Abstract
svulstens mikromiljø (TME) er en aktiv aktør i kreftutvikling og endringer i komposisjonen endre kreft vekst. Karsinom-assosiert fibroblaster, benmarg-avledede multipotente stamceller (BMMSCs), og inflammatoriske celler kan alle påvirke sammensetningen av TME som fører til endringer i proliferasjon, invasjon og metastase dannelse av carcinomceller. I denne studien fikk vi bekreftet en interaksjon mellom BMMSCs og muntlig tunge plateepitelkarsinom (OTSCC) celler ved å analysere invasjonen progresjon og genuttrykk mønster. I et tre-dimensjonalt myom organotypiske invasjonsmodell nærvær av BMMSCs inhiberte proliferasjonen men økt invasjon av OTSCC celler. Videre er signalene som kommer fra OTSCC celler opp-regulert ekspresjon av inflammatoriske kjemokiner ved BMMSCs, mens BMMSC produkter induserte ekspresjon av kjente invasjonsbundet molekyler av carcinomceller. Spesielt etter at celle-celle interaksjoner, chemokine CCL5 ble rikelig utskilt fra BMMSCs og en funksjon som blokkerer antistoff mot CCL5 hemmet BMMSC forbedret kreft invasjon området. Imidlertid gjorde CCL5 blokkerende antistoff inhiberer ikke dybden av invasjonen. I tillegg, etter eksponering for BMMSCs, ekspresjon av type I kollagen mRNA i OTSCC celler var markert oppregulert. Interessant, også høy ekspresjon av type I kollagen N-terminale propeptidet (PINP)
in vivo
korrelert med kreftspesifikke dødelighet av OTSCC pasienter, mens det var ingen sammenheng mellom kreft vev CCL5 nivåer og de kliniske parametere. Som konklusjon, tyder våre resultater at interaksjonen mellom BMMSC og carcinoma celler induserer cytokin og matrise molekyl uttrykk, hvorav høyt nivå av type I kollagen produksjon korrelerer med prognosen for OTSCC pasienter.
Citation: Salo S, Bitu C, Merkku K, Nyberg P, Bello IO, Vuoristo J et al. (2013) human benmarg stamceller Fremkollagenproduksjonen og Tongue Cancer Invasion. PLoS ONE 8 (10): e77692. doi: 10,1371 /journal.pone.0077692
Redaktør: Dimas Tadeu Covas, University of Sao Paulo – USP, Brasil
mottatt: 14 juni 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 21 oktober 2013
Copyright: © 2013 Salo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har vært støttet av Academy of Finland, det finske Kreftforeningen, Sigrid Juselius Foundation, den finske Dental Society Apollonia, og Emil Aaltonen Foundation tilskudd. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
svulstens mikromiljø (TME) gjennomgår omfattende endringer i løpet av tumorvekst [1] og progresjon av en svulst er avhengig stromal elementer [2]. Celler i mikromiljøet, inkludert karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer), benmarg-avledede multipotente mesenchymale stromale celler (BMMSCs), tumorassosierte makrofager (TAM) og andre inflammatoriske celler så vel som vaskulære celler bidrar alle i varierende grad for å kjennemerkene kreft og kreft økosystem [3] [4]. De produserer ekstracellulære matriks, vekstfaktorer, cytokiner, proteaser og deres regulatorer, og således tilveiebringe et mikromiljø som støtter cancer celleproliferasjon og udødelig, indusere angiogenese, omprogrammering energimetabolisme, gå utenom immun ødeleggelse, og som favoriserer invasjon og metastase [5], [1 , 3,6], [4].
