Abstract
Smørsyre, en gjæring produkt av fiber i tykktarmen, fungerer som en histondeacetylase inhibitor (HDACi) og induserer apoptose i tykktarmskreft (CC) celler
in vitro
. Vi har rapportert at de apoptotiske effektene av smørsyre er avhengig av hyperaktive av Wnt /beta-catenin veien. Men langvarig eksponering av CC celler til økende konsentrasjoner av butyratproduserende resultater i oppkjøpet av motstanden mot Wnt /beta-catenin- og apoptose-induserende effekten av denne agenten, samt kryssresistens overfor strukturelt forskjellige HDACis. Her rapporterer vi at en mekanisme der HDACi motstand oppstår er gjennom økning av beta-catenin-uavhengig (noncanonical) Wnt signalering. Sammenlignet med HDACi-sensitive HCT-116 CC-celler, HDACi-resistente HCT-R-celler utviser høyere nivåer av AKT /PKB celleoverlevelse signalering, som er delvis indusert ved WNT5A og dens reseptor ROR2. Induksjon av AKT-signalering ved HDACis er også påvist i andre CC cellelinjer, om enn i mindre grad enn i de medikamentresistente HCT-R-celler. Observasjonene antydet at den apoptotiske effekt av butyrat og andre HDACis i CC-celler kan bli utvidet med inhibitorer av pakt. Etter avtale med hypotesen, kombinasjonen av MK2206, en pakt inhibitor, og en HDACi (smørsyre eller LBH589) indusert høyere apoptose i CC celler i forhold til hver agent alene. Eksponeringen mot begge legemidlene også re-sensitivisert de HCT-R celler til apoptose. Til slutt ble begrepet samtidig indusering av kanonisk Wnt aktivitet og undertrykkelse av AKT signalesettes til en kombinasjon av diett-avledet midler. Diet-avledet Pakt hemmere (koffeinsyre phethyl ester, sulforaphane, dilallyl trisulfide) trykt de butyratproduserende-induserte nivåer av Pakt, og økte apoptotiske virkninger av smørsyre i både narkotika-sensitive og resistente CC celler.
våre funn kan oversettes til (a) CC terapi ved anvendelse av kombinasjoner av syntetiske HDACis og inhibitorer av pakt, samt (b) CC forebyggelse basert på dietter som resulterer i tilstrekkelige mengder av butyrat og pakt inhibitorer.
Citation : Bordonaro M, Tewari S, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) En Bytt fra Canonical til Noncanonical Wnt signalnettverk som megler Drug Resistance i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10,1371 /journal.pone.0027308
Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 13 oktober 2011; Publisert: 03.11.2011
Copyright: © 2011 Bordonaro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Darina Lazarova støttes av NIH /NCI tilskuddet # 1R15CA152852-01 og institusjonelle midler fra The Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Michael Bordonaro støttes av AICR bevilgning # 09A002, NIH /NCI-NIDDK # 1R15CA149589-01 og institusjonelle midler fra The Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Beta-catenin – avhengige (kanonisk) Wnt signalisering innledes ved binding av Wnt ligander til deres reseptorer på celleoverflaten, og denne binding utløser en kaskade av intracellulære hendelser som fører til opphopning av Ser-37 /Thr- 41 defosforylert beta-catenin. Den defosforylerte beta-catenin er transkripsjonelt aktive, og det danner komplekser med LEF /TCF-proteiner for å kontrollere ekspresjonen av gener i flere hundre [1] – [3]. Den konstitutiv aktivering av Wnt signalering på grunn av mutasjoner i dens komponenter, APC og /eller beta-catenin, fremmer tumorigenese i tykktarmen [4] – [7], og slike mutasjoner er karakteristisk for de fleste coloncancere (CC). Vi har observert at CC-celler med mutasjoner i komponenter av den kanoniske Wnt aliserte hyper indusere denne veien i nærvær av histondeacetylase inhibitorer (HDACis), for eksempel butyrat (et fermenteringsprodukt av fiber