Abstract
Prostatakreft er den vanligste kreftformen for menn i den vestlige verden, og nye tilnærminger for prostatakreft risikoreduksjon er nødvendig. Plante-avledet fenoliske forbindelser dempe prostatakreft vekst i prekliniske modeller av flere mekanismer, som er i tråd med epidemiologiske funn som tyder på at forbruket av plantebasert kosthold er assosiert med lav risiko for prostatakreft. Målet med denne studien var å vurdere effekten av en roman Lignan-stilbenoid blandingen i PC-3M-luc2 menneskelige prostata kreft celler
in vitro Hotell og i ortotopiske xenografter. Lignan og stilbenoid rik ekstrakt ble hentet fra furu (
Pinus sylvestris
) knop. Pine knute ekstrakt samt stilbenoids (metyl pinosylvin og pinosylvin), og lignans (matairesinol og nortrachelogenin) til stede i furu knute ekstrakt viste antiproliferative og proapoptotiske effekt på ≥40 mikrometer konsentrasjon
in vitro
. Videre furu knute utdrag hentet stilbenoids forbedret tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) indusert apoptose allerede på ≥10 mikrometer konsentrasjoner. I orthotopic PC-3M-luc2 xenograft bærende immunocompromized mus, ble tre ukers peroral eksponering for furu knute ekstrakt (52 mg av lignans og stilbenoids per kg kroppsvekt) godt tolerert og viste anti-tumorigen effekt, demonstrert av multivariat analyse kombinere avgjørende markører for tumorvekst (dvs. tumorvolum, vaskularisering, og celle-proliferasjon). Metyl pinosylvin, pinosylvin, matairesinol, nortrachelogenin, samt resveratrol, en metabolitt av pinosylvin, kunne påvises i serum ved total konsentrasjon på 7-73 uM, noe som bekrefter at biotilgjengeligheten av furu knute ekstrakt avledet lignaner og stilbenoids. Oppsummert viser våre data at furu knute ekstrakt er en ny og kostnadseffektiv kilde til resveratrol, metyl pinosylvin og andre bioaktive lignans og stilbenoids. Pine knute ekstrakt viser anticarcinogenic effekt i prekliniske prostatakreft modell, og vår
in vitro
data tyder på at forbindelser avledet fra avtrekks kan ha potensial som romanen chemosensitizers til TRAIL. Disse funnene fremme videre forskning på helserelaterte anvendelser av tre biokjemikalier
Citation. Yatkin E, Polari L, Laajala TD, Smeds A, Eckerman C, Holmbom B, et al. (2014) Novel Lignan og Stilbenoid Blanding Viser anticarcinogenic Effekt i prekliniske PC-3M-luc2 Prostate Cancer Model. PLoS ONE 9 (4): e93764. doi: 10,1371 /journal.pone.0093764
Redaktør: Rajesh Agarwal, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 13 januar 2014; Godkjent: 08.03.2014; Publisert: 03.04.2014
Copyright: © 2014 Yatkin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av FIBIC finske bioøkonomi Cluster, den BioRefine program finske Finansiering Agency for teknologi og innovasjon, og Academy of Finland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen for menn i Nord-Amerika, Vest-Europa, Øst-Europa, og Skandinavia. Den lange naturlige historie PCa presenterer et relativt bredt tidsvindu for kosttilskudd eller farmakologiske tiltak som kan manifestere seg som reduksjon i forekomst, tilbakefall, sykelighet eller progresjon av sykdommen [1]. Foreslåtte modifiserbare risikofaktorer for PCa som gir potensielle mål for forebyggelse inkluderer betennelse, steroide hormoner og deres reseptorer, fedme, hyperkolesterolemi og kostfaktorer [2]. Naturlige fenoliske forbindelser, som innehar anticarcinogenic egenskaper, kan gi interessante muligheter for reduksjon av kreftbelastning [3], [4]. Imidlertid er flere data om deres effekt og virkningsmekanismer trengte fra relevante prekliniske modeller, for å velge de optimale forbindelser eller blandinger for kliniske forsøk og produktutvikling.
