Abstract
Simvastatin og lovastatin er statiner tradisjonelt brukt for å senke serum kolesterol nivåer. Men det finnes bevis som indikerer deres potensielle kjemoterapeutiske egenskaper i kreft. I denne studien brukte vi bioinformatiske analyse av offentlig tilgjengelig data for å systematisk identifisere gener som er involvert i motstand mot cytotoksiske effektene av disse to stoffene i NCI60 cellelinje panel. Vi brukte de farmakologiske data tilgjengelig for alle NCI60 cellelinjer å klassifisere simvastatin eller lovastatin resistente og sensitive cellelinjer, henholdsvis. Deretter utførte vi hel-genom enkle markør kasus-kontroll forening tester for lovastatin og simvastatin resistente og sensitive celler ved hjelp av sine offentlig tilgjengelige Affymetrix 125k SNP genomiske data. Resultatene ble så evaluert ved anvendelse av RNAi metodikk. Etter korrigering av
p-
verdier for flere tester ved hjelp av falske Discovery Rate, våre resultater identifisert tre gener (
NRP1
,
COL13A1
,
MRPS31
) og seks gener (
EAF2
,
ANK2
,
AKAP7
,
STEAP2
,
LPIN2
,
PARVB
) forbundet med resistens overfor simvastatin og lovastatin, respektivt. Funksjonell godkjenning ved RNAi bekreftet at stanse av
EAF2
uttrykk modulert responsen HCT-116 tykktarmskreftceller til begge statiner. Oppsummert har vi lykkes utnyttet de offentlig tilgjengelige data om NCI60 cellelinjer for å utføre hel-genomassosiasjonsstudier for simvastatin og lovastatin. Våre resultater indikerte gener involvert i cellulær respons på disse statiner og siRNA studier bekreftet rollen som
EAF2
svar på disse stoffene i HCT-116 tykktarmskreftceller
Citation. Savas S , Azorsa DO, Jarjanazi H, Ibrahim-Zada jeg, Gonzales IM, Arora S, et al. (2011) NCI60 Cancer Cell linje paneldata og RNAi analyse bidra til å identifisere EAF2 som en modulator av Simvastatin og Lovastatin Response i HCT-116 celler. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10,1371 /journal.pone.0018306
Redaktør: Eric Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 27 juli 2010; Godkjent: 03.03.2011; Publisert: 04.04.2011
Copyright: © 2011 Savas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av TGEN institusjonell forskningsmidler og støtte fra prostata kreft fundament (H. Ozcelik). Y.H. Choi er støttet av et fellesskap fra den kanadiske Breast Cancer Foundation – Ontario kapittel. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
simvastatin og lovastatin er to statiner som tradisjonelt brukes for å senke serumkolesterolnivåer. Statiner er reversible inhibitorer av mikrosomale enzym HMG-CoA-reduktase, som omdanner HMG-CoA til mevalonat. Dette er en tidlig hastighetsbegrensende trinn i kolesterol-biosyntesen. Hos mennesker hemming av HMG-CoA-reduktase av statiner reduserer intracellulær kolesterol-biosyntesen, som deretter fører til transkripsjonelt oppregulert produksjon av mikrosomal HMG-CoA reduktase og celleoverflate LDL-reseptorer. Men simvastatin og lovastatin varierer i noen viktige aspekter vedrørende graden av metabolisme og antall aktive og inaktive metabolitter [1]. Mer nylig har statiner fått betydelig varsel som cytostatika basert på preklinisk bevis på deres antiproliferativ, proapoptotiske, anti-invasive og radiosensitizing egenskaper [2], [3], [4], [5], [6]. Rollen av statiner i kolesterol stoffskiftet kan forklare sine potensielle cytotoksiske egenskaper.