I tungen kreft komponentene i TME har en elementær rolle i invasjonen og metastaseprosesser med en direkte innvirkning på pasientenes kliniske resultater [7]. Vi har vist at den høye frekvensen av kafeer er assosiert med dårlig prognose i mobil tunge kreftpasienter [8], [9]. Kafeer har også vist seg å lokalisere på stedet av metastatisk lymfeknute på samme måte som matchet primære tunge svulster som tyder på tilrettelegging av metastaser [10]. Vår fersk studie profilert molekylært krysstale mellom orale kreftceller og TME og presentert som undersøkelse av kjente pro-tumorigene komponenter av inflammatorisk infiltrat, for eksempel regulatoriske T-celler, TAM2 (dvs. TAM subtype støtte invasjon og metastasering) celler, og regulatoriske T-celle indusere immunceller, viste negativ effekt for pasienter som ligner på kafeer [11].
BMMSCs har vist seg å innlemme i skadet eller betent vev samt til hjemme på svulster og metastasestedet hvor de integreres i TEM og gi en kilde for celler, for eksempel kafeer [12], [ ,,,0],13] [14], [15] ,, [2]. Cytokiner og vekstfaktorer utskilt av tumorceller sammen med endokrine faktorer av inflammatorisk vev rundt svulster tiltrekke BMMSCs til tumor stroma [16]. BMMSCs har vist seg å fremme invasjon og metastase i forskjellige krefttyper, for eksempel bryst, tykktarm og lymfatisk-kreft [17], [18], [19]. Men virkningen og rollen BMMSCs i TEM og mekanismene for deres potensielle virkninger på forskjellige svulster fortsatt kontroversiell [20], [21].
I tillegg til ulike celletyper, kan de ekstracellulære matrix (ECM) proteiner i TME også fungere som viktige faktorer i dynamisk informasjonssystemet påvirker kreft utfallet [22]. Den mest tallrike protein i TME er type I kollagen som fører til tumorvekst, invasjon og spredning av kreft. Spesielt indikerer utgivelsen av den aminoterminale propeptid av type I prokollagen (PINP) den tumorindusert fibro-proliferativ respons [22-24].
Formålet med dette arbeidet var å undersøke effekten av BMMSCs og carcinoma celler interaksjoner på OTSCC genekspresjon, invasjon og klinisk utfall av OTSCC pasienter. Her viste vi at BMMSCs indusert OTSCC carcinoma celle invasjon
in vitro
delvis gjennom chemokin CCL5 signale siden hemning redusert invasjonen området. I OTSCC celler ekspresjon av type I kollagen mRNA ble oppregulert ved hjelp av signaler avledet fra BMSCC, og det høye nivå ekspresjon av immunreaktive type I prokollagen korrelert med kreftspesifikke dødelighet av OTSCC pasientene.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskelig tunge plateepitelkarsinom celler HSC-3 (JCRB 0623, Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japan), SAS ( . JCRB 0260; Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japan) og menneske dysplastiske orale keratinocytter DOK (European Innsamling av cellekulturer 94122104, Salisbury, Wilts, UK) ble dyrket i 1: 1 DMEM /F-12 (Invitrogen) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 50 ug /ml askorbinsyre, 250 ng /ml Fungizone, 5 ug /ml insulin (bovin bukspyttkjertel), 0,4 ug /ml hydrokortison (alt fra Sigma-Aldrich), og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS). For zymografi ble føtalt bovint serum erstattet med 0,5% lactalbumin (Sigma-Aldrich). Menneskelig benmargavledede BMMSCs ble opprinnelig hentet fra pasienter operert for hoftebrudd eller slitasjegikt. Den etiske komiteen i Oulu universitetssykehus hadde godkjent studieprotokollen (Utsagn 4 /2000,58 /2009 og 21/2011, Forsknings Diary 180/2001 og 12/2004) og pasientene hadde gitt sitt informerte skriftlig samtykke til deltakelse i studien . De BMMSCs brukt i denne studien ble høstet og dyrket som beskrevet tidligere [25] [26]. Alle forsøk ble utført med celler med lave passasje tallene 3 – 4. Menneskelige gingivale fibroblaster (GF) brukt i denne studien ble oppnådd fra biopsier av friske gingiva som tidligere beskrevet [27]. Carcinoma-assosiert fibroblaster (CaDEC12) [11] avledet fra et eksemplar av tungen SCC samt normal oral fibroblaster (NOFs) [28] ble dyrket i de samme mediene som GFS [27]. Alle celler ble dyrket i en fuktig atmosfære med 5% CO
2 ved 37 ° C. I BMMSC eller GF co-kulturer med HSC-3, ble SAS eller DOK celler BMMSC eller GF kultur media brukes.