Trær er en rik kilde til fenoliske forbindelser, strukturelt identisk eller lik de i spiselige planter [5]. Disse forbindelser kan lett bli isolert fra tre av hydrofil ekstraksjon etter fjerning av de lipofile ekstraktene av heksanekstraksjon [6]. Wood-avledet ekstrakter er således en kostnadseffektiv kilde til naturlige fenoliske forbindelser, og et attraktivt alternativ for utvikling av nye sunne produkter.
Plant fenoler, som lignaner og stilbenoids, modulere flere viktige biologiske prosesser i pattedyrceller [7], [8], og viser anticarcinogenic egenskaper i prekliniske modeller PCA. Rug eller linfrø-inneholdende dietter, som har et høyt innhold lignan, samt en diett supplert med en tre-avledet plante lignan, 7-hydroxymataresinol (HMR), hemmer veksten av PCa i
in vivo product: [ ,,,0],9], [10], [11], [12]. På samme måte, plante-avledet stilbenoids, resveratrol (RV) og pterostilbene har blitt rapportert å undertrykke veksten av PCa
in vivo product: [13]. Flere mulige mekanismer, ved hvilke lignaner og stilbenoids kan utøve sine anticarcinogenic handlinger i PCa har blitt identifisert, inkludert cellesyklus-stans og induksjon av apoptose [14], [15], inhibering av celleproliferasjon [16], [17], tumor vaskularisering [18], modulering av cytokin profil [19], og sensibilisering av kreftceller til programmert celledød [20], [21], [22].
tumornekrosefaktor-Related apoptose-induserende ligand (TRAIL ) -mediert apoptose er nylig blitt identifisert som en interessant mål for lignaner og stilbenoids. TRAIL er et protein som fungerer som en ligand, som aktiverer en død-signalveien spesielt i kreftceller, med minimal toksisitet for normale vev [23]. Motstand mot TRAIL er vanlig i PCA og forbindelser som sensitize PCa til TRAIL er for tiden under aktiv etterforskning. Interessant, lignans, slik som matairesinol (MR), og nortrachelogenin (NTG), så vel som RV øke antitumoraktivitet av TRAIL i PCA-celler [21], [22] eller xenografter [18].
Experimental studier tyder dermed på at naturlige lignans og stilbenoids dempe PCa vekst via en rekke virkningsmekanismer. Det er derfor rimelig å foreslå at kombinasjonen av de to gruppene av fenoliske forbindelser kan tilby flere fordeler over bruk av enkeltkomponentene. Men det finnes ingen publiserte data på den kombinerte effekten av lignans og stilbenoids i kontrollerte eksperimentelle innstillinger. I denne studien viste vi veksthemmende effekter av furu knotwood ekstrakt (PKE), rik på lignans og stilbenoids, i PC-3M-luc2 menneskelige PCA celler
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre bekrefter vi biotilgjengeligheten av PKE-avledet fenolene, og identifiserte forbindelser sannsynlig å gjøre rede for de anticarcinogenic effektene av PKE.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Animal omsorg og bruk ble gjennomført i samsvar med den finske loven om dyreforsøk og EU-lover, retningslinjer og anbefalinger. Alle studier ble godkjent av det nasjonale Animal Experiment Board i Finland (Lisensnummer 1993 /04.10.03 /2011).
