Abstract
For å lette prostatakreft avbildning ved hjelp av målrettede molekyler, vi bygget ultralyd nanobubbles kombinert med spesifikk anti-PSMA ( prostata spesifikt membranantigen) Nanobodies, og evaluert deres
in vitro
bindingskapasitet og
in vivo
bildebehandling effekt. De «rettet» nanobubbles, som ble konstruert via en biotin-streptavidin-systemet, hadde en gjennomsnittlig diameter på 487,60 ± 33,55 nm og båret anti-PSMA nanobody som demonstrert ved immunfluorescens. Mikroskopi avslørte målrettet binding av nanobubbles
in vitro
til PSMA-positive celler. I tillegg ble ultralyd indikatorer på nanobubble imaging (inkludert ankomsttid, peak tid, peak intensitet og forbedret varighet) evaluert for ultralydavbildning i tre typer dyr xenografter (LNCaP, c4-2 og MKN45), og viste at disse fire indikatorer på målrettede nanobubbles utstilt signifikante forskjeller fra tomme nanobubbles. Derfor denne studien ikke bare presenterer en ny tilnærming for å målrette prostatakreft ultralyd, men gir også grunnlag og metoder for å konstruere små store og high-effektive målrettede ultralyd nanobubbles
Citation. Fan X, Wang L, Guo Y Tu Z, Li L, Tong H, et al. (2015) Ultralyd Nanobubbles Bære Anti-PSMA Nanobody: Bygg og Application i prostatakreft-Målrettet Imaging. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10,1371 /journal.pone.0127419
Redaktør: Serge Muyldermans, Vrije Universiteit Brussel, Belgia
mottatt: 05.11.2014; Godkjent: 14 april 2015; Publisert: 25 juni 2015
Copyright: © 2015 Fan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet er finansiert av National Natural Science Foundation (tilskudd nummer~~POS=HEADCOMP: 30970830), Chongqing Science Foundation (tilskudd nummer: cstc2012jjB0072) og Science Foundation i Jiangxi Institutt ungdoms Utdannings (tilskudd nummer: GJJ12142).
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den spesifikke identifisering av prostata kreft er en klinisk. presserende oppgave [1]. I denne forbindelse har utviklingen av ultralyd molekylær avbildning gitt en ny vei for tidlig prostatakreft diagnose. Denne teknikken involverer merking av bildedannende forbindelser med spesifikke antistoffer eller ligander for å generere målrettet ultralydkontrastmidler i stand til å binde seg til spesifikke vev eller lesjoner. Etter intravenøs administrasjon, disse molekylære prober aggregere spesielt i målet vev via blodsirkulasjonen, og dermed gir ultralydbasert bestemt avbildning av sykdomsfremkallende endringer på et molekylært eller cellenivå. [2]. Imidlertid mikron-skala ultralydkontrastmidler (mikrobobler) i dag brukes på de fleste aktuelle avbildningsstudier har diametere på 1-10 um [3,4]. Tumor med våt strukturer er ofte mangelfull fordi svulsten blodkar har ufullstendige basalmembraner, mangler glatt muskulatur lag og viser dårlig lymfatisk sirkulasjon; Følgelig er disse fartøyer oppviser økt permeabilitet i forhold til normale blodkar, en virkning som er blitt betegnet forbedret permeabilitet og retensjonseffekten (EPR). Til tross for dette permeabilitet, varierer den maksimale vaskulære porediameter fra omkring 380 til 780 nm, og teoretisk bare partikler 700 nm i diameter kan passere gjennom tumoren neovaskularisering; derfor vanlig ultralydkontrastmidler ofte ikke kan passere gjennom det vaskulære karet som forskning tumorceller og lette spesifikk tumoravbildning [5,6]. Etter disse EPJ funnene, har enkelte grupper nylig bygget nanobubbles og undersøkt deres permeabilitet. De nanobubbles utarbeidet av Yin
et al
. hadde en gjennomsnittlig diameter på 436,8 ± 5,7 nm, og som vises passiv tumor målretting [7]. I våre foreløpige undersøkelser, vi også utviklet målrettede nanobubbles med en gjennomsnittlig diameter på 644,30 ± 55,85 nm som gjennomføres monoklonale antistoffer mot prostata-spesifikt membran antigen (PSMA) og undersøkt bilde potensialet i disse nanobubbles i prostatakreft xenotransplantater i nakne mus. Våre resultater viser at disse målrettet nanobubbles kunne forsterke xenograft peak tid og intensitetsverdier sammenlignet med tomme nanobubbles og var derfor bidrar til tumor-spesifikke målrettede bildebehandling [8].