organotypiske invasjon assay
organotypiske invasjon analyse og kvantifisering av invasjon ble utført som beskrevet tidligere [29]. I monokultur analyser 2,0 x 10
5-4 x 10
5 HSC-3 eller SAS celler eller 2 x 10
5 DOK celler ble dyrket på toppen av myom disk for 10 – 14 dager. I ko-kultur-analysene 0,5 til 1,5 x 10
5 BMMSCs ble tilsatt sammen med cancerceller på toppen av myom skivene (OTSCC: BMMSC-forholdet varierte fra 2: 1 til 5: 1). De histologiske snitt av myom disker ble farget med monoklonalt pancytokeratin antistoff (DAKO, klone AE1 /AE3). Gjennomsnittet av invasjonen området eller dybde av HSC-3, SAS, DOK eller andre kontrollceller dyrket i monokultur ble satt som 100%. For inhibering av invasjon, 50 ug /ml av monoklonalt antistoff mot humant CCL5 (R 55 yrs4035.155-70 yrs3026.3 70 yrs4438.6SexMale5649.1Female5850.9Tumour grade14035.126254.431210.5Tumour stage1-26355.33-45144.7Neck lymph nodesNegative7969.3Positive3530.7Neck dissectionNo1614.0Yes9886.0Adjuvant therapyNo6859.6Radiotherapy3429.8Radio- og chemotherapy97.9Missing data32.6Total114Table 1. Pasient kliniske data.
CSV ned CSV
Immunohistochemistry
Farging ble utført på alle våre OTSCC prøver, som tidligere ble valgt for å være representative for de tumormasse i de resekterte prøver. Etter en høy temperatur antigen hentemetode med sitrat-buffer for CCL5 (REAL Target Retrieval løsning, pH 6; Dako, Glostrup, Danmark) eller Tris /EDTA for PINP (10 mmol /liter Tris, 1 mmol /l EDTA, pH 9), seksjonene ble blokkert ved inkubering med normalt geiteserum i 30 min. Platene ble inkubert over natten ved 4 ° C med det polyklonale geite-anti-humant antistoff CCL5 (# AF-278-NA, R lymfeknuter fri for metastatisk sykdom ble undersøkt av D.D. og M.V.). Ulike mønstre for å klassifisere ekspresjon ble valgt. Ved første prøvene ble klassifisert basert på den samlede differansen av farging mellom de overfladiske og invasive områder av tumorene ble kategorisert (farving vises mer intensivt i overfladiske områder av tumoren eller flekker vises mer intensivt i invasive områder av tumoren). Prosentandelen av positive celler i de stromale og tumorceller i både overfladiske og invasive områder av tumoren ble skåret på en firepunktsskala (0 = 0% 1 = 0-25%, 2 = 25-50% og 3 = 50%, med tittelen ingen, lav, moderat og høy uttrykk, tilsvarende). I tillegg ble nærvær av PINP farging i blod- og lymfekar vurdert. Den subepiteliale stroma av morfologisk normal epitel ble også farget. Ved dysplastiske mucosa sider både epitelceller og subepiteliale stromale celler ble analysert.
RNA interferens
Tre kommersielle CCR5 kort hårnål RNA (shRNA) oligonukleotider (Thermo Scientific # VGH5518-98903425, # VGH5518-99159618, # VGH5518-99294601) og ikke-tie-kontroll (Thermo Scientific # RHS4348) ble hentet fra Thermo Scientific Åpne Biosystems GIPZ Lentiviral shRNAmir Library (Thermo Scientific). De transductions av HSC-3 celler med virale og kontroll vektorer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner med puromycin (Sigma-Aldrich) utvalg. Effektiviteten av knockdown av CCR5-shRNA ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse ved anvendelse av monoklonalt anti-CCR5-antistoff (BD Pharmingen, # 556903) og isotype matchet IgG (BD Pharmingen, # 555576) som en kontroll. Omtrent 70% knockdown av CCR5 ble oppnådd sammenlignet med ikke-Silencing kontrollceller med en av de kommersielle oligonukleotider (Thermo Scientific # VGH5518-99159618).