Forberedelse og kjemisk karakterisering av PKE
furu knop ble hentet fra en industriell tresliperi prosess (såkalt stein felle) (UPM Tervasaari, Valkeakoski, Finland). Knutene ble malt, siktet (mindre enn 2 mm), fryse-tørket og ekstrahert i rekkefølge med
n
-heksan ved 90 ° C (3 x 5 min) og etanol-vann (95:5 vol .) ved 100 ° C (3 x 5 min) ved hjelp av akselererte løsningsmiddel-ekstraksjon. PKE ble kjemisk karakteriseres ved hjelp av GC-flammeioniseringsdeteksjon (FID), GC-MS og ved høy ytelse størrelse-eksklusjonskromatografi med fordamping lysspredende deteksjon (HPSEC-ELSD). GC-FID, GC-MS, og HPSEC-ELSD-analyser ble utført som tidligere beskrevet [24]. GC-FID ble anvendt for kvantifisering av komponentene i den ekstrakt som ble eluert fra GC-kolonnen. Kvantifiseringen var basert på analyser av tre eksemplarer den samme ekstrakt. Heneicosanoic syre ble anvendt som indre standard, med responsfaktorer 1,00. De individuelle forbindelsene påvist ved hjelp av GC-FID ble identifisert ved GC-MS ved å bruke kommersiell og laboratorie egne spektrale biblioteker. Den molmassefordeling av PKE komponentene ble bestemt ved HPSEC-ELSD
Hovedforbindelsen gruppene i PKE var:. Lignaner (16%), stilbenoids (17%), oksidert harpikssyrer (20%), harpikssyrer (24%), og høyere molar masse og forbindelser (550 til 4000 Da, 18%). Konsentrasjonene (vekt-% tørrstoff) av hoved GC-påvisbar fenolene i PKE ble pinosylvin monometyleter (MEPs, 10,2%), NTG (7,0%), pinosylvin (PS, 4,0%), MR (1,5%) , abietinsyre (1,5%), og pinostilbene (0,4%). GC-påvisbar harpikssyrer utgjorde 21,8% av tørrvekten av PKE. Mindre mengder ( 0,1-0,5%) av lignans HMR, conidendric syre, secoisolariciresinol og todolactol A ble funnet
Referanse og testforbindelser
Klargjøring og renhet av lignans HMR, MR. , NTG, secoisolarici-, larici-, cyclolarici-, 7-oxomatai-, pino-, og medioresinol, α-conidendrin, enterolactone, 7-hydroxyenterolactone, MR-
d
6, og enterolactone-
d
6 har blitt beskrevet tidligere [25], [26]. Den stilbenes PS og parlamentsmedlemmer og resinsyretall dehydroabietinsyre (renhet 95%) ble utarbeidet i laboratoriet for tre og papir kjemi ved Åbo Akademi ved isolering av tre og rensing ved flash-kromatografi (Biotage Flash 40i) med silika kolonner. RV og enterodiol var fra Sigma-Aldrich Co, pinostilbene fra TCL Pharma Chem., Inc (Vaughan, ON, Canada) og
O
-methylpodocarpic syre, neoabietic syre og abietinsyre fra Helix Biotech Corp. (CanSyn Chem Corp., Toronto, Canada).
for å studere den kombinerte effekten av ren PKE-avledet lignaner og stilbenoids
in vitro
, har vi utarbeidet en lignan-stilbene blanding (LS blanding) som inneholder de fire mest tallrike PKE-avledede forbindelser i molare forhold som ligner på PKE (tabell 1).
Cell Kultur og spredning, apoptose og cellesyklus Analyser
PC-3M-luc2 celler (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) ble dyrket i Dulbeccos største fenol rød-fri modifiserte Eagle medium supplementert med 50 IE /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum ( Invitrogen, Paisley, UK). Cellene ble holdt i en fuktig 5% CO
2 /luftatmosfære ved 37 ° C.
celleproliferasjonsanalyse, ble PC-3M-luc2 celler utsådd i en 96-brønns plate (1500 celler per brønn). Dimetylsulfoksyd stamløsninger av PKE (1-100 mg /l), rensede forbindelser (1-100 uM) eller dimetylsulfoksyd kontroller fremstilt i kulturmedium ble tilsatt til brønnene (seks replikat). Etter 48 timer ble celleproliferasjon målt med Cell Proliferation ELISA BrdU immunoassay kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
For apoptose analysen, PC-3M-luc2 celler ble sådd på en 96 -Godt plate. Ved 60-80% konfluent halvparten av mediet ble fjernet og erstattet med medium inneholdende de tre-avledede forbindelser (endelige konsentrasjoner 1-40 mg /l). Etter 48 timer ble cellene løsnet med trypsin og avbrutt med 0,4 M citratbuffer i PBS inneholdende 0,3% triton-X (Sigma Life Sciences, St. Louis, MO). Kjerner og nukleære fragmenter ble merket med propidiumjodid (Sigma). For å bestemme fraksjonen av sub-G0 /G1 hendelser, ble prøver analysert med strømningscytometer (BD LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). For vurdering av TRAIL følsomhet, ble cellene behandlet med kombinasjonen av tre avledet forbindelser (som ovenfor) og humant TRAIL /Apo2L (kat. Nr. C-63600, Promokine, Heidelberg, Tyskland) i konsentrasjoner på 3, 25, 50 og 100 . ng /ml
ortotopiske PC-3M-luc2 xenografter i atymiske mus
Hsd: atymiske nakne – Foxn1
nu hannmus (5-6 uker gamle) kjøpt fra Harlan Laboratories (Horst, Nederland) ble plassert i aseptiske forhold i Central Animal Laboratory ved University of Turku. Musene ble akklimatisert i to uker; utstyrt med soya-fri naturlig ingrediens diett (RM3, SDS, Essex, UK) og springvann
ad libitum
.