Likevel monoklonalt antistoff målrettet nanobubbles har to åpen begrensninger. Først murine monoklonale antistoffer som er immunogene i mennesker. For det andre, de store molekylvekt på antistoff-partikkelkomplekser resultere i lavt antall målretting komplekser nådde de tiltenkte målene [9], og dermed går på bekostning av imaging utfall. Derfor er identifisering av en liten størrelse antistoff som er praktisk, høy effektiv og gjennomtrengende avgjørende for svulst målrettet molekylær avbildning. Oppdagelsen av Nanobodies [10] tilveiebragt en lovende strategi for å utvikle en ny type ultralyd-målrettede nanobubble fordi slike Nanobodies er mindre i størrelse. Nærmere bestemt, IgG2 og IgG3 (tungkjede antistoffer) fra dyr i Camelidae familien naturlig mangler lette kjeder og CH1 domenet; Dette er de minste funksjonelle kjente antigene bindingsfragmenter og er preget av lav molekylvekt, praktisk uttrykk, stabilitet og lav immunogenisitet
in vivo
. Derfor Nanobodies er et lovende prospekt med hensyn til nøyaktig diagnose og målrettet terapi [11-16]. Men svært få tumor målrettet ultralyd nanobubbles kombinert med spesifikke Nanobodies ble beskrevet. I dette arbeidet har vi utviklet liten størrelse og høy effektiv målrettet nanobubble formulering, som bar den anti-PSMA nanobody, for å bekrefte hypotesen om at nanobody belagt nanobubbles kan forbedre den diagnostiske verdien av ultralyd i prostatakreft.
Materialer og metoder
celler og dyr
LNCaP, noe som er typisk human androgen-avhengig prostata kreftcelle, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, som er en undertype av LNCaP-cellelinje og en human androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinje, ble kjøpt fra ViroMed Laboratories ved Johns Hopkins, USA. MKN45, en human magekreft cellelinje som kontroll, ble hentet fra Chinese Academy of Medical Sciences Cancer Institute (Beijing, Kina). Fire til fem uker gamle BALB /c-nu nakne mus (Experimental Animal Center, Third Military Medical University) holdes i et bestemt patogen-fritt miljø ble anvendt som beskrevet nedenfor. Alle dyreforsøk ble godkjent av dyreetikk komité The Third Military Medical University.
Western blotting i tre cellelinjer
LNCaP, c4-2 og MKN45 celler ble dyrket til logaritmisk fase, renset med fosfat-buffret saltvann (PBS), plassert på is og suspendert i 400 ul radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) protein lyseringsbuffer. Deretter ble alle tumorcellelysatene overført til et 1,5 ml rør og sentrifugert ved 15 000 rpm og 4 ° C i 15 min. Den resulterende supernatant ble overført til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. En bicinchoninic syre (BCA) kit ble deretter brukt til å bestemme proteinkonsentrasjonen. I tillegg ble prøvene supplert med 5X natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ladningsbuffer, blandet og kokt i 5 minutter for å full denaturere proteiner. Tretti mikrogram av totalt protein ble separert via SDS-PAGE og overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran med en halvtørr blottingmetoden. Membranen ble blokkert med 5% skummet melk-buffer ved romtemperatur i 2 timer og ble deretter probet suksessivt med en 1: 400 fortynning (2,5 ug /ml) av et anti-hPSMA monoklonalt antistoff ved 4 ° C over natten og en 1: 2000-fortynning av et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoff ved romtemperatur i 2 timer; membranen ble vasket tre ganger med PBST (PBS med 0,1% Tween-20) etter hvert antistoff inkubasjon.