i tykktarmen), Saha, MS275, og trichostatin A [8], [9]. Disse HDACis indusere apoptose i CC-celler, og de apoptotiske nivåene er avhengig av den ganger endring i kanonisk Wnt aktivitet: CC-celler som utviser lav induksjon av Wnt /catenin signalisering i nærvær av HDACis er forholdsvis motstandsdyktig mot apoptotiske effekter av midler; imidlertid celler som gjennomgår betydelig aktivering av kanonisk Wnt signalering er svært følsomme for apoptose [8]. Vi har fastslått at økningen i Wnt /catenin aktivitet in butyrat-behandlede CC celler går forut for apoptotiske arrangementet siden (a) inhibering av apoptose ved en generell kaspaseinhibitor ikke oppheve økningen i Wnt /catenin aktivitet (upubliserte data), og (b) flowcytometri-sortert cellefraksjoner med høy kanoniske Wnt signal bestå av både live og apoptotiske celler; imidlertid, hvis apoptose var en forutsetning for induksjon av Wnt aktivitet, alle celler med høy Wnt aktivitet som burde vært apoptotisk [8]. Den direkte forbindelse mellom brette induksjon av Wnt /catenin aktivitet og graden av apoptose ble observert i analyser av ti humane CC-cellelinjer som er utsatt for butyrat, og dette forholdet er forårsakende siden: (a) celler som uttrykker induserbare dominant negativ TCF4, som undertrykker Wnt /catenin signalering, redusert utstillings apoptose i nærvær av butyrat [8], og (b) flowcytometri-sorterte cellefraksjoner med høy kanonisk Wnt aktivitet ha en høyere andel av apoptotiske å leve celler enn cellefraksjoner med lave nivåer av kanonisk Wnt aktivitet [8]. Det å finne den hyper-aktivering av Wnt /beta-catenin signal resulterer i høye nivåer av apoptose [8], [9] er konsistent med de rapportene som fold endringer i signalveier, snarere enn absolutte nivåer av signalering, lokke fram betydelig fysiologisk respons fra -celler [10] – [12]
Gjennom analyser av ti humane CC cellelinjer, er det funnet at HCT-116-celler svare på butyrat og andre HDACis med hyper-induksjon av wnt /catenin signal- og høye nivåer. av apoptose [8]. Imidlertid, ved gradvis eksponering av HCT-116-celler til økende konsentrasjoner av butyrat, avledet vi butyrat-resistent HCT-R-celler. Disse celler vokser i nærvær av 5 mM butyrat, en konsentrasjon som induserer høye nivåer av apoptose i sperre HCT-116-celler [9]. HCT-R-celler er også kryssresistente mot strukturelt forskjellige HDACis, slik som TSA, MS-275, Saha, og LBH589 [9]. Siden vi har fastslått at (1) den apoptotiske utfall i CC-celler er avhengig av induksjon av kanonisk Wnt aktivitet [8], og (2) den hyper-aktivering av kanoniske Wnt signalisering i butyrat-behandlede CC-celler er delvis innledet ved den ligand-reseptor-nivå [9], hevdet vi at medikamentet-sensitive og medikament-resistente CC-celler varierer i uttrykket av wnt ligander, reseptorer og /eller positive og negative modulatorer av wnt /catenin signalering ved ligand-reseptor-nivå [8], [9]. I denne rapporten har vi undersøkt disse mulighetene, og funnet ut at CC celler overlever eksponering for smørsyre eller andre HDACis ved å redusere kanoniske Wnt signal og øke beta-catenin -. Uavhengig (noncanonical) Wnt signal
Resultater
Økt uttrykk for formidlere av noncanonical Wnt signal i HDACi bestandig CC celler
Vi har tidligere rapportert at HDACi resistente fenotype av HCT-R-celler er ikke på grunn av redusert acetylering av histonproteinene, men snarere manglende evne til cellene til hyper-indusere kanoniske Wnt signal i samme grad som foreldre HDACi-sensitive HCT-116 celler [9]. Våre funn antydet at undertrykkelsen av Wnt /catenin aktivitet i HDACi-resistente celler er på grunn av den endrede ekspresjon av wnt ligander, deres reseptorer, og /eller modulatorer av Wnt signalering ved ligand-reseptor-nivå [9]. For å undersøke denne muligheten, analyserte vi uttrykket profiler av mock- og smørsyre-behandlet HCT-116 (HDACi-sensitive) og HCT-R (HDACi-resistente) celler ved Wnt-spesifikke PCR-matriser (SA biovitenskap). Analysene viste at ved å utsettes for 5 mM butyrat, HCT-116 og HCT-R-celler signifikant økt ekspresjon av