PC-3M-luc2 celler brukes i orthotopic xenograft eksperiment ble dyrket i RPMI 1640 fenolrødt-fritt medium supplementert med 50 IE /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. Cellene ble holdt i en fuktig 5% CO
2 /luftatmosfære ved 37 ° C. PC-3M-luc2 celler (1 x 10
6 celler i 20 mL vanlig RPMI 1640 medium) ble inokulert i dorsolateral prostata gjennom en abdominal snitt under isoflurananestesi. For smertelindring, ble mus gitt buprenorfin (Temgesic, 0,05-0,1 mg /kg
sc
.) Og carpofen (Rimadyl, 5 mg /kg
sc
.) Før og etter operasjonen, henholdsvis. Tumorvekst ble fulgt av bioluminesens bildebehandling med IVIS Lumina II, som er utstyrt med XGI-8 Gas Anesthesia System (Caliper Life Sciences, Runcorn, UK). Mus ble bedøvd med isofluran, injisert
ip
med 150 mg /kg D-luciferin (Xenogen kat. Nr. XR-1001, Oregon, USA) 10 min før avbildning, og bioluminescens ble kvantifisert ved bruk av LivingImage 4.09A Carbon programvare (Xenogen).
en uke etter inokulasjon, tumorfrie dyr ble identifisert ved bioluminescence bildebehandling og ekskludert fra studien. Tumorbærende mus ble allokert til kjøretøy (kontroll), lav dose (32 mg /kg) eller høy dose (160 mg /kg) PKE grupper. Lav og høy dose inneholdt omtrent 5,0 og 5,4, og 25 og 27 mg av lignans og stilbenoids hhv. PKE ble oppløst i en bærer inneholdende 10% (v /v) av absolutt etanol og 90% (vol /vol) maisolje. Både bilen og PKE ble gavaged
p.o..
Daglig. Musene ble veid ukentlig, og bioluminesens bilde ble gjennomført to ganger i uken.
I løpet av den tredje uken av behandlings 24-h urinprøver ble samlet inn i metabolske bur (5-6 mus per bur). Urin ble oppsamlet på glass inneholdende 0,15 M natriumazid og 0,56 M askorbinsyre som konserveringsmidler. Urinprøvene ble sentrifugert og lagret i -20 ° C inntil analyse.
Etter tre ukers behandling, ble musene avlivet med CO
2 kvelning fulgt ved halshugging. Blod ble oppsamlet via hjertepunksjon, sentrifugert og serumet ble separert og holdt på -70 ° C inntil analyse. Tumorene ble dissekert og veiet, og tumorstørrelsen ble målt med en passer i tre dimensjoner. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen: volum (mm
3) = (lengde × bredde × høyde) × π /6. Svulstene ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin og behandlet for parafin innebygging og brukes for immunhistokjemisk analyse.