Statistisk analyse
Alle analyser ble gjentatt 2 – 4 ganger, med unntak av 3D invasjonen analysen med SAS og DOK celler som ble utført bare en gang med tredoble myom disker per mono- eller co-kultur. Forskjeller i celleproliferasjon og sårheling, invasjon område og dybde ble evaluert ved hjelp av Student t-test. I alle eksperimenter ble en
p
-verdi på mindre enn 0,05 betraktes som statistisk signifikant. For statistiske analyser av pasientmaterialet vi brukte PASW Statistikk 18 (IBM corp.) Programvare. En chi-kvadrat-test ble brukt for å beregne statistisk signifikante forskjeller mellom prognostiske og clinicopathological variabler. Overlevelses tabeller ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier-metoden, og ble sammenlignet med den log-rank test. Multivariat overlevelse og tilbakefall analyser ble gjort med Cox modell ved hjelp av følgende kovariater: kjønn (mann eller kvinne), alder ved diagnosetidspunktet ( 55 år, 55-70 år og 70 år), tumorstadium (1-4) og tumor histologisk grad (vel = 1, moderat = 2 og dårlig = 3 differensierte karsinomer i henhold til Verdens helseorganisasjon hode og nakke kreft klassifisering (2005) sammen med PINP uttrykk mønstervariablene som angitt. Cox regresjon ble gjort ved hjelp bakover trinnvis utvalg av variabler, og en
p
verdi på 0,05 ble vedtatt som grense for inkludering av en kovariat.
Resultater
BMMSCs indusere tungen kreft celle invasjon i 3D in vitro organotypiske modell
effekten av BMMSCs på tungen kreft celle invasjon ble undersøkt i myom organotypiske modell [29] som er mer tro mot den menneskelige TME enn tidligere animalsk vev avledet modeller. menneskelig tunge carcinoma celler, HSC-3, SAS eller dysplastiske DOK celler ble dyrket som en monokultur eller i co-kultur med BMMSCs på toppen av myom disker. Etter 10 – 14 dager invasjonen område og dybde ble kvantifisert ved å analysere bilder tatt fra pancytokeratin farget histologiske seksjoner fra monokultur og co-kultur disker. Som vist i figur 1, BMMSCs induserte en økning i invasjon område, og til og med en tydeligere effekt ble sett på invasjonsdybden i HSC-3-BMMSCs ko-kulturer (figur 1A-1B). En svak økning i invasjonen området ble observert også med SAS-celler i nærvær av BMMSCs, selv om det ikke er statistisk signifikant. Men det så ut til å ha noen effekt på invasjon dybde (figur 1C 1D). Interessant, BMMSCs hemmet invasjonen av dysplastic DOK celler (figur 1D-1E) tyder på en annen effekt av BMMSCs på carcinoma celler sammenlignet med ikke-ondartede celler.
benmargavledede BMMSCs forbedre invasjonen av HSC-3-celler (A, B), men ikke dysplastiske celler (E, F) i 3D myom organotypiske modell [29]. Mindre økning, selv om det ikke er statistisk signifikant, ble sett i invasjonen område av SAS (C, D). Histologiske snitt hentet fra myom disker ble farget med monoklonalt pancytokeratin antistoff (DAKO, klone AE1 /AE3) og fotografert ved 100 x forstørrelse med DMRB bilde mikroskop koblet til DFC 480 kamera med QWin V3 programvare (Leica Microsystems). Scale bar 100 mikrometer.