WNT5A
og
WNT11
mRNA (data ikke vist), og vi har bekreftet denne endringen i ekspresjon på proteinnivå (fig. 1A). I forhold til HCT-116-celler, HCT-R-celler uttrykte høye nivåer av både ligander, og tilstedeværelsen av utskilt WNT5A og WNT11 i vevskultur media kondisjonert med CC-celler ble bekreftet (fig. 1A)
(A) representant western blot analyser av CC celler og deres kondisjonert medium etter eksponering for mock-behandling (M) eller 5 mM butyrat (B) i 19 timer. (B og C). Stanse av
WNT5A Hotell og
ROR2
uttrykk øker Wnt /catenin transkripsjonen aktivitet av HCT-116 (B) og HCT-R (C) celler. Celler (50.000 /brønn) ble ko-transfektert med journalister for Wnt /catenin transkripsjonen aktivitet (TopFlash eller FopFlash, 50 ng /brønn), PRL-TK som en kontroll for transfeksjon effektivitet og kontroll,
ROR2
, eller
WNT5A
sirnas (10 pmol /brønn). Nukleinsyrer ble innført i cellene via en omvendt transfeksjon protokoll med Lipofectamine 2000 i 96-brønners plater. På 31 timer etter transfeksjon ble cellene eksponert for 20 timer å spotte (m) eller 5 mM butyrat (b) behandling. Wnt transkripsjonen aktivitet ble beregnet som forholdet mellom aktiviteten til TopFlash (med villtype Lef /Tcf bindingsseter) og FopFlash (med mutant Lef /Tcf bindingssteder). Hver transfeksjon ble utført i duplikate brønner; dataene representerer gjennomsnittet av resultatene av tre forsøk. (D). Overekspresjon av WNT5A undertrykker kanoniske Wnt transkripsjonen aktivitet av HCT-116 celler. Kotransfeksjonssystemet av HCT-116 celler (50000 /brønn) med Wnt aktivitets journalister TopFlash eller FopFlash (50 ng per brønn), og pcDNANeo3.1 eller WNT5A-uttrykke konstruere (150 ng per brønn) ble utført gjennom en omvendt transfeksjon med Lipofectamine (0,7 ul /brønn) i 96-brønners plater. Post-transfeksjon ble cellene eksponert for uekte behandling (m) eller 5 mM butyrat (b) i 20 timer. Hver transfeksjon ble utført i duplikate brønner; dataene representerer gjennomsnittet av resultatene av minst tre forsøk. (E) Undertrykkelse av
ROR
to uttrykk øker følsomheten av de HDACi-resistente HCT-R-celler til vekstundertrykkende virkning av butyrat. HCT-R-celler (10
6) ble nucleofected med 175 pmol av
ROR2 plakater (Invitrogen) eller kontroll siRNA, og 500.000 celler ble utplatet per brønn i en 6-brønns plate. På 24 timer ble cellene eksponert for mock behandling (m) eller 5 mM butyrat (b) i 17 timer. Ved 48 timer post-nucleofection ble cellene sådd ut i 100 eller 200 per brønn i triplikater. Prosent klonal vekst ble beregnet som antall kolonier som stammer fra en enkelt cellesuspensjon av 100 celler. Forsøket ble gjentatt tre ganger, og resultatene er gjennomsnittet av dataene i de tre forsøkene. Statistisk signifikante forskjeller er vist med stjerner
Avhengig av reseptoren sammenheng WNT5A og WNT11 indusere enten kanoniske eller noncanonical Wnt signalering [13] -. [17]. Siden WNT5A induserer noncanonical Wnt aktivitet i nærvær av reseptoren ROR2, analyserte vi ekspresjonen av ROR2 i de to CC cellelinjer. Western blot analyser avslørte at begge celletyper uttrykt ROR2; imidlertid, HCT-R-celler oppviste høyere nivåer av ROR2 enn HDACi-sensitive HCT-116-celler (Fig. 1A). Derfor er det mulig at WNT5A fungerer som en noncanonical ligand i butyratproduserende-behandlede celler, og at HCT-R celler utviser høyere nivåer av noncanonical Wnt signal enn HCT-116 celler.