Analyse av Lignans og Stilbenoids Mouse serum og urin
Serum (50 pl) og urin ( 300 pl) prøver ble hydrolysert og fast-fase ekstrahert som tidligere beskrevet med noen endringer [25], [27]. For hydrolyse, ble en nyfremstilt β-glukuronidase /-sulphatase i 10 mM natrium-acetat-buffer (pH 5,0) tilsatt til serum og urinprøver og inkubert i 19 timer ved 37 ° C. Etter hydrolyse, ble interne standarder tilsatt til prøvene: MR-
d
6 for plante lignaner og stilbenes, EL-
d
6 for enterolignans (sluttkonsentrasjoner ~ 1 pg /ml), og
O
-methylpodocarpic syre for harpikssyrer (sluttkonsentrasjon ~3 ug /ml). I fast fase ekstrahert og inndampet i serum og urinprøver [25] ble oppløst på nytt i 150 pl og 500 pl metanol /0,1% eddiksyre 20:80 (v /v), respektivt. De PKE komponenter og deres metabolitter ble kvantifisert ved hjelp av HPLC-MS /MS med flere ion-overvåkings i den negative ion-modus som tidligere beskrevet [24]. Den optimaliserte flere ion overvåking overganger var deprotonerte molekylær ion og følgende fragmenter i MS
2 (
m /z
); PS 169 18; Parlamentsmedlemmene 182 20; RV 143, 22; pinostilbene 225. De harpikssyrer dannet noen fragmenter i MS
2. De brukte membran spenninger var 40 V for stilbenes og 48 V for harpikssyrer. De kollisjonsenergier var rundt 20 eV for stilbenes og 5.0 eV for harpikssyrer. MS parametere for de analyserte lignaner er blitt beskrevet tidligere [26]. De kvantifisering ble utført ved å bruke standard oppløsninger inneholdende den interne standarder og seks konsentrasjoner av analytten som tidligere beskrevet [26].
Immunhistokjemi og påvisning av apoptotiske celler i tumorprøver
For von Willebrand faktor (vWF, fortynning: 1:4000, ab6994-100, Abcam, Cambridge, UK) og fosfor-Histone H3 (pH-H3, fortynning: 1:200, Ser10, Cell signalering) immunhistokjemi, vev delen ble deparaffinized, rehydrert, og inkubert i 10 mM Tris-EDTA pH 9 (for vWF farging) eller i 10 mM natriumsitrat pH 6 (for pH-H3 farging) buffer, i en mikrobølgeovn for antigen gjenfinning. Den endogene peroxydaseaktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2. Etter skylling med PBS, ble seksjonene inkubert med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 10 minutter, og merket med vWF eller pH-H3-antistoff i 60 minutter ved romtemperatur (RT) eller over natten ved + 4 ° C hhv. Pepperrot-peroksidase-merket polymer-anti-kanin (DAKO ser for seg systemet, Dako) ble anvendt som et sekundært antistoff. Diaminobenzidin (Dako) ble påført på seksjonene fulgt av Mayers hematoksylin og montering.
terminal deoksynukleotidyltransferase biotin-dUTP nick ende merking (TUNEL) metode ble anvendt for å bestemme apoptotiske celler i tumorsnitt. Analysen ble utført ved hjelp ApopTag Peroxidase in situ apoptose Detection Kit (Chemicon International, Hampshire, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. Seksjonene ble deparaffinized, rehydrert og behandlet med 10 mM natriumcitratbuffer i mikrobølgeovn for antigen gjenfinning. Den endogene peroxydaseaktivitet ble blokkert med 3% H
2o
2. For positiv kontroll ble en seksjon inkubert med DNase I (Invitrogen) i 30 minutter ved + 37 ° C. For tunel ble snittene inkubert med 0,8 U /mL TdT reaksjon mix: TdT-buffer, 4 U /mL transferase, 25 mM CoCl
2 (Terminal transferase, Roche, Mannheim, Tyskland), biotin-16-dUTP (Roche ) og MilliQ vann; og for den negative kontroll ble en seksjon inkubert med TUNEL reaksjonsblanding uten transferase i en time ved + 37 ° C. TUNEL Reaksjonen ble stanset med 300 mM NaCl, 30 mM natriumcitrat i dH
2O (15 min ved RT). Uspesifikke seter ble blokkert med 3% BSA /PBS i 30 min ved RT. ExtrAvidine®-peroksidase 1:500 (Sigma) ble påført i 1% BSA /PBS i 30 min ved + 37 ° C, hvoretter diaminobenzidin ble påført, og seksjonene ble farget med Mayers hematoksylin og montert.