For å undersøke om den økte invasjonen av HSC-3 celler skyldes økt celledeling, HSC-3 og SAS celler ble dyrket på toppen av myom disk som en monokultur eller co -Kultur med BMMSCs eller GFS. Histologiske snitt oppnådd fra disse skiver ble immunfarget med spredning Ki67 og positive celler ble beregnet som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleproliferasjon nivåene var bemerkelsesverdig lavere i HSC-3 og SAS co-kulturer med BMMSCs i forhold til co-kulturer med GFS (Figur 2A-2B). For å bekrefte at effekten ses i histologiske snitt kom fra redusert spredning av kreftceller, HSC-3-celler ble dyrket som en mono- eller co-kultur på cellekultur kammer lysbilder med BMMSCs merket med et fluorescerende fargestoff. Etter co-kultur over natten ble cellene farget for Ki67. Som vist i figur 2C, BMMSCs hemmet HSC-3-celleproliferasjon i betydelig grad også i cellekultur co-assay. Levedyktigheten av HSC-celler forble fremdeles høy og ingen tegn på apoptose ble påvist (data ikke vist).
Histologiske snitt hentet fra myom disker ble farget med polyklonale anti-Ki67 antistoff. BMMSCs hemme proliferasjonen av HSC-3 og SAS-celler i organotypiske invasjonsmodell (A, B), så vel som i cellekulturanalyser (C), og skift HSC-3, men ikke dysplastiske DOK celler mot en vandrende fenotype med mindre celle-celle- kontaktene (D, pilspisser). Normale gingivale fibroblaster, GF, fremme lukking av sår mer enn BMMSCs potensielt delvis på grunn av økningen i celle-proliferasjon av cancerceller (E). Målestokken 50 um.
proliferasjon ikke ble øket, for å evaluere om den økte invasjonen var en konsekvens av høyere kreftcellemigrering en ripe Analysen ble utført med HSC-3 og DOK celler sådd alene eller sammen med BMMSCs eller GFS til 24-brønners plater. BMMSCs skiftet HSC-3 celler, men ikke dysplastiske DOK celler, mot en trekkfugl fenotype med lamellipodia strukturer og mindre celle-celle kontakter (figur 2D). Men GFS fremmet raskere lukking av sår enn BMMSCs, som kan være delvis på grunn av effektene av serum på spredning kapasitet av kreft celler (figur 2D-2E)
Uttrykket av chemokin CCL5 er oppregulert i BMMSCs etter interaksjon med kreftceller
BMMSCs ble deretter dyrket med kondisjonert medium hentet fra HSC-3. Selv om flere gener ble oppregulert, ble den høyeste økningen i genuttrykk i BMMSCs sett i chemokin gener (tabell 2). Når kjemokinet ekspresjon ble undersøkt på protein-nivå ekspresjon av CCL5 ble funnet å være hovedsakelig et resultat av vekselvirkningen mellom HSC-3 og BMMSC celler snarere enn fra de ko-kulturer av HSC-3-celler og GFS (figur 3a). Lignende funn ble innhentet fra co-kulturer av SAS og BMMSCs, men ikke fra DOK celler i samspill med BMMSCs (figur 3A). På proteinnivå, ble opp-regulering av de fleste av kjemokiner som er oppført i tabell 2 funnet å stamme fra OTSCC cellelinjer interaksjoner med både BMMSCs og GFS. Noen kjemokiner, som CCL2, CCL20 og CXCL8, ble også oppregulert som et resultat av samspillet mellom BMMSCs og DOK celler, som studerte i immunanalyser (data ikke vist).
Gene
Symbol
Brett Change
chemokine (CC motiv) ligand 2CCL2830.66chemokine (CC motiv) ligand 5CCL5194.90chemokine (CC motiv) ligand 20CCL20182.23chemokine (CXC motiv) ligand 1CXCL1134.91chemokine (CXC motiv) ligand 2CXCL280.98chemokine (CXC motiv) ligand 3CXCL380 .14chemokine (CXC motiv) ligand 5CXCL573.90chemokine (CXC motiv) ligand 8 (interleukin 8) CXCL8 (IL8) 18.06chemokine (CC motiv) ligand 13CXCL1316.86Table 2. oppregulert chemokin gener i BMMSCs etter utsette til betinget HSC-3 cellekulturmedia (endring 2).