Generering av spesifikk og biotinylert nanobody
ekstracellulære område av PSMA ble først uttrykt i eukaryote human embryonisk nyre (HEK) -293-celler, hvoretter det rekombinante protein ble anvendt som beleggmateriale for å screene et tidligere etablert naturlig nanobody bibliotek betegnet NA-PDL. Tilsvarende ble nanobody fager som er i stand til spesifikt å binde til PSMA ved de molekylære og cellulære nivåer erholdt [17]. Disse fagene ble deretter sekvensert, og de følgende primere ble utformet i henhold til sekvense resultater: forover primer, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (som inneholder en
BamHI
stedet) og revers primer, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (som inneholder en
HindⅢ
nettstedet ). En polymerase kjedereaksjon (PCR) ble deretter utført ved hjelp av positive fag-klon som en mal for å amplifisere mål-genet; reaksjonsproduktet ble deretter klonet inn i
BamHI Hotell og
Hindi
stedene i pET28a ekspresjonsvektoren (Novagen /EMD Millipore, Bille, MA, USA), som inneholder en seks-histidin tag. Rekombinant vektor ble forvandlet til
E
.
coli
DH5a belastning. De resulterende positive kloner ble sekvensert for å identifisere de med den korrekte sekvens; de riktige kloner ble forvandlet til
E
.
coli
Rosseta uttrykk stamme (DE3; Novagen /EMD Millipore) for å gi et høyt ekspresjonsnivå. Ni-Agarose (Qiagen, Venlo, Nederland) ble deretter anvendt for å rense den histidin-merket nanobody. Deretter merket vi nanobody med løsningen av biotin. I detalj, ble to milligram Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) helt løst i 360 mL sterilt DDH
2o. Denne løsningen ble inkubert med nanobody ved 4 ° C i 72 timer, etterfulgt av dialyse ved 4 ° C over natten. UV-spektroskopi ble benyttet for å bestemme antistoffkonsentrasjonen. Nærmere bestemt, teoretisk ekstinksjonskoeffisient fra sekvensen av den nanobody var 21 555 M
1 • cm
-1, og absorbansen ved 280 nm ble målt for å beregne antistoffkonsentrasjonen i henhold til formelen «Absorbans = ε ( ekstinksjonskoeffisient, M
-1 · cm
-1) X-veilengde (cm) X konsentrasjon (M) «. En biotin kvantifisering kit (Pierce /Thermo Scientific) ble anvendt for å beregne biotin konsentrasjonene i prøvene og generere biotin /antistoff-forhold konjugering
Validering av nanobody affinitet via enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA)
for å få affinitet biotinylert nanobody, ble en standard konkurranse ELISA brukes. Hver brønn av en mikrotiterplate ble belagt med 1 mM rekombinant PSMA-antigen, blokkert med 3% bovint serumalbumin (BSA) -PBST ved romtemperatur i 2 timer og deretter skyllet tre ganger med PBST. Deretter ble 1 nM biotinylert nanobody inkubert med økende konsentrasjoner av antigen ved konsentrasjoner varierende fra 0,1 nM til 100 uM i parallelle eppendorfrør. Etter 30 minutters inkubering, ble 90 ul av reaksjonsblandingen tilført til brønnene på den antigen-belagte mikrotiterplater. Etter 10 min inkubasjon ble blandingene kastet, og brønnene ble vasket med PBST. Deretter 100 mL av HRP-streptavidin konjugert-biotin (Kangwei Century, Beijing, Kina) ved en 1: 2000 fortynning ble tilsatt til hver brønn, fulgt av inkubering ved 37 ° C i 1 time. Hver brønn ble så vasket 5 ganger med PBST før tilsetning av 100 ul /brønn av en 3,3 «, 5,5»-tetrametylbenzidin (TMB) arbeidsløsning (Beyotime, Shanghai, Kina) og inkubering av platen ved romtemperatur i 15 min . Reaksjonene ble avsluttet ved tilsetning av 50 ul av en 2 M svovelsyreoppløsning til hver brønn. Absorbansen ved 450 nm ble deretter bestemt for hver brønn. Derfor er den høyeste optiske tettheten (OD)
450nm burde ha blitt observert ved lave konsentrasjoner av antigen. Konsentrasjonen av antigen hvor halvmaksimalt ELISA signaler finnes tilsvarer dissosiasjonskonstant K
D.