Kolesterol er en viktig lipid som akkumuleres i membranmikrodomener som kalles lipid flåter. Lipid flåter spiller en viktig rolle i signaloverføring som utløser cellevekst, overlevelse og mange andre prosesser som er korrelert med kreft. Kolesterol akkumulering i tumorer er blitt vist ved en rekke studier i de siste [7], [8], [9], [10]. Akkumulering av kolesterol i lipid Flåte mikrodomener av plasmamembranen kan spille en rolle i å stimulere signaltransduksjonsveier. Freeman og Solomon (2004) har foreslått at økningen i kolesterol i prostata tumorcellemembran, som kan følge av en økning i sirkulerende nivåer eller fra deregulering av endogen syntese, gi opphav til koalesens av flåten domenene [7]. Dette vil igjen kunne ha en virkning på segregering av positive regulatorer av onkogene signalisering innenfor flåter, samtidig som negative regulatorer i fluidet mosaikken membranfraksjonen [7]. Det ble videre foreslått at studiet av funksjonen av lipid flåter i prostatakreftceller kan gi innsikt i rollen av sirkulerende kolesterol i ondartet vekst og på den potensielle forholdet mellom diett og aggressiv sykdom. Derfor kan karakterisering av proteiner i kolesterolrike mikrodomener tjene til å bedre klargjøre signalveier, noe som vil føre til identifisering av nye biomarkører for sykdomsutvikling og nye mål for kreftbehandling.
Variabel respons på medikamentell behandling , slik som motstand, er et alvorlig helseproblem. Flere faktorer, slik som alder og diett, er innblandet i kjemoterapeutisk resistens ved å påvirke medikamentet adsorpsjon, transport, metabolisme, og deres fysiologiske virkninger. Genetiske faktorer er også involvert i legemiddelresistens. For eksempel er det genetiske variasjoner som forårsaker forandringer i gen-funksjon og ekspresjon innblandet i medikamentresistens [11], [12]. Derfor, for en optimal behandlingseffekt, må vi vite gener assosiert med resistens samt deres profiler i hver pasient (personlig medisin). I denne forbindelse danner NCI60 cellelinjen panel et lovende verktøy for å oppdage nye kreftlegemidler. Den NCI60 cellelinjen panel blir etablert fra en rekke forskjellige tumorer i for å identifisere forbindelser som kan drepe kreftceller [13]. Så langt har denne cellelinjen panel blitt utsatt til over 100 000 ulike forbindelser og de cellulære responser i form av vekstrater er målt. Ved hjelp av NCI60 cellelinjer, ble L-asparaginase identifisert som effektive i å drepe en undergruppe av ovariekarsinomer [14]. Dette panelet ble også brukt i utviklingen av bortezomib for behandling av myelom [13].
De eksperimentelle resultatene oppnådd på NCI60 cellelinjer er samlet på nettsiden Developmental Therapeutics Program (DTP) [13]. I tillegg til å farmakologiske data som er nevnt ovenfor, andre data for NCI60 cellelinjer som er tilgjengelig på DTP nettstedet, slik som genotypene av Affymetrix 125k chip enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs). Affymetrix 125k SNP chip-plattformen har en tett sett av SNP (~124,000) og anvendes for å identifisere de genomiske regioner som er forbundet med sykdom predisposisjon og variabel behandlingsrespons. Tidligere har vi brukt NCI60 celle linje for å undersøke legemiddelresistensgener i menneskets genom [15], [16], [17]. I denne studien tok vi nytte av både de tilgjengelige farmakologiske og genomiske data på NCI60 cellelinjer for å identifisere gener assosiert med cytotoksisk motstand mot simvastatin og lovastatin og utført funksjonelle studier ved hjelp av siRNA å validere
EAF2
som en modulator av statin aktivitet.