For å fastslå effekten av WNT5A og ROR2 på Wnt aktivitet, vi co-transfektert HCT-116 og HCT-R celler med transkripsjons journalister for Wnt /beta-catenin signal (TopFlash eller FopFlash) og sirnas til
WNT5A
eller
ROR2
. Den reduserte uttrykk for WNT5A og ROR2 i HCT-116 celler økte Wnt /beta-catenin transkripsjonen aktivitet i en statistisk signifikant måte (Fig. 1B). Butyratproduserende behandlet HCT-116 celler med undertrykt
ROR2 Hotell og
WNT5A
uttrykk økte nivåer av kanonisk Wnt /catenin aktivitet til 233,0 ± 19,8 og 161,0 ± 32,0 sammenlignet med kontroll-transfekterte celler ( 94,8 ± 10,8), P 0,05, i mock-behandlet HCT-R celler, undertrykkelse av
ROR2 Hotell og
WNT5A
uttrykk ikke vesentlig endre Wnt transkripsjonsnivå sammenlignet med de i celler transfektert med kontroll siRNA (17,4 ± 4,6 og 12,8 ± 1,8, sammenlignet med 15,3 ± 3,7 i kontrollceller, P 0,05) (figur 1C.). Men i butyrat-behandlede HCT-R-celler, undertrykkelse av
ROR2
og
WNT5A
ekspresjon resulterte i signifikant høyere nivåer av kanonisk Wnt transkripsjonen aktivitet, sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (60.2 ± 12,5 og 53,1 ± 8,4 sammenlignet med 31,2 ± 7,9 i kontrollceller, P . 0,05) (figur 1C). Derfor WNT5A og dens reseptor ROR2 motvirke induksjon av Wnt /beta-catenin aktivitet i butyratproduserende behandlet HCT-116 og HCT-R celler.
Denne konklusjonen ble støttet av resultatene fra overekspresjon av WNT5A i HCT -116 celler. HCT-116 celler som uttrykker lavere nivåer av WNT5A enn HCT-R celler (Fig. 1a), ble ko-transfektert med Wnt /beta-catenin journalister og en tom vektor, eller en WNT5A uttrykk vektor. Cellene co-transfektert med en tom vektor økt sin Wnt /beta-catenin aktivitet (TopFlash /FopFlash) fra 5,2 ± 1,1 til 62,2 ± 9,3; mens cellene overekspresjon WNT5A økt sin Wnt /beta-catenin aktivitet fra 3,7 ± 0,1 til 13,2 ± 0,3 (Fig. 1 D). Forskjellen i Wnt /beta-catenin transkripsjonen aktivitet mellom kontroll- og WNT5A-transfektert celler i nærvær av smørsyre var statistisk signifikant (P 0,05).
Siden stanse av
ROR
2 ekspresjon i HCT-R-celler resulterte i høyere nivåer av Wnt /beta-catenin signalering, og vi har tidligere observert at jo høyere induksjon av Wnt /beta-catenin i CC-celler tilsvarer høyere følsomhet av cellene for virkningene av smørsyre [8 ], analyserte vi klonal vekst av HCT-R celler nucleofected med kontroll siRNA eller
ROR
2 siRNA. I fravær av butyrat, styre siRNA- og
ROR
2 siRNA-transfekterte celler viste en liten, men statistisk signifikant, forskjell i klonal vekst (75,3 ± 1,4% vs. 67,6 ± 3,4%, P 0,05) . I nærvær av butyrat, forskjellen i klonal vekstevne var mer uttalt; kontroll-nucleofected HCT-R celler utstilt klonal vekst på 71,3 ± 3,8% og
ROR
2 siRNA-nucleofected celler utstilt 51,4 ± 5,5% av klonal vekst (Fig. 1E).
Induksjon av den AKT /PKB overlevelse sti av WNT5A og ROR2 i CC celler
økningen i WNT5A uttrykk i butyratproduserende behandlet HCT-116 og HCT-R celler bedt et søk etter nedstrøms effektorer av liganden. Flere noncanonical WNT5A-induserte veier er blitt identifisert, og i det minste to av disse er ROR2 avhengige: den fosfatidylinositol-3-kinase (PI3-K) /AKT signale utløst av fosforyleringen av AKT-kinase [18] – [20], og JNK-signalveien [21] – [23]. I samsvar med disse rapportene, observerte vi at Serine473-fosforylert AKT (Pakt) uttrykkes ved høyere nivåer i HDACi-resistente HCT-R celler sammenlignet med HCT-116 celler, og i begge cellelinjene, eksponering for butyrate økte nivåer av Pakt ( fig. 2A).