Forberedelse og validering av målrettede nanobubbles
blandinger som inneholder spesifikke forhold av dipalmitoyl phosphatidyl kolin (DPPC, Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Sverige), biotinylert distearoyl fosfatidyletanolamin (Bio-DSPE; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA) og difenylfosforylazid (DPPA; Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Tyskland) ble veid og lyofilisert bruke en frysetørker (Shanghai Pudong Freeze Tørking Equipment Co, Shanghai, Kina). Alikvoter av disse blandingene ble plassert i ampuller; oktafluorpropan (C
3F
8) gass ble langsomt injisert for å erstatte luft overlegg i hetteglass. Før bruk, en blandet oppløsning av en del glycerol: Det ble 9 deler PBS tilsatt til flasken, etterfulgt av oppvarming til 37 ° C for å lette oppløsning. Preparatene ble horisontalt blandet i en omvendt måte ved hjelp av en ST-serien amalgamator (AT M biomaterialer Co, LTD, Beijing, Kina) med følgende konkrete arbeids parametere: vibrasjonsfrekvens, ≥4500 /min; vibrasjonsamplitude, 15 ± 1 mm og vibrasjon varighet, 60 s [8]. Disse preparater ble deretter lov til å hvile ved 4 ° C for å lette faseseparering. Den nedre fase melkeaktige suspensjonen ble sentrifugert ved 300 opm i 3 minutter for å separere de biotinylerte nanobubbles i bunnen av mikrobobler på toppen. Deretter ble 3 pg av avidin tilsatt pr 10
7 nanobubbles, etterfulgt av inkubasjon ved 4 ° C i 1 time. Preparatene ble hensatt for å lette faseseparasjon; det øverste laget ble deretter oppsamlet og sentrifugert ved 300 rpm i 3 min. Prøven ble skyllet tre ganger for å fjerne overdreven avidin. Deretter ble 1 ul biotinylert nanobody tilsatt pr 10
7 nanobubbles, etterfulgt av inkubasjon, sentrifugering og skylling for å fjerne overskudd av biotinylert nanobody. De resulterende nanobubbles ble utpekt målrettet NBs, mens nanobubbles uten antistoff tilskudd ble utpekt Blank NBs. Partikkelstørrelsen av de 2 produkter ble analysert på en Malvern Zetasizer nano ZS90 analysator (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK), og en tellekammer ble anvendt for å bestemme konsentrasjonene av de 2 produkter. deres
in vitro
bildeeffekter ved ulike konsentrasjoner ble undersøkt med en agarose modell under forutsetning av en mekanisme indeks på 0,12 og en gevinst på 60%.
For å undersøke om denne metoden kan være brukes til å feste biotinylert nanobody til nanobubbles, ble Blanke eller Målrettede NBS inkubert med et muse-anti-His-antistoff i 1 time, etterfulgt av sentrifugering, skylling og inkubering i mørket med et fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-mus-antistoff i 3 timer ved 4 ° C. Prøvene ble sentrifugert og vasket for å fjerne ubundet sekundært antistoff. Prøvene ble deretter observert under et fluorescens mikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) for å evaluere fluorescerende bindende.
Nanobubbles og
in vitro
cellebindingsanalysen
LNCaP , c4-2 og MKN45 celler dyrket til den logaritmiske fase ble sentrifugert, og sådd ut på dekk i brønnene til en 24-brønns plate ved en densitet på 1,5 x 10
4 celler /brønn. Cellene ble dyrket over natten, fiksert med 4% paraformaldehyd og skylt tre ganger med PBS. To grupper av dekkglass ble fremstilt per celletype; En gruppe ble supplert med 30 pl av målrettet NBS (1,0 x 10
8 /ml), og den andre med Blank NBS, hvoretter blandingene ble inkubert ved 4 ° C i 3 timer. Deretter ble objektglassene skylt tre ganger med PBS, plassert med forsiden ned på objektglass og observert under et lysmikroskop (Olympus Corporation) for å undersøke nanobubbles. Adhesjonen prosentandel, definert som prosentandelen av celler merket med ≥4 målrettede nanobubbles i en gitt tilfeldig felt, ble beregnet for å vise binding. Dette forsøk ble gjentatt 4 ganger.