Materialer og metoder
Lovastatin og simvastatin Resistent og Sensitive NCI60 cellelinjer
Vi har fulgt en tidligere utviklet tilnærming til å utføre den hel-genom case-control krets studie [15], [16], [17]. Kort fortalt har vi benyttet de offentlig tilgjengelige data på NCI60 cellelinje panel postet på Developmental Therapeutics Program (DTP) nettsiden til NCI /NIH (https://dtp.nci.nih.gov/index.html). Først lastet vi GI
50 data (mengden av de stoffer som kreves for å hemme veksten med 50%) ved 10
-4,5 M dose for cellelinjene. Deretter kategorisert vi cellene som forholdsvis motstandsdyktig eller følsom etter normalisering av log
10 til GI
50 for å oppnå en middelverdi på null og standardavvik på en slik som tidligere beskrevet [15], [16], [17] . Den standardiserte GI
50-verdier ble så analysert ved SAS 9,1 (PROC Univariate) med en ikke-parametrisk fordeling test (densitet kjerne estimering) med beregnede båndbredder på 0,2476 og 0,2896, så vel som asymptotisk midlere integrerte kvadratfeil (AMISE) av 0,0224 og 0,0172, for simvastatin og lovastatin, respektivt. De visuelle antimodes ble brukt som en cut-off verdi på -0,2 for simvastatin og -0,3 for lovastatin å definere sensitive (kontroller) og resistente (tilfeller) NCI60 celler (figur 1). I tilfelle av simvastatin, var det 19 følsomme og 32 resistente cellelinjer i panelet (tabell S1). Det var 16 sensitiv og 41 resistente cellelinjer i NCI60 panel for lovastatin (tabell S2).
tetthet viste to store moduser for hvert legemiddel. De visuelle antimodes ble brukt som en cut-off verdi på -0,2 for simvastatin og -0,3 for lovastatin å definere sensitive og resistente NCI60 cellelinjer.
Hel-Genome Case-kontroll Association Study
Vi har lastet ned de Affymetrix 125k SNP data (som hadde ca 124 000 SNPs fordelt med en median intermarker avstand på 8,5 kilobaser) fra DTP nettsiden (https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. Hel-genom enkle markør kasus-kontroll foreningen tester for lovastatin og simvastatin motstandsdyktig og sensitive celler ble utført av plink programvare [19] med chi-kvadrat test standard. Bare de SNP’er som har blitt genotypet i minst 75% av cellene og hadde et minimum mindre allel frekvens på 2% (n = 79 622) ble inkludert i denne studien, og ble anvendt for forening testing. For å redusere sjansen for falske positive assosiasjoner, en korreksjon for multippel testing,
, dvs.
. False Discovery Rate (FDR) foreslått av Benjamini og Hochberg (FDR_BH) [20] ble også utført av plink programvare. Resultater med
p
verdier. 0,05 ble betraktet som signifikant
Informasjon knyttet til genomisk steder (lende
versus
intergeniske) av SNPs ble enten hentet fra dbSNP databasen [21 ] eller ved sprengning de SNP-flankerende sekvenser mot det menneskelige genom og ved å visualisere ved hjelp av alternativet Map Viewer NCBI [22].
epistasis (SNP-SNP Interaksjon) Analyse
Logistikk regresjonsmodeller var brukes til å analysere toveis interaksjoner mellom de SNPs assosiert individuelt med simvastatin eller lovastatin motstand, forutsatt at en additiv modell for hver SNP. For å teste SNP-SNP interaksjoner, brukte vi sannsynligheten ratio test tilnærming ved å sammenligne anfall av to modeller, en med SNP viktigste effektene bare og den andre med de viktigste effektene og toveis interaksjon effekt. De tilsvarende p-verdier ble justert for multippel testing av FDR_BH [20] metode.
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT-116 og HT-29 ble hentet fra den amerikanske Type Culture Collection (Manassas, Virginia). HCT-116 er en tumorigen kolorektal karsinom-cellelinje etablert fra en primærtumor [23]. HT-29 er et kolon adenokarsinom klasse II-cellelinje etablert fra primærtumorceller [24]. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IU /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. Alle medier reagenser ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Cellelinjene ble rutinemessig holdt ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære.