(A) HDACi-resistente HCT-R celler uttrykker høyere nivåer av Pakt enn HDACi-sensitive HCT-116 celler. Cellene ble sådd ut i 6-brønners plater på 450.000 celler per brønn, og ved 24 timer ble utsatt å spotte (M) eller 5 mM butyrat (B) behandling i 17 timer. Total protein lysater ble analysert ved hjelp av western blot-analyser, og nivåene av Ser473-fosforylert AKT (pakt), total AKT (AKT), og ACTIN ble påvist som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) HCT-R-celler er mer resistente overfor 5-fluorouracil (5-FU) apoptose enn foreldre HDACi-sensitive HCT-116-celler. Celler ble eksponert for 1,5 mM 5-FU i 24 timer, og apoptotiske analyser ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Prosentandel av levende celler ble beregnet ved å dividere antall levende celler ved det totale antall celler som ble analysert. (C) stanse av ROR2 uttrykk i HCT-R celler reduserer nivåene av Ser473-fosforylert AKT. Én million celler ble nucleofected med kontroll eller
ROR
2 sirnas (175 pmol, Invitrogen), og belagt på 500.000 per brønn i 6-brønners plater. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene eksponert for håne (M) eller 5 mM butyrat (B) i 19 timer. Totale cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot; en representativ western blot er vist. Den søylediagram under western blot bildet representerer kvantifisering av pakt nivåer i tre uavhengige eksperimenter ved densitometri, er forskjellen mellom butyrat-behandlede celler er statistisk signifikant (P 0,05), (D) .Overexpression av rekombinant WNT5A i HCT-116 celler resulterer i økt Pakt nivåer. HCT-116-celler ble transfektert med tom vektor eller en WNT5A ekspresjonsvektor, og er valgt for stabil ekspresjon av disse konstruksjonene. Duplikate prøver ble analysert for ekspresjonsnivåer av WNT5A og pakt som beskrevet ovenfor; en representativ western blot er vist. Søylediagrammet under western blot representerer kvantifisering av Pakt i tre uavhengige eksperimenter ved densitometri, P 0,05. (E) Representative western blot-analyse av SW620 human CC celler og SW620R celler som vokser på 3 mM butyrat. De to cellelinjene ble utsatt for håne (m) eller 5 mM butyrat (b) behandling i 17 timer og analysert som i Fig.2A. (F). SW620 celler som uttrykker eksogent WNT5A utstillingstrykkes induksjon av Wnt /beta-catenin transkripsjon av smørsyre, P 0,05. Transfeksjon og analyser ble utført som beskrevet i fig. 1D.
Siden AKT /PKB er en celle overlevelse vei, begrunnet vi at høye Pakt nivåer i HCT-R celler kan beskytte cellene ikke bare mot apoptose indusert av HDACis, men også mot andre apoptotiske stimuli . For å evaluere denne muligheten, vi sammenlignet responsen til HCT-R-celler og deres HDACi-sensitive motstykker, HCT-116-celler, til 5-fluorouracil (5-FU), en vanlig brukt kjemoterapeutisk middel for CC. Konsentrasjonen av 5-FU som er nødvendig for 50% veksthemming er blitt rapportert for HCT-116-celler, og medikamentresistente cellelinjer avledet fra HCT-116-celler, og er i området fra 0,09 mM til 2,4 mM [24]; Derfor, analyserte vi responsen til HCT-116 og HCT-R-celler til 1,5 mM 5-FU (Fig. 2B). Behandling av HCT-116-celler med 5-FU resulterte i en betydelig reduksjon i antallet av levende celler fra 86,7 ± 8,3 til 48,1 ± 8,0 (P 0,05); mens den samme eksponeringen av HCT-R cellene ikke signifikant endre antall levende celler. Dermed mock-behandlede celler viste 95,8 ± 2,1% levende celler, og 5-FU – behandlede celler viste 91,6 ± 4,2% levende celler, p . 0.05 (Fig. 2B)
Muligheten for en årsakssammenheng mellom økte nivåer av Pakt og uttrykk for WNT5A og ROR2 ble testet via genet taushet genet overekspresjon eksperimenter. Stanse av
ROR2
ekspresjon i HCT-R-celler ved siRNA resulterte i en moderat reduksjon i pakt nivåer, og forskjellen i pakt nivåer var statistisk signifikant bare mellom butyrat-behandlede celler (fig. 2C), overekspresjon av WNT5A i HCT-116 celler førte til økte nivåer av Pakt, og forskjellen var også statistisk signifikant (fig. 2D).
