten revers transkripsjon. Nøyaktigheten og integriteten av PCR produktene ble bekreftet med en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc.).
Flowcytometri
dyrkede celler ble høstet ved eksponering for trypsin /EDTA for 5 minutter ved 37 ° C, og vasket i 10% FBS /DMEM. De oppnådde enkeltceller ble suspendert i iskald 1% FBS /PBS-oppløsning og analysert ved anvendelse av et strømningscytometer (EC800; SONY) er utstyrt med en laser som ga en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm. Eclipse Analyse programvare (SONY) ble brukt til å kvantifisere de fluorescerende signaler og sette de logiske elektroniske-gating parametere.
Invasion analyse i et 3D kollagen jeg matrise og migrasjon analysen
invasivitet av kreft i bukspyttkjertelen cellene ble bedømt på grunnlag av antallet celler som invaderer gjennom Transwell kamre (BD Biosciences) i henhold til 3D-dyrkningsbetingelser i et kollagen i matrise.