Kvantifisering til spredning og apoptose Indekser, og blodkar tetthet og lengde
Farget seksjonene ble skannet med en virtuell mikroskop (Digital Virtual Microscope, Soft Imaging System, Olympus, Tyskland). Antall og lengde på vWF-positive fartøy ble kvantifisert i tre eller fire utvalgte områder ved hjelp av måleverktøyet av dotSlide program (Soft Imaging System). Kvantifisering av pH-H3 og TUNEL-positiv celle i tumorsnitt ble gjennomført med egendefinerte funksjoner som er utviklet for vev bildeanalyse av Quva Ltd (Tammerfors, Finland). Først ble bildene innhentet fra skannede lysbilder normalisert for intensitet og fargevariasjoner. Behandling ble fortsatt ved bildeterskelverdier, som detekterer områder med passende farge til å bli betraktet som positivt fargede målcellene. Til slutt ble overflødig påvisninger filtrert ut av størrelse og form, og de resulterende cellene ble visualisert i røde flekker over originalbildet.
Statistiske analyser
De univariate analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism versjon 4.00 for Windows (GraphPad Software Inc., San Diego, California). I normalfordelte data, ble det enveis variansanalyse og Tukey post-hoc test som brukes; Ellers ble Kruskal-Wallis ikke-parametrisk eller t-test anvendt. Alle data er presentert som gruppe gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på
p
. 0,05
Parvise multivariate sammenligninger av gruppe midler (si μ1 og μ2) ble testet med Mahalanobis avstand (MD) 🙁 1)
Mahalanobis avstanden er en velkjent multivariat statistikk, som inkorporerer lineære sammenhenger av kovariater gjennom kovarians-variansen matrise
S
, med dimensjon lik antall kovariater [28]. Ved å akkumulere utfyllende informasjon fra sammenhengende faktorer og har følsomhet for mønstre som avviker fra de store trendene [29], er MD en praktisk statistikk for å teste mer subtile behandlingseffekter potensielt glipp av univariate tester. I spesielle tilfeller, MD reduserer til det standardiserte Euklidsk avstand, hvis
S
er en diagonal matrise, og til den ordinære Euklidsk avstand, hvis
S
er en enhet matrise, og dermed koblinger nøye til konvensjonell
t
statistikk testing av uavhengige tumorvekst markører. Statistisk signifikans av avstanden
D
ble evaluert ved tilfeldig permutasjon av klassen etikettene i to-utvalg tester (Vehicle vs lav dose eller Vehicle vs. høy dose) [30]. Null distribusjoner ble oppnådd ved å kjøre 100.000 simuleringer av slike tilfeldig genererte avstander og de empiriske
p
-verdier ble definert som andel av tilfeldige avstander større enn eller lik den observerte avstand
D
.
Resultater
PKE og dens komponenter Hemme PC-3M-luc2 celleproliferasjon og indusere apoptose
in vitro
PKE betydelig svekket PC-3M-luc2 celleproliferasjonen ved ≥40 mg /l (fig. 1A), demonstreres ved redusert inkorporering av BrdU. I tråd med dette, de viktigste bestanddelene av PKE, stilbenoids (parlamentsmedlemmer og PS), samt lignans (MR og NTG) hver betydelig hemmet celledeling på 40-100 mikrometer konsentrasjon (Fig. 1B). Videre er kombinasjonen av disse fire forbindelser (MEPs, PS, MR, og NTG), i samme forhold som foreligger i PKE (lignan-stilbene, LS, blanding), redusert BrdU-inkorporering på en måte i likhet med den opprinnelige ekstrakt (fig. 1C). PKE (40 mg /l) og LS blanding (40 uM), både økt apoptose hastighet, vist ved flowcytometrisk analyse (Fig. 2A). PKE indusert cellesyklus-stans, det vil si økes fraksjonen av ikke-apoptotiske celler i G0 /G1 (fig. 2B), og henholdsvis redusert fraksjon av celler i S og G2 /M-fasene. Videre PKE (10 og 40 mg /ml) sensibilisert PC-3M-luc2 celler i Trail-indusert apoptose (fig. 3A). LS blandingen og alle de testede PKE-avledede forbindelser (MEPS, NTG, PS, MR, og RV), bortsett abietinsyre, betydelig forbedret TRAIL-mediert apoptose (fig. 3B), PS, parlamentsmedlemmer og MR viser de største utslagene .