CSV ned CSV
Co-kultur av celler med OTSCC BMMSCs resulterer i høy ekspresjon av chemokin CCL5 i HSC-3 og SAS-celler, men ikke i dysplastiske celler DOK (EN). Funksjon-blokkerende monoklonalt antistoff mot CCL5 (Mab CCL5) inhiberer svakt BMMSC forbedret invasjon område, men har ingen effekt på invasjonen dybde, mens antistoff mot CXCL1 ikke øker den hemmende effekt i OTSCC invasjon (B, C).
Funksjon-blokkerende antistoff mot CCL5 hemmer BMMSC økt invasjon område
Vi neste undersøkt betydningen av CCL5 i spredningen av tungen kreft, siden CCL5 har vist seg å fremme bevegeligheten av muntlige kreftceller [32]. CCL5 ble også vist å være viktig i tumorprogresjon av flere kreftformer, slik som bryst og kolorektal karsinom [17,33]. Derfor testet vi effekten av CCL5 funksjon-blokkerende antistoff på OTSCC og BMMSC co-kulturer i 3D-invasjonen modell. Vi testet også den potensielle effekt av funksjonsblokkerende antistoff mot CXCL1 på invasjon, ettersom CXCL1 ble også uttrykt fra BMMSC-HSC-3-interaksjonen, og det er tidligere blitt vist å være til stede i kreftformer, inkludert bryst-, lunge-, kolorektal- og prostata cancer enten støtter eller undertrykke tumorprogresjon [34-36]. I oral cancer CXCL1 har vært foreslått å ha en rolle i tumorprogresjon siden i pasientprøver ekspresjon av CXCL1 har vist seg være assosiert med leukocyttinfiltrering, lymfeknutemetastase, og angiogenese [37]. Som vist i figur 3, den CCL5 funksjonsblokkerende monoklonalt antistoff var i stand til å signifikant dempe BMMSC-promo HSC-3-celle invasjon området, men hadde ingen virkning på invasjonsdybde (figur 3B-3C). CXCL1 ikke har en effekt på invasjon som det ikke øke den hemmende effekten av CCL5 i 3D-invasjonen modellen (Figur 3B-3C).
I pasientprøver CCL5 uttrykkes hovedsakelig av betennelsesceller og enkelte kreftceller, men bare spredte kafeer er CCL5 positive
Neste, for å vurdere betydningen av CCL5 uttrykk i pasienttumorprøver for diagnostikk av tungen kreft, ble histologiske snitt representerer ulike stadier av dysplastiske lesjoner og tunge karsinom fra menneskelige pasienter farget med anti-CCL5 antistoff. Ekspresjon av CCL5 det meste ble påvist i inflammatoriske celler, og i enkelte kreftceller (figur 4A-4B), men bare spredte kafeer var CCL5 positive, vurdert ved immunohistokjemisk ko-lokalisering av CCL5 og CAF markør αSMA (data ikke vist). Med uttrykket av CCL5 var ikke assosiert med det kliniske resultatet av OTSCC pasienter (ikke vist). Ekspresjon av CCL5 ble videre undersøkt i normale primære orale fibroblaster (NOF, [28]), og CaDEC12 celler [11]. Immunoassay påvise utskilt CCL5 i cellekultur media viste svært lav eller ingen CCL5 uttrykk i normale fibroblaster, men betydelig høyere uttrykk i CaDEC12 celler (Figur 4C).
CCL5 er hovedsakelig uttrykt av inflammatoriske celler i TME og enkelte kreftceller i pasientprøver som vist ved farging med Pab CCL5, men bare spredte kafeer er positive for CCL5 (A, B). CaDEC12 celler, de primære kulturer av kafeer oppnådd fra tunge kreftpasienter, uttrykke den relative mengde av CCL5 forhold til NOFs, normale orale fibroblaster (C). Scale bar 100 mikrometer.