Funksjonell validering for lovastatin og simvastatin allergi
For siRNA og legemiddelstudier, celler ble transfektert med siRNA ved revers transfeksjon i 384-brønns plater som beskrevet [25]. Kort, siRNA ble trykket på 384-brønners plater i 2 ul volum. Fortynnet siLentFect reagens (BioRad, Hercules, CA) i OptiMem (Invitrogen) ble tilsatt til brønnene og tillatt å kompleks med siRNA i 30 minutter ved romtemperatur. HCT-116 og HT-29 celler ble resuspendert i vekstmedium uten antibiotika og tilsatt til platene til en sluttkonsentrasjon på 1000 celler /brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Etter 24 timer, varierende konsentrasjoner varierende fra 12 nM til 667 uM av enten lovastatin eller simvastatin ble tilsatt til analyseplatene og inkubert i ytterligere 72 timer. Total levedyktig celleantall ble bestemt ved tilsetning av Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) og relative luminescens heter (RLU) ble målt ved anvendelse av en EnVision plateleser (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Drug effekt ble beregnet ved å dividere gjennomsnitt av RLU-verdiene for de medikamentbehandlede brønnene ved gjennomsnittet av RLU-verdiene for bærerbehandlede brønner. De GI
50 verdier ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, California) og verdiene ble vist som beregnet GI
50 +/- 95% konfidensintervall. Statistisk analyse av dataene ble gjort ved hjelp av tosidige paret Student
t
test.
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Validering av Gene stanse av kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Total RNA fra cellelinjer ble isolert ved hjelp av Qiagen sin RNeasy Kit fra Qiagen Inc. (Valencia, California). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Nanodrop-1000 i henhold til produsentens anbefalinger. iScript cDNA Synthesis Kit fra Bio-Rad Inc. (Hercules, CA) ble anvendt for å fremstille cDNA fra 500 ng av hver prøve. Relativ mRNA uttrykk ble målt ved bruk av TaqMan genuttrykk Analyser fra ABI Inc. (Foster City, CA) under produsentens anbefalte forhold på Opticon to PCR System (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Relativ kvantifisering av genekspresjon ble utført i tre eksemplarer. qPCR reaksjoner ble utarbeidet i 96-vel formatert qPCR plater fra Bio-Rad (Hercules, CA). Reaksjonene ble fremstilt i singleplexes, tre paralleller av hver prøve med tre paralleller av endogene kontroller og ikke-templat-kontroller (NTC). Normalisering ble utført i nærvær av en referanse gen, GAPDH, og den relative kvantifisering av genekspresjonen endringene ble analysert ved anvendelse av ΔΔCt metoden [26], [27].
Resultatene
Genome brede foreninger studier av NCI60 panel for lovastatin og simvastatin respons
Bruke NCI60 kreft-screening data for simvastatin og lovastatin, cellelinjer ble kategorisert som relativt følsomme eller resistente (figur 1). Resultatene oppnådd fra de hel-genom case-control assosiasjons studier for simvastatin og lovastatin Resultatene er oppsummert i tabell 1 og 2, respektivt. Åtte SNP’er assosiert med resistens mot simvastatin. Disse SNPs ble plassert på kromosomer 8q, 9p (to SNPs), 10p, 10Q, 13q (to SNPs) og 14p. Fem av SNP ble plassert i intergeniske områder, mens de resterende tre SNP ble plassert i introner kjente gener (tabell 3), nemlig intron 6
NRP1 plakater (neurophilin), intron 37 av
COL13A1
(type XIII kollagen, alfa 1), og intron 6 av
MRPS31 plakater (mitokondrie ribosomalt protein S31). To intergeniske SNPs, rs4129864 og rs1343844 var plassert svært tett (7387 basepar fra hverandre), noe som tyder på at de var sannsynlig å være knyttet til hverandre.
Når det gjelder lovastatin, ble totalt 25 SNPs assosiert med sin motstand. Seks av disse SNPs ble plassert i kjente eller antatte gener (tabell 2 og 3): i intron 5 av
EAF2 plakater (ELL forbundet faktor 2), i intron 2 av
ANK2 plakater (nevrale ankyrin 2), i intron 1 av
AKAP7 plakater (protein kinase A anker protein 7), i intron 4 av
LPIN2 plakater (Lipin 2), i intron 2 av
STEAP2
(seks trans epitel antigen av prostata 2), og i intron 11 av
PARVB plakater (Parvin beta).