Andre studier med menneskets tykktarm kreft celler SW620, og stammer fra dem SW620R celler, som vokser på 3 mM butyrat, indikerte at disse celler ikke uttrykker påvisbare nivåer av ROR2 (data ikke vist); Men de uttrykker WNT5A, og eksponering for butyrat øker pakt nivåer (fig. 2E). Interessant, eksogen ekspresjon av WNT5A i SW620 celler undertrykkes Wnt /beta-catenin avhengig transkripsjon selv i fravær av detekterbar ROR2 uttrykk: i nærvær av butyrat Wnt aktivitet i WNT5A-uttrykkende SW620-celler ble 271 ± 32, og disse igjen kontroll-transfekterte celler var 389 ± 35 (fig. 2F). Derfor, i tillegg til ROR2, kan andre reseptorer formidler den WNT5A signal, og den nedstrøms aktivering av AKT-kinase.
Undertrykkelse av pakt nivåer forsterker apoptotisk respons av CC-celler til HDACis
Siden AKT signalering er en stor celle overlevelse vei, begrunnet vi at den undertrykkelse i CC celler utsatt for HDACis ville forsterke apoptotiske effekten av disse midlene. Vi utnyttet MK2206, som er en allosterisk inhibitor av AKT [25], og fastslått at ved 5 uM midlet undertrykker pakt nivåer i både HCT-116 og HCT-R-celler (fig. 3A). For å finne ut hvordan Wnt /beta-catenin signal påvirkes av AKT kinase inhibitor MK2206 alene eller i kombinasjon med en HDACi (smørsyre eller LBH589), vi analyserte nivåer av transkripsjonelt aktiv (dephosphorylated) beta-catenin i HCT-116 celler behandlet for 8 eller 17 timer (fig. 3B). Etter 8 timer, HDACi-sensitive HCT-116-celler oppviser ikke tegn på apoptose, som bestemt ved strømningscytometri analyser med Annexin V (data ikke vist); imidlertid, ved 17 timer apoptose allerede er detektert og beta-catenin spaltes ved dens N- og C-terminale ende av caspaser (se pilen på andre panel på fig. 3B). Derfor analyser av transkripsjonelt aktive beta-catenin nivåer ble utført ved 8 timer i HCT-116 og HCT-R-celler (fig. 3B og 3C). I begge cellelinjer, ble MK2206 ikke føre til vesentlige endringer i nivåene av aktivt beta-catenin sammenlignet med prøvene som er behandlet med en HDACi alene; imidlertid, ble nivåene av pakt trykkes ved MK2206 i alle behandlinger (Fig. 3D).
(A) Undertrykkelse av pakt nivåer i CC celler ved allosterisk inhibitor MK2206. Representative western blot analyse av CC celler eksponert i 17 timer for å håne (m), 5 mM butyrat (B), butyrat og 1 pM MK2206 (MK1B), eller butyrat og 5 uM MK2206 (MK5B). (B) ved steady-state nivåer av transkripsjonelt aktiv beta-catenin er ikke redusert i HCT-116 celler ved kombinert behandling med en HDACi og MK2206. Celler ble utsatt for 8 eller 17 timer til uekte behandling (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Totalt cellelysater ble analysert for steady-state nivåer av total og Ser37 /Thr41 dephosphorylated beta-catenin. Representative western blot-analyse er vist. (C) Aktive beta-catenin nivåer i HCT-R-celler eksponert i 8 timer for å håne (m), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 mikrometer MK2206 (LMK). (D) Representative western blot analyse av Ser473-fosforylert AKT (pakt) og total AKT (AKT) nivåer i CC celler eksponert i 17 timer for å håne (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK) , 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). (E) Induksjon av Wnt /catenin avhengig transkripsjonen aktivitet (TopFlash /FopFlash) i CC celler ved en HDACi (butyrat eller LBH589) ikke undertrykkes av en pakt inhibitor. Celler ble nucleofected på én million med 1 ug av plasmid (TopFlash eller FopFlash) og PRL-TK, fortynnet og sådd ut i 30.500 celler per brønn i 96-brønners plater. Ved 24 timer post-nucleofection ble cellene behandlet i 8 timer med uekte (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 um MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Data representerer middelverdien fra resultatene av minst tre forsøk. Statistisk signifikante forskjeller er vist med en stjerne. (F) apoptotiske nivåer i HCT-116 og HCT-R-celler eksponert for HDACis og en pakt inhibitor. Cellene ble eksponert i 28 timer til: uekte behandling (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Prosent apoptose og nekrose ble beregnet ved å dividere antall av apoptotiske og nekrotiske celler ved det totale antall celler som ble analysert. Hvert forsøk hadde tredoble prøver per behandling; Data representerer gjennomsnittet av tre forsøk. Statistisk signifikante forskjeller er vist med en stjerne. (G, H) SW48 human CC celler med villtype KRAS er like følsom som HCT-116 celler med muterte KRAS til den kombinerte behandlingen med en HDACi og en pakt inhibitor. SW48-celler ble behandlet og analysert som beskrevet i Figs.3D og 3F. Representative Western blot og apoptotiske data, som representerer gjennomsnittet av tre forsøk, er vist. Statistisk signifikante forskjeller er vist med en stjerne.