Rollen CCL5 /CCR5-aksen er ikke kritisk i BMMSC økt tungen kreft invasjon
CCL5 signalering i kreftceller er foreslått å bli formidlet i hovedsak, men ikke nødvendig utelukkende, via CCR5-reseptoren [38]. Begge HSC-3 og SAS-celler ble vist å uttrykke denne reseptoren (figur 5A). I ko-kulturen omtrent alle kreftceller uttrykt CCR5, men i monokulturer omtrent 25% av kreftcellene var positive for CCR5 som tyder på at en kontakt med stromale celler eller CCL5 induksjon er nødvendig for høyere CCR5 uttrykket (flowcytometri analyse, data ikke vist ). Foreningen av CCL5 og CCR5 uttrykk har blitt foreslått nylig også av andre [39,40]. Som CCL5-CCR5 akse har vist seg å fremme motilitet av humane orale kreftceller
in vitro product: [32], og for å indusere ekspresjon av MMP9 [32], vi undersøkte også effekten av rCCL5 på MMP9 ekspresjon nivåer i HSC-3 og SAS, så vel som i dysplastiske celler DOK. I likhet med tidligere observasjon av Chung og medarbeidere [32] rCCL5 tydelig øket ekspresjon av MMP9 i HSC-3-celler og SAS-celler, men ikke i dysplastiske DOK celler (Figur 5B). Imidlertid rCCL5 fremkalte ikke epitelial-mesenkymale overgang (EMT) som analysert ved Western blotting med anti-vimentin-antistoff, eller proliferasjon av kreftceller (data ikke vist).
CCL5 reseptoren CCR5 er uttrykt i HSC-3 og SAS-celler, men ikke i BMMSCs (A). rCCL5 kan indusere ekspresjon av MMP9 i HSC-3 og SAS, men ikke i DOK-celler (B). Den stanse av ekspresjonen av CCR5-reseptoren i HSC-3-celler nedregulerer genekspresjonen omtrent 70% sammenlignet med kontrollceller og blokkerer signal øke ekspresjonen av MMP9 i kreftceller (C, D). CCR5 knockdown ha liten eller ingen effekt på BMMSC økt invasjon av HSC-3-celler i 3D-modellen organotypiske (E, F).
For å utforske betydningen av CCL5 /CCR5-aksen i spredningen av tungen kreft, utførte vi en 3D-invasjon studie med SAS og HSC-3 OTSCC celler med redusert CCR5 uttrykk og med funksjon-blokkerende antistoff mot CCL5. Først inhiberes vi ekspresjonen av CCR5 ved å transdusere HSC-3-celler med CCR5-shRNA og produserte en stabil cellelinje med ~ 70% inhibering av CCR5 ekspresjon og redusert respons til rCCL5 induksjon (figur 5C, 5D). I 3D-ko-kulturen invasjon assay CCR5-knockdown cellene invadert like eller enn villtype eller tak HSC-3-celler transdusert med ikke-tie shRNA (figur 5E, 5F). Lignende resultater ble også oppnådd med et monoklonalt antistoff mot CCR5 (data ikke vist).
Uttrykk av kollagen og epitel plastisitet komponenter er indusert i kreftceller etter BMMSC samhandling
Potensielle mekanismene for invasjonen fremme effekten av BMMSCs på kreftcellene ble videre studert av microarray analyse. HSC-3-celler ble anvendt for eksperimentene, siden de reagerte mer tydelig å BMMSCs enn SAS-celler, spesielt i 3D-invasjonsmodell. HSC-3-celler ble dyrket som en monokultur eller ko-kultur med BMMSC cellene på 6-brønners plater i 24 timer, hvoretter HSC-3-celler ble sortert ut fra ko-kulturer med FACS (ikke vist), og RNA ble ekstrahert for microarray analyse .