Vi studerte en mulig SNP-SNP samhandling for simvastatin og lovastatin motstand SNP videre sett med logistisk regresjonsanalyse og ikke påvise noen statistisk signifikant genetisk interaksjon antar additiv genetisk modell etter FDR_BH justeringer. Men tatt i betraktning den lille prøvestørrelsen, bør det også bemerkes at denne studien ikke har tilstrekkelig kraft, og således bør disse resultatene tolkes med forsiktighet. Pathway analysen viste ikke at direkte interaksjoner mellom proteinprodukter av genene i simvastatin eller lovastatin lister.
Funksjonelle studier identifiserer EAF2 som en modulator av lovastatin og simvastatin
For å teste gyldigheten av de positive GWAS resultater, vi utførte funksjonelle studier. Vi fokuserte på SNPs ligger i (intronic regioner) gener som er involvert i simvastatin (3 SNPs) og lovastatin (6 SNPs) motstand (Tabell 1 og 2). Et omfattende litteratursøk avdekket ikke kjente funksjonelle konsekvenser av disse SNPs på genekspresjon eller protein funksjon. Således er de direkte biologiske sammenhenger mellom disse SNPs og motstand mot simvastatin og lovastatin forble ukjent. Men siden våre GWAS resultatene har indikert en sammenslutning av disse genene med motstand mot simvastatin eller lovastatin, hypotese vi at funksjonene til disse genene ble liksom forbundet med resistens. Under denne hypotesen, nedregulering av genekspresjonen reverserer den observerte motstand og gjør disse celler som er følsomme overfor disse stoffene igjen, noe som resulterer i økt cellulær toksisitet og død (figur 2). Derfor har vi utført narkotika respons og genet Slå hjelp RNAi metodestudier på to kolon kreft cellelinjer HCT-116 og HT-29, som ble valgt da de ble inkludert i NCI60 satt så vel som for deres gode transfeksjon effektivitet og deres respons på de to statiner. Basert på DTP narkotika respons data, vår analyse klassifisert HCT-116 som relativt motstandsdyktig mot simvastatin (tabell S1); imidlertid, lovastatin data ikke var tilgjengelig for denne cellelinje. På den annen side ble HT-29 funnet å være relativt resistente mot både simvastatin og lovastatin (tabellene S1 og S2). Til å begynne med begge cellelinjer ble behandlet med siRNA målretting gener identifisert i vår analyse etterfulgt av behandling med to lave doser av enten simvastatin eller lovastatin, som indikerte fire av genene,
MRPS31
,
COL13A
EAF2
,
AKAP7
som potensielle modulatorer av narkotika respons (data ikke vist).
Ingen biologiske forholdet mellom legemiddelresistens og genene /SNPs identifisert i GWAS studien ble tidligere identifisert. Derfor heri vi hypotese at dersom funksjonene til disse gener er nødvendige for motstandsdyktigheten overfor disse stoffene, deretter, å slå ned deres genekspresjon ved hjelp sirnas vil forstyrre funksjonen av genene, noe som vil reversere den motstanden og gjør cellene følsomme overfor disse stoffene igjen. (A) tumorcellelinje som er resistent ved eksponering for medikamentet. (B) Ved behandling med siRNA til kandidat genet mål i tillegg til narkotika, spår vi at svulsten cellelinjen vil bli sensibilisert for narkotika fører til økt celledød. Denne modellen er basert på en hypotese om at den spesifikke genet funksjonen er nødvendig for resistens.