For å direkte måle Wnt /beta-catenin transkripsjon i celler eksponert for en pakt hemmer og /eller HDACis, vi transfektert celler med en reporter for Wnt /beta- catenin aktivitet (TopFlash) eller med en kontroll reporter (FopFlash) (fig. 3E). Wnt /catenin transkripsjonen aktivitet (TopFlash /FopFlash) i HCT-116 celler eksponert for spotte eller MK2206 behandlingen var 3,9 ± 0,4 og 2,8 ± 0,8, henholdsvis (P 0,05). I HCT-116 celler eksponert for smørsyre, eller smørsyre og MK2206 økte aktiviteten til 8,73 ± 2,9 og 12,8 ± 1,3 (for begge behandlingene, P 0,05). Til slutt, når HCT-116-celler ble utsatt for LBH589 eller LBH589 og MK2206 økte Wnt /beta-catenin aktivitet til 7,1 ± 0,6 og 11,3 ± 2,1, henholdsvis, (P 0,05). I HCT-R celler, eksponering spotte, MK2206, smørsyre, smørsyre og MK2206, LBH589, eller LBH589 og MK2206 resulterte i Wnt /beta-catenin aktivitet på 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5 og 17,2 ± 1,2, henholdsvis, (P 0,05 for kombinatoriske behandlinger sammenlignet med behandlinger med en HDACi alene). Dermed gjør MK2206 ikke undertrykke oppregulering av Wnt transkripsjonen aktivitet av HDACis.
Den kombinerte effekten av HDACis og MK2206 på apoptose ble målt via flowcytometri analyser. Selv om det ikke var noen statistisk signifikant forskjell mellom de apoptotiske nivåene i mock og MK2206-behandlede celler, tilsetning av MK2206 til butyrat eller LBH589 førte til en statistisk signifikant økning i apoptose i forhold til behandling med hver HDACi alene (fig. 3F). Således HCT-116-celler utsatt for håne eller MK2206 oppviste apoptotiske nivåer av 12,8 ± 2,2% og 14,3 ± 3,5%, henholdsvis, (P 0,05). Behandling av HCT-116 celler med smørsyre, eller smørsyre og MK2206 resulterte i 44,2 ± 1,5% og 64,2 ± 4,4% apoptose, henholdsvis (P 0,05). I nærvær av LBH589 eller LBH589 og MK2206, HCT-116-celler viste 55,7 ± 6,9% og 73,5 ± 4,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). In, HCT-R celler, til eksponering spotte eller MK2206 behandling resulterte i 11,4 ± 3,6% og 11,0 ± 4,0% apoptose, henholdsvis (P 0,05); eksponering for butyrat, eller butyrat og MK2206 resulterte i 14,4 ± 3,6% og 25,2 ± 4,1% apoptose (P 0,05), og eksponering for LBH589, eller en kombinasjon av LBH589 og MK2206 førte til 31,6 ± 5,3 og 45,7 ± 4,4% apoptose ( P . 0,05)
Foreløpig Pakt inhibitor MK2206 er i en klinisk studie for tykktarm kreft med villtype KRAS; Men kombinasjonen av en HDACi og en pakt kinase inhibitor var svært effektive i å indusere apoptose i HCT-116-cellelinjen, som er
KRAS
-mutant, og i re-sensibiliserende HCT-R-celler til den apoptotiske effekter av HDACis. For å sammenligne effektiviteten av medikamentkombinasjonen i CC-celler med villtype KRAS, vi analyserte apoptotisk respons av humane tarmkreftceller SW48 celler. SW48-celler reagerte på kombinasjonen av en HDACi og MK2206 med statistisk signifikant økning i apoptose (Fig. 3G): mock og MK2206 behandlinger resulterte i 16,6 ± 0,7% og 16,9 ± 0,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Behandling av SW48 celler med butyrat, eller butyrat og MK2206 resulterte i 49,7 ± 4,4 og 75,6 ± 1,2% apoptose, henholdsvis (P 0,05), og eksponering for LBH589, eller LBH589 og MK2206 resulterte i 56,1 ± 6,3% og 78,3 ± 3,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Western blot analyser bekreftet at MK2206 trykt pålitelig de HDACi-induserte nivåer av Pakt i SW48 CC celler (Fig. 3H).