Nanobubble avbildning i forskjellige xenotransplantater
Logaritmisk-fase LNCaP prostatakreftceller og c4-2 celler ble anvendt for å fremstille cellesuspensjoner ved en tetthet på 5 x 10
7 celler /ml; MKN45 gastrisk kreft celler i logaritmisk fase vekst ble anvendt for å fremstille cellesuspensjoner av 1 x 10
7 celler /ml. To hundre mikroliter av hver cellesuspensjon ble deretter blandet med 200 ul av BD Matrigel (BD Biosciences, USA); de resulterende blandingene ble subkutant inokulert i 4-5 uker gamle BALB /c-nu nakne mus med en kroppsvekt på 18-20 g. Fem dyr ble anvendt for hver xenograft tumortypen. De xenotransplantater ble overvåket daglig med en verniercaliper inntil tumorene nådde en omtrentlig diameter på 1 cm.
tumor-bærende nakne mus ble bedøvet via administrert intraperitonealt 1% natrium pentobarbital. For avbildning, ble overflatene av både sonden og tumor dekket med en 5 mm tykk koblingsmiddel. En 50 mm L12-5 bredbånds lineær ultralydprobe som er koblet til et iU22 ultralydsystem (Philips, Amsterdam, The Netherlands) ble brukt til å utføre B-mode ultralydavbildning av xenotransplantater. Når tverrsnittet av en xenograft var fullt avdekket, ble proben immobilisert for å tillate oppsett av ultralyd-modus (mekanisk indeks, 0,12; vinning, 90%). Ultralyd ble igangsatt da det sentrale sentrum var plassert på svulsten sentrum. Hver test dyr mottok 200 ul Tom eller målrettet NBS (3 x 10
7-partikler) via haleveneinjeksjon, hvoretter rørledningen ble spylt med 100 ul saltvann. Dynamiske bilder ble samlet til tumorområdet var helt fri for NBs. I tillegg ble 200 ul av en ekvivalent mengde av en annen type nanobubbles og 100 mL saltløsning administrert på en lignende måte for å lette ultralyd under identiske betingelser; imaging data samlet inn fra de samme hårløse mus ble analysert ved hjelp Qlab8.1 programvare (Philips) å sammenligne de 4 bildeparametre (ankomst tid, peak tid, peak intensitet og forbedret varighet) i xenograft området med 2 kontrastmidler. Ankomsttiden ble definert som intervallet fra injeksjonen er fullført og den første tidspunkt ved hvilket 10% toppintensitet ble oppnådd. Forbedret varighet ble definert som intervallet mellom de 2 tidspunktene ved hvilke 10% toppintensitet ble oppnådd. Peak tid ble definert som intervallet mellom injeksjons tid og tiden for toppintensitet [18].
Statistiske analyser
Statistiske Package for Social Science (SPSS) 16,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ble anvendt for å utføre de statistiske analyser. Alle de kvantitative data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Den målrettet NB og Blank NB ultralyd indikatordata i
in vitro Hotell og
in vivo
imagings ble innhentet og analysert ved hjelp av en sammenkoblet sample T-test. Ultralyd indikatorer på nanobubbles som målrettede 3 xenograft typene ble analysert ved hjelp av en analyse av varians (ANOVA). En P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Histogrammer og kurven med ikke-lineær regresjon ble plottet ved hjelp GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
Resultater
PSMA uttrykk i ulike cellelinjer og forberedelse av PSMA spesifikke nanobody
Western blotting ble brukt til å undersøke PSMA uttrykk i LNCaP, c4-2 og MKN45 celler. Resultatene viste at blant disse cellelinjene, LNCaP-celler uttrykte den høyeste grad av PSMA, etterfulgt av c4-2-celler; MKN45 mage kreftceller viste ingen åpenbar PSMA uttrykk (Fig 1).