a) Cellene ble behandlet med PKE eller en blanding av sine viktigste lignans og stilbenoids (LS blanding) i 48 timer. B) Celler ble behandlet med individuelle PKE avledede forbindelser i 48 timer. Celleformeringshastigheten uttrykt som prosent av kontroll ble målt med BrdU analysen. Dataene er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive kjøretøy behandling (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
apoptose priser og antall celler i G0 /G1 fase er uttrykt i forhold til kjøretøykontroll (Ctrl = 1). Cellene ble behandlet med testforbindelser i 48 timer, og apoptose hastighet og cellesyklus fase ble bestemt med strømningscytometer. LS, blanding av hoved PKE lignans og stilbenes; Parlamentsmedlemmene, pinosylvin monometyleter; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, abietinsyre; RV, resveratrol. Dataene er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive Ctrl. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
A) celler behandlet med PKE i kombinasjon med økende konsentrasjoner av menneskelig TRAIL (0-100 ng /ml), verdier er prosenter av atom fragmentering. B) celler behandlet med PKE, LS blanding, eller med individuelle PKE forbindelser i kombinasjon med human TRAIL (25 ng /ml), verdiene er relative prisene apoptose (Ctrl = 1). Cellene ble behandlet med testforbindelser i 48 timer og atom fragmentering ble bestemt med strømningscytometer. LS, blanding av hoved PKE lignans og stilbenes; Parlamentsmedlemmene, pinosylvin monometyleter; NTG, nortrachelogenin; PS, pinosylvin; MR, matairesinol; Ab, abietinsyre; RV, resveratrol. Dataene er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved ikke-parametrisk t-test for hver behandling i forhold til respektive kjøretøy behandling (Ctrl). * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Effekt av PKE på ortotopiske PC-3M-luc2 Xenotransplantat Volume, celleproliferasjon og Angiogenese
. tre ukers daglig inntak av PKE ble godt tolerert, og ingen tegn til bivirkninger ble observert på noe tidspunkt. PKE betydelig redusert spredning indeksen (fig. 4A) og lengden av blodkar (dvs. omkrets) i PC-3M-luc2 tumorer (Fig. 4B). En tendens til redusert bioluminescens og PCA-tumorvolum ble observert i den høyere PKE dose (160 mg /kg) gruppe (fig. 4C og D). Ingen signifikante endringer ble sett i apoptose-indeksen, som kvantifiseres fra TUNEL-farget tumorsnitt (data ikke vist). Den multivariable sammenligning av det utskårede tumorvolum, log-transformerte tumor Bioluminescens, apoptose og spredning indekser, og blodkartettheten og lengde ble utført ved anvendelse av MD-statistikken (Eq. 1). Når responsen ble testet i forhold til den kombinerte effekten av disse 6 kovariater (fig. S1), var det en signifikant forskjell mellom kjøretøy og høydose PKE gruppene (p = 0,0051, fig. 5A), mens kjøretøyet og den lavdose PKE gruppene tilsvarende (p = 0,4195, fig. 5B). Interessant, den kombinerte evalueringen av kovariatene og deres samspill klart adskilt bilen og høydose PKE grupper (Fig. 5C, med de 3 viktigste funksjonene visualisert). Den slutning trukket fra denne kombinerte analysen var dypt forskjellig fra de uavhengige univariate analysene (Fig. 4); for eksempel, den multivariable tilnærmingen har oppdaget at noen tumorer hadde redusert vaskularisering (
kar lengde
), mens andre hadde redusert størrelse (
tumorvolum
), og derfor ga et flerdimensjonalt visning av behandlingseffekter . De opprinnelige tumor målinger er vist i den supplerende materiale som bivariate (fig. S1) og univariable plott (fig. S2). Den beregnede varians-kovarians struktur
S, etter etter skalering til korrelasjonsmatrise, er vist i fig. S3. Som forventet, beslektede faktorer, slik som tumorvolum og tumor bioluminescens eller fartøyet tetthet og fartøyets lengde, var sterkt korrelert, og deres avstander effektivt ble gruppert i MD-analyse (fig. S3).