Videre responsstudier narkotika dose ble gjort ved hjelp av siRNA tomannsboliger rettet mot
MRPS31 Hotell og
COL13A
, som ble assosiert med resistens overfor simvastatin, og
EAF2 Hotell og
AKAP7
, som ble assosiert med resistens mot lovastatin. Disse genene ble brakt til taushet av siRNA og behandlet med varierende doser av enten simvastatin eller lovastatin strekker seg fra 12 nM til 667 mikrometer. Stanse av
MRPS31
,
AKAP7 Hotell og
COL13A
påvirket ikke responsen på enten stoffet under eksperimentelle betingelser som er brukt (data ikke vist), mens tie av
EAF2
reduserte signifikant GI
50 av simvastatin og lovastatin-behandlede HCT-116-celler, og dermed redusert motstand av denne cellelinje for disse stoffene (figur 3). For HCT-116 celler behandlet med simvastatin og siRNA, GI
50 (med 95% konfidensintervall) flyttet fra 8,6 +/- 0,3 mikrometer for ikke-tie siRNA (negativ kontroll) til 2,5 +/- 0,2 mikrometer og 3.3 +/- 0,3 mikrometer for henholdsvis EAF2_1 og EAF2_4 siRNA,. Tilsvarende for HCT-116 celler behandlet med lovastatin GI
50 flyttet fra 20,1 +/- 0,9 mikrometer for ikke-tie siRNA til 4,3 +/- 0,5 mikrometer og 6,5 +/- 0,5 mikrometer for EAF2_1 og EAF2_4 siRNA, henholdsvis . Videre ble effektiv siRNA transfeksjon påvises i begge cellelinjene, siden styre letale siRNA redusert levedyktighet med mer enn 98% i alle forsøk (figur S1). Men tie av
EAF2
ikke bevisst HT-29 celler til enten simvastatin eller lovastatin (figur 1). Disse resultater antyder at nedregulering av
EAF2
uttrykk kan modulere den cellulære respons på både kolesterolsenkende medikamenter i HCT-116 colon cancerceller
HCT-116-celler (A og. C ) og HT-29 celler (B D) ble transfektert med siRNA målretting
EAF2
av revers transfeksjon. Etter 24 timer ble cellene behandlet med forskjellige doser av enten simvastatin (A og B) eller lovastatin (C 0,0002
for både EAF2_1 og EAF2_4 sirnas vist av *) ved doser 2,7 mikrometer og 8,2 mikrometer.
effekten av genet Slå av sirnas EAF2_1 og EAF2_4 ble bekreftet ved hjelp av qPCR eksperimenter og er vist i figur 4A. Selv om HCT-116 celler viste allergi til kombinasjonen av
EAF2
taushet statin behandling, mens HT-29 celler ikke, begge cellelinjene viste tilsvarende nivåer av uttrykk for
EAF2
demonstrere at forskjellen i respons var ikke på grunn av forskjell i basalnivået av
EAF2
uttrykket (figur 4B). Videre siRNA stanse av
EAF2
i begge cellelinjer hadde minimal effekt på cellen levedyktighet sammenlignet med ubehandlede kontroller og den ikke-lyddemping siRNA kontroll (figur 5). Til sammen disse dataene og skifte i doseresponskurver produsert av
EAF2
stanse i HCT-116 celler indikerer at stanse
EAF2
forsterker effekten av statin indusert cytotoksisitet.
(A) Total RNA ble isolert fra HCT-116 celler transfektert i 48 timer med siRNA målretting
EAF2 plakater (EAF2_1 og EAF2_4), ikke-tie siRNA eller ubehandlede celler. Relativ fold forskjeller i
EAF2
mRNA nivåer sammenlignet med ubehandlede og ikke-tie siRNA behandlede celler er vist. (B) qPCR relative uttrykk analyse av EAF2 i HCT-116 og HT-29 celler viser lignende uttrykk.
HCT-116 celler og HT-29 celler (1000 celler /brønn) ble omvendt transfektert med kontroll siRNA og
EAF2
målretting siRNA. Cell levedyktighet ble bestemt etter 96 timer ved bruk av Cell Titer Glo og lese for luminescens. Data representert som prosent levedyktighet i forhold til ikke-siRNA behandlede celler.