LNCaP cellene uttrykte et høyere nivå av PSMA enn c4-2 celler, mens MKN45 celler viste ingen uttrykk.
fagen klone valgt via prokaryote panorering ble brukt for rekombinant ekspresjon og tilrettelagt oppkjøpet av His-merket PSMA spesifikke nanobody (molekylvekt, 18 kD). Etter biotinylating den nanobody, ble UV-spektroskopi utført for å vise at antistoffkonsentrasjonen var 0,59 mg /ml, og biotin /nanobody konjugering-forholdet var ca. 3,6: 1 i henhold til en biotin kvantifisering kit. Basert på prinsippet med konkurrerende binding, er dissosiasjonskonstanten lik konsentrasjonen ved halv-maksimal verdi i ELISA. Derfor K
D av biotinylert nanobody mot rekombinant PSMA var 519 nM, mens den ikke-lineær regresjon hadde en god passform med R
2 = 0,978 (Fig 2).
Kurven med ikke-lineær regresjon om konsentrasjonen av recombint PSMA spenner fra 0,1 nM til 100 mikrometer er obbtained.
Målrettet NB Karakterisering av fluorescensmikropskopi
de nanobubbles og biotinylated nanobody ble konjugert med streptavidin biotin. En lysmikroskop og Malvern Zetasizer nano ZS90 analysator ble brukt til å studere morfologi og diametre av målrettede NBs og Blanke NBs og avslørte at begge viste vanlige sfæriske former og målrettet NB forberedelse hadde en gjennomsnittlig diameter på 487,60 ± 33,55 nm, mens blank NB produkt hadde en gjennomsnittlig diameter på 445,30 ± 32,96 nm; deres
in vitro
bildeeffekter, nemlig ultralydsignaler, hadde ingen forskjeller på samme konsentrasjon (P = 0,06, figur 3). Immunfluorescens senere avslørt at målrettede NBs slippes grønn fluorescens signaler under mikroskop (Fig 4). I motsetning til dette Blank nanobubbles, som ikke ble merket med biotinylert nanobody, ikke vise en tilsynelatende fluorescens-signal, noe som indikerer at nanobubbles spesifikt bundet til nanobody via biotin-avidin-interaksjoner.
A Malvern Zetasizer analysator ble anvendt for å undersøke partikkelstørrelser. Blanke NBS (uten biotinylert nanobody) hadde en gjennomsnittlig diameter på 445,30 ± 32,96 nm (A), mens Målrettet NBS (med biotinylert nanobody) hadde en gjennomsnittlig diameter på 487,6 ± 33,55 nm (B). Og det er ingen forskjell i deres
in vitro
bildebehandling i samme konsentrasjoner (C).
Mikroskopisk observasjon av Målrettet NBs (A og B). De ringlignende strukturer med tykke membraner er NBS (B). Resultatene viste at målrettede NBs kunne spesifikt innlemme nanobody via biotin-avidin interaksjoner.
Binding av målrettede nanobubbles til celler
Cell-nanobubble bindende ble undersøkt via mikroskopi (Fig 5). De målrettede nanobubbles klebet beste til de LNCaP-celler, som hver er rekruttert et gjennomsnitt på 7,27 ± 1,70 nanobubbles for å gi en klebeprosentandel av 98,00 ± 2,31%, etterfulgt av c4-2-celler, som hver er rekruttert 5,67 ± 1,61 nanobubbles for å gi en vedheft prosentandel av 92,00 ± 8,64%. I motsetning til dette ingen signifikant binding ble observert mellom de nanobubbles og MKN45 celler, med en binding frekvens på 0,72 ± 0,87 nanobubbles per celle. Til slutt, ingen åpenbar binding ble identifisert mellom Blank NBs og hver av de 3 typer celler, noe som gjenspeiles av de tilsvarende bindende antall 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 og 0,68 ± 0,94 per celle, henholdsvis.
under et lysmikroskop, både LNCaP-celler og celler c4-2 synlig bundet til målrettet NBS (A og B), mens MKN45 celler ikke ble bundet til målrettet NBS (C). Ingen av de 3 typer celler vises fremtredende binding til Blank NBs (D, E og F). Scale, 5 mikrometer.