Diet-avledet stoffer som etterligner effekten av syntetiske HDACis og Pakt hemmere
Mens kombinasjonen av syntetisk HDACis og Pakt hemmere kan brukes i CC terapi eller i forebygging hos pasienter med økt risiko for CC (for eksempel pasienter med resected CC og /eller kronisk IBD), diettregimer som gir metabolitter med HDAC- og Pakt inhibitoriske funksjoner kan bli en CC forebyggende tilnærming for den generelle befolkningen. Siden butyrat er de mest potente diett-avledede HDACi produsert i tykktarmen [26], bør en CC-forebyggende diett inneholde tilstrekkelig nivå av fermenterbare fiber. For å finne en pakt inhibitor som kan utledes fra kosten, utførte vi en litteratur søk og fant publikasjoner om sulforaphane, naturlige sphingadienes, hvitløk-avledet diallyl trisulfide (DAT), koffeinsyre phenethyl ester (CAPE, fra Honeybee propolis), curcumin, og resveratrol, som alle hemme pakt nivåer i forskjellige celletyper [27] – [33]. Vi testet noen av disse forbindelser for deres evne til å undertrykke nivåene av butyrat-indusert pakt i CC-celler, og fant at CAPE, DATS, og Sulforafane undertrykket økningen av pakt kinase nivåer i butyrat-behandlede HCT-116-celler, og bare CAPE og DATS var aktive i HCT-R-celler (fig. 4A). Av de tre testede forbindelser, CAPE var de mektigste i å undertrykke butyratproduserende-induserte nivåer av Pakt i begge celletyper; men det gjorde ikke induserer apoptose i en av disse cellene selv (Fig. 4B). Derfor, i HCT-116 celler, mock eksponering og behandling med 4 ug per ml CAPE resulterte i 12,2 ± 3,1% og 11,9 ± 0,8% apoptose, henholdsvis; eksponering til butyrat eller kombinasjonen av butyrat og CAPE resulterte i 44,8 ± 1,8% og 78,4 ± 6,5% apoptose, henholdsvis (P 0,05). I HCT-R-celler, mock eksponering, behandling med butyrat, og behandling med CAPE alene førte til 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7% og 10,9 ± 3,0% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Når imidlertid HCT-R-celler ble utsatt for kombinasjonen av CAPE og butyrat, de apoptotiske nivåene økte med nesten tre ganger, til 30,6 ± 3,6% (P 0,05) (figur 4B.). Etterfølgende analyser viste at i butyrat-behandlede HCT-R-celler, CAPE undertrykker de fosforylerte nivåer av p55-subenheten av fosfatidyl-inositol-3-kinase (PI3K), en vesentlig oppstrøms aktivator av AKT-kinase (fig. 4C). Imidlertid er den nøyaktige trinnet der denne undertrykkelse finner sted ikke er kjent, og det er et fokus for videre forskning. Vi oppdaget ikke konsekvent undertrykkelse av fosfor-p55 PI3K nivåer i HCT-116 celler eksponert for CAPE og smørsyre (data ikke vist).
(A) Diet-avledet forbindelser undertrykke butyratproduserende-indusert Pakt nivåer i CC celler. Representative western blot av celler eksponert i 14 timer til uekte behandling (M), 5 mM butyrat (B), 5 mM butyrat og 4 ug /ml CAPE (BC), 5 mM butyrat og 20 uM Sulforafane (BS), 5 mM butyrat og 40 um DATS (BD). Påvisning av Pakt, ble total AKT (AKT), og ACTIN utført med total celler lysatene. 2B].