Diskusjoner
Vår studie er den første systematiske og hel-genom basert forening studie for simvastatin og lovastatin, to statiner som er lovende kandidater som cytotoksiske legemidler i kreft. I denne undersøkelsen tok vi fordel av de fritt tilgjengelige og omfattende farmakologiske og genetiske data på NCI60 cellelinjen panel for å identifisere kandidat gener som er assosiert med resistens mot simvastatin og lovastatin i det humane genomet. Våre resultater viste foreningen av forskjellige sett med gener med resistens mot disse to stoffene. Vi ytterligere funksjonelt validert en målgen,
EAF2
, ved hjelp av sirnas for å vise at dets ekspresjon kan modulere den cellulære responsen til disse to stoffer i HCT-116-cellelinjen.
A hel-genomet SNP basert forening studie identifisert tre gener assosiert med simvastatin motstand (tabell 3). En av disse genene,
NRP1
koder for et membranbundet reseptor som har roller i angiogenese, axon veiledning, celleoverlevelse, migrasjon, invasjon og immunrespons. NRP1 binder også til SEMA3, hvis virksomhet er modulert av lipid flåter [28]. Et annet gen assosiert med simvastatin motstand var
COL13A1
, som koder for a-kjeden av en nonfibrillar kollagen lokalisert i plasmamembranen. Selv om den nøyaktige biologiske rolle ikke er blitt karakterisert ennå er COL13A1 protein lokalisert i klebe strukturer av vev og er antatt å være involvert i celleadhesjon, migrasjon og bein utvikling [29]. Til slutt,
MRPS31
koder for en mitokondriell ribosomalt protein som er involvert i proteinsyntese i mitokondriene og er assosiert med type I diabetes [30].
I tilfelle av lovastatin motstand, vår analyse indikerte foreningen av seks gener (Tabell 3). En av disse genene var
EAF2
, som er en androgen-respons-genet assosiert med den transkripsjonelle elongeringsfaktor MEN /ELL og det er nødvendig for en rekke cellefunksjoner, slik som utvikling øyet og veksthemming og apoptose-induksjon [31], [32]. Nylig,
Eaf2
knockout i en musemodell var forbundet med neoplasier i lungene, lever og prostata, så vel som B-celle lymfom [33]. Interessant, våre resultater viser klart at å kneble av
EAF2
senker GI
50 verdier av HCT-116 tykktarmskreftceller til å ikke bare lovastatin, men også simvastatin. Denne effekten ble ikke sett i den andre koloncancer-cellelinje HT-29 og dette kan være på grunn av den genetiske heterogenitet mellom de to cellelinjer. Et annet gen assosiert med lovastatin motstand var
ANK2, etter som koder for en av de tre ankyrins som er involvert i lokalisering av proteiner på membranen.
ANK2
er avgjørende for normal hjertefunksjon og dens mutasjoner er en av årsakene til medfødt arytmi [34].
AKAP7
koder for et medlem av A-kinase forankring protein (AKAP) familie som forankrer cAMP-avhengig protein kinase A til spesifikke subcellulære avdelinger [35]. På den annen side,
LPIN2
er en av de tre Lipin gener. Lpin en er involvert i adipose utvikling vev [36]. Selv om den eksakte biologiske rolle i dette genet ikke er kjent, når mutert, fører dette genet Majeeds syndrom, en Autoinflammatorisk forstyrrelse [37]. I tillegg
STEAP2
, som koder for et multi-pass membranprotein som lokaliserer til Golgi-komplekset, plasmamembranen, og vesikulær rørformede strukturer i cytosol, var også assosiert med resistens mot lovastatin i vårt studium. Nylig en kupri-reduktase og ferrireductase rolle for STEAP2 protein ble rapportert [38]. Dette genet er også implisert i prostata kreft [39]. Til slutt,
PARVB
, et medlem av et samlings adhesjonsproteinet familie [40] som binder seg til intebundet kinase [41] Det ble også funnet assosiert med lovastatin motstand. Det er interessant å merke seg at de to listene over gener var svært forskjellig mellom de to statiner, som begge HMG-CoA-reduktasehemmere. Men de to stoffene er ikke identiske, og varierer i sine metabolitter [42] og deres cytotoksiske effekter [43], [44], som kan forklare disse resultater. Den cytotoksiske effekten mediert av statiner kan involvere andre enn HMG-CoA reduktase mål som bein morphogenic protein (BMP) sti som beskrevet av Kodach og kolleger [43].