Ultralyd xenograft bildebehandling
Qlab8.1 programmet ble brukt til å analysere og sammenligne bilde indikatorer (ankomsttid, topp tid, peak intensitet og forbedret varighet) de målrettede NBs og Blank NBs i de 3 xenograft gruppene (fig 6 og tabell 1). I prostatakreft xenografter (LNCaP og c4-2), resultatene viste at toppintensiteten verdier (P-verdier, 0,003 og 0,002, henholdsvis) og forbedret varighet (P-verdier, 0.001 og 0.004, henholdsvis) av Målrettet NBs var signifikant høyere og lengre, henholdsvis, enn i det tomme NBs. Men ankomsttider og rushtiden ble utvisket mellom 2 typer nanobubbles. I kontrollgruppen MKN45 magekreft xenograft gruppe, målrettet NBs og Blank NBs utstilt ingen klare forskjeller med hensyn til de 4 indikatorene. En sammenligning av de 3 typer xenografter med hensyn til de målrettede nanobubble bildeegenskaper avdekket at c4-2 xenotransplantater viste signifikant forskjellige toppintensitetsverdier, forbedret varighet, ankomsttider og rushtiden sammenlignet MKN45 xenografter, med respektive P verdier av 0,024, 0,007, 0,000 og 0,050. Videre LnCap xenotransplantater viste også signifikant forskjellige ankomsttider og toppverdier sammenlignet med de av MKN45 xenotransplantater (P verdier av 0,000 for begge), selv om de resterende 2 indikatorene ikke var signifikant forskjellig. Derfor bruker ultralyd avbildning med målrettet NBs, både androgen-avhengige LNCaP prostatakreftceller og androgen-uavhengig c4-2 celler manifest større toppverdier og senere ankomsttider enn kontrollmagekreft xenografter. Videre, når de LnCap og c4-2 xenotransplantater ble sammenlignet, ankomsttiden (P = 0,026), topp tid (P = 0,005) og toppverdien (P = 0,008) signifikant forskjellig, mens den forbedrede varighet var ikke signifikant forskjellige (P = 0,261). Men til de små forskjellene (bare mindre enn ett sekund) i ankomsttid og tid topp mellom to svulster eller to typer kontrastmidler er ikke lett å bli observert, så toppverdien og bilde varighet bør være fokus for mest bekymring .
paneler B, E og G viser de klassiske tverrsnitt av 3 typer transplantater under B-mode ultralyd. Paneler A, D og H viser binding av Blank NBS til xenografter ved toppintensiteten. Paneler C, F og jeg viser binding av Målrettet NBs til xenografter på topp intensitet. De ultralydbilder i både LNCaP og c4-2 xenografter avslørte at bildeintensiteten var tilsynelatende høyere enn bildeintensiteten oppnådd med den blanke NBs på topp nanobubble nivå. I MKN45 xenografter, imaging resultatene av målrettet NBs og Blanke NBs var sammenlignbare på topp nanobubble nivå. Av alle, blå områdene representerer exnografts, mens røde og gule områdene henholdsvis representerer de ulike bildeområder i LNCaP og c4-2 exnografts.