A) PKE minsker celleproliferasjon indeksen. Representative bilder av pH-H3-immunostainings vises. B) PKE reduserer blodåre lengde. Representative bilder av vWF-immunostainings vises. C) Bioluminesens av svulstene, kvantifisert annenhver uke etter
in vivo
imaging. D) Tumor volumer på offer. Mus ble daglig behandlet med vehikkel (n = 11), PKE 32 mg /kg bwt (n = 10) eller PKE 160 mg /kg bwt (n = 11) i tre uker. Dataene er uttrykt som middelverdi ± SEM. Statistisk signifikans ble bestemt ved enveis variansanalyse og Tukey post-hoc test. * P 0,05. Skala barer, 100 mikrometer.
C) Tumor volum, fartøy lengde og spredning indeksen ble oppdaget som de viktigste faktorene for forskjeller i multivariate analyser. Den hyperplan viser at to av gruppene (kjøretøy i svart og høy dose i grønt) var lineært separable når de tre faktorene ble vurdert sammen. (Hyper: 100,55 = 0,104 × Tumor volum + 0,895 × spredning index + 21,1 × Vessel lengde)
for å evaluere de faktorer som er mest avgjørende for å skille den høydose PKE gruppe fra kontrollgruppen, ble en grundig testing av MD for forskjellige kombinasjoner av de 6 kovarianter utført. De mest fremtredende effekter ble påvist som en kombinasjon av tumorvolum, proliferasjon indeks og fartøyets lengde. Undersøkelse av samspillet mellom disse tre merkene viste at selv om enkelte kovariater alene ikke var nok informasjon for å skille de to gruppene, da vurderes samlet, bilen og høydose PKE grupper var lineært separable med et hyperplan (Fig. 5C). Videre er riktignok kjøretøyet og lav-dosegruppen var forskjellen ikke statistisk signifikant, den generelle trenden i de tre gruppene foreslått en økt antitumoreffekt med en økende dosenivå (som sett i rekkefølgen av de sorte, røde og grønne skyer i fig. 5C).
konsentrasjoner av fenoliske forbindelser i serum og urin av tumorbærende mus
mikromolare konsentrasjoner av NTG, og MEPs ble detektert i serumet av dyr som utsettes for den høyere dose av PKE ( tabell 2). Harpikssyrer som var tilstede i den PKE ble ikke påvist i serum eller urinprøver. Interessant vesentlige konsentrasjoner av RV, som er monohydroksylerte metabolitt av PS, samt pinostilbene, en metabolitt av MEP’er, ble detektert i serum og urin fra mus ble matet med den PKE (tabell 2). I tillegg konsentrasjonene av MR og HMR og deres metabolitter enterolactone, enterodiol, og 7-hydroxyenterolactone samt konsentrasjoner av parlamentsmedlemmer, PS, NTG, og pinostilbene betydelig økt sammenlignet med kontrollgruppen (tabell 2). Stilben og lignan metabolitter var tilstede i serumet 15 min-3 h etter den siste administrering (data ikke vist), og de høyeste konsentrasjonene ble målt ved 2 timer (tabell 2). Metabolitten profil i urinen (24 timers samling) var veldig lik som i serum (data ikke vist).
Diskusjoner
Epidemiologisk og prekliniske studier antyder en invers sammenheng mellom forbruk av polyfenol-rik mat og forekomsten av kroniske sykdommer, inkludert kreft [3], [7], [31]. Spesielt lignans og stilbenes og deres metabolitter, er attraktive kandidater for PCa risikoreduksjon. I denne studien har vi vist anticarcinogenic effektene av furu knute ekstrakt (PKE), en blanding rik på lignans og stilbenoids,
in vitro Hotell og
in vivo
i en orthotopic PCa xenograft modell