Vi utførte genet Slå og narkotika respons eksperimenter for å teste gyldigheten av våre GWAS resultater. I tilfelle av tre gener,
MRPS31
,
COL13A
, og
AKAP7,
våre resultater ikke bekrefte at deres biologiske funksjoner er direkte knyttet til motstand mot simvastatin og lovastatin er under vår hypotese og de eksperimentelle betingelser som er brukt. Dette avvik mellom GWAS og funksjonelle studier kan forklares ved den mulighet at disse genene kan representere falske positive resultater av GWAS analyse, eller betingelsene og hypotesen anvendt var ikke optimal for å detektere de forventede effekter. Alternativt kan disse SNPs være plassert i en genomisk region som påvirker funksjonen av fjerne gener, som ikke kan testes ved hjelp av vår tilnærming. På den annen side, vår genom bredt foreningen indikerte foreningen av
EAF2
markør 1.840.275 (rs2332056, rs4339143) med resistens mot bare lovastatin etter korrigering med FDR. I tilfelle av simvastatin, ble denne markøren forbundet med motstanden (ujustert
p
0,01), men etter korrigering for flere tester, dette signifikans ble tapt. Likevel, vår funksjonell vurdering ved hjelp av siRNA viste at tie av
EAF2
var ikke bare i stand til å modulere respons på lovastatin, men også til simvastatin i HCT-116 colon cancer cellelinje under de eksperimentelle betingelser som anvendes (figur 3). Dette avviket mellom resultatene av genom bredt forening studie og funksjonelle vurderings eksperimenter kan forklares enten ved et falskt negativt sammenslutning av
EAF2
markør i simvastatin sett, eller ved bruk av ulike eksperimentelle forhold (for eksempel narkotika dosering) i våre siRNA eksperimenter. I tillegg er resultatene viste også at
EAF2
lyddemping ikke sensibiliserer en annen tykktarmskreft cellelinje HT-29 (som ble betraktet som relativt resistente mot både simvastatin og lovastatin), noe som tyder på tilstedeværelsen av en eventuell heterogenitet i genetisk og molekylære mekanismene som er involvert i motstanden mot statiner. Interessant er HCT-116 kjent for å bære en
K-RAS
mutasjon mens HT-29 ikke [45]. Siden statiner er inhibitorer av HMG-CoA-reduktase som kan føre til blokkering farneslyation av K-RAS og dermed K-RAS aktivering, er det mulig at bære en mutant
K-RAS
kan bidra til å gjøre HCT-116 cellene mer mottakelige for kombinasjonen av
EAF2
taushet statin behandling. Videre studier vil være nødvendig for å løse denne mulighet.
Vårt klassifisering av både HT-29 og HCT-116 være forholdsvis bestandig er basert på sammenligning med alle cellelinjer i NCI60 panelet. Tidligere studier på svar på simvastatin og lovastatin av flere av de NCI60 cellelinjene er rapportert. HL-60 leukemicellelinje ble tidligere funnet å være relativt resistente mot behandling med simvastatin (på en doseavhengig måte) enn dens all-trans retinsyre motstandsdyktig derivat cellelinje HL-60-R2 [46]. I tillegg Martirosyan
et. al.
viste at eggstokkreft cellelinje, SKOV-3, når de ble behandlet med Lovastatin viste en respons, men ikke så mye som andre cellelinjer som er inkludert i studiet, noe som tyder på at denne cellelinjen er ikke svært følsom for behandling lovastatin under de betingelser som er brukt [47], som er i overensstemmelse med våre resultater. Endelig Kodach
et.