Diskusjoner
Foreløpig prostata kreft er vanlig og alvorlig kompromitterer helsen til eldre menn, ofte fører til døden [19,20]. Selv om transrectal ultralyd har blitt en rutinemessig undersøkelse verktøy som spiller en viktig rolle i sykdommer biopsien, overvåking og behandling, har kliniske studier viste at denne fremgangsmåten er begrenset av utilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet [21-23]. Det nye feltet molekylær billeddiagnostikk integrerer ultralyd, molekylærbiologi og andre disipliner og dermed introduserer en ny vei ved å diagnostisere og behandle svulster; Det gir også mulighet for spesifikk prostatakreft avbildning på et molekylært nivå og tilsvarende tidlig diagnose [24]. Foreløpig bygging og utforming av prostata-kreft-målrettet mikrobobler har hovedsakelig fokusert på målet molekyler involvert i angiogenese, inkludert målrettede mikrobobler som bærer vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor type 2 (VEGFR2) antistoff. Imidlertid har denne designen 2 åpenbare ulemper: i) det meste mikron-skala kontrastmidler har dårlig permeabilitet og kan ikke reise på tvers av tumorblodårene til å gå inn i mellomrommene og derfor rettet mot bobler kan ikke direkte overholde prostata kreft celler; ii) denne metoden har lav spesifisitet som fører til en manglende evne til å utføre spesifikk prostata kreftvev avbildning [25]. EPR-innsats av tumorer som gjør det teoretisk mulig å benytte nanobubbles i molekylær avbildning av tumor ekstravaskulære matrise og tumor-parenchymale celler. Tidligere, ved hjelp av lys- og elektronmikroskopi, viste vi at nanobubbles med en gjennomsnittlig diameter på 435,20 ± 60,53 nm kan passere gjennom de vaskulære endoteliale hullene i xenotransplantater, og dermed gi et eksperimentelt grunnlag for å oppnå målrettet avbildning av tumor ekstravaskulære strukturer [26]. I mellomtiden, denne metoden også tar full nytte av noen av egenskapene til nanobubbles, for eksempel relativt stor overflate, sterk vedheft kapasitet og langvarig bilde
in vivo
.
PSMA er en prostata kreft biomarkør med en høyere spesifisitet og sensitivitet enn andre lignende molekyler. PSMA er spesielt høyt uttrykt i hormon-ildfast prostatakreft og prostata kreft metastaser [27]. I tillegg, det ekstracellulære område av PSMA, som består av 707 aminosyrer, har plass til flere antigene epitoper. Derfor har PSMA blitt et forskningsfokus i forhold til immun målrettet kreftterapi og molekylær tumoravbildning [28,29]. Sanna
et al
. konjugert urea-baserte PSMA inhibitor DCL til mikroboble konvolutten komponenten poly (melke-ko-glykolsyre-polyetylenglykol (PLGA-PEG), for således å generere en målrettet ultralydkontrastmiddel som skal anvendes for kreftcelle prostata bindende evalueringer
i vitro product: [30]. i vår tidligere undersøkelse, den vedtatte monoklonale antistoff var immunogen, som sammen med de store molekylvektene av antistoffkomplekser paticle, førte til dårlig penetrasjon vev. Følgelig, etter venøs administrering, konsentrasjonen i målområdet var lav. Dette problemet sterkt begrenset større klinisk anvendelse av mikrobobler for målrettet diagnostikk og bildediagnostikk. Alternativt, bestemte små-molekyl peptider som ofte brukes i molekylær imaging studier. Selv om disse forbindelsene er lett syntetiseres og har lav molekylvekt , høye nivåer av vev infiltrasjon og lav immunogenitet, er de også oppviser problemer som kort halveringstid (tilbøyelighet til å hydrolyse og renal clearance) og flyktige slektskap, som i betydelig grad skade stabiliteten av korte peptid-bærende målrettede nanobubbles. I motsetning til dette, Nanobodies er meget stabile og oppviser høy antigen-affinitet. Dessuten har de svært lav immunogenisitet, som dokumentert av dyre eksperimentelle resultater som ingen humorale eller cellulære immunresponser ble oppdaget etter gjentatt administrasjon [31]. Derfor har de ulike egenskapene til Nanobodies gitt overbevisende bevis om gjennomførbarheten av målretting og konsentrere nanobubbles innenfor målet vev
in vivo
. Selv Nanobodies skal ha blitt brukt i molekylær imaging studier, inkludert noen molekylære nukleærmedisinske applikasjoner [32-34], anvendelsen av denne teknologien inn i feltet av ultralyd har vært begrenset til ultralyd mikrobobler [35]; til vår kunnskap, har noen forskere om nanobody-merket nanobubbles blitt rapportert i dette feltet.
Derfor brukte vi en biotin-avidin system for å integrere fordelene av nanobubbles og nanobody ved å generere nanobubbles som næret PSMA nanobody.
