Abstract
Vår studie undersøkte sammenhengen mellom
MYC
endringer og clinicopathological funksjoner i mage kreft. Vi evaluerte effekten av
MYC
mRNA-ekspresjon og protein immunoreaktivitet, samt kopitall variasjon, promotor-DNA-metylering, og punktmutasjoner i 125 gastrisk adenokarsinom og 67 paried ikke-neoplastiske vev. Det ble observert at 77% av tumorene presentert MYC-immunoreaktivitet som var signifikant assosiert med øket mRNA ekspresjon (
p
0,05). Disse observasjonene var assosiert med dypere tumor forlengelse og tilstedeværelse av metastase (
p
0,05). MYC protein uttrykk ble også sett oftere i intestinal-type enn i diffuse-type tumorer (
p
0,001). I tillegg
MYC
mRNA og protein uttrykk var signifikant assosiert med kopiantall (
p
0,05). Gevinsten av
MYC
eksemplarer ble assosiert med sent oppstått, intestinal-type, avansert tumor stadium, og tilstedeværelsen av fjernmetastaser (
p
0,05). En hypomethylated
MYC
promoter ble påvist i 86,4% av tumorprøver.
MYC
hypometylering var assosiert med diffus-type, avansert stadium tumor, tumor dypere forlengelse, og nærværet av lymfeknutemetastaser (
p
0,05). Videre atten tumorprøver presentert i det minste ett kjent mutasjon. Tilstedeværelsen av
MYC
mutasjoner ble assosiert med diffuse-type tumor (
p
0,001). Våre resultater viste at
MYC
deregulering var hovedsakelig knyttet til dårlige prognostiske funksjoner og også forsterket tilstedeværelsen av ulike baner som er involvert i intestinal-type og diffuse-type magekreftutvikling. Dermed våre funn tyder på at
MYC
kan være en nyttig markør for klinisk stratifisering og prognose
Citation. De Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges BDN, Montenegro RC et al. (2013)
MYC
Deregulering i Gastric Cancer and Its Clinicopathological implikasjoner. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10,1371 /journal.pone.0064420
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 30 januar 2013; Akseptert: 12. april 2013, Publisert: 22 mai 2013
Copyright: © 2013 de Souza et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne er takknemlig for å Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; CRTdS, AKCRdS, SEBdS, RRB og MdACS) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; DQC og MFL) som støtter denne studien som tilskudd og stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde hyppigste krefttypen og er fortsatt den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Dette kreft er vanligvis diagnostisert ved avanserte stadier og singelen kurativ terapi tilgjengelig krever kirurgisk reseksjon [2]. Således er magekreft et alvorlig helseproblem i verden. En bedre forståelse av biologien til denne svulst er kritisk og kan være nyttig for å veilede pasientbehandling, samt å utvikle nye terapeutiske muligheter.
MYC
er en av de mest studerte onkogener som stammer fra dens forening med et stort antall sykdommer [3]. MYC spiller en rolle i flere grunnleggende funksjoner i cellebiologi, deriblant regulering av cellevekst og proliferasjon, metabolisme, differensiering, apoptose, og angiogenese (for oversikt se [4], [5]). Derfor er MYC en integrator av ekstracellulære og intracellulære signaler, og dens cellulære fenotype er avhengig av vev stedet [6], [7]. Ikke overraskende, bidrar deregulering av myc-funksjoner til svulsten fenotype.
MYC
deregulering som følge av genamplifikasjon [8], [9], translokasjon eller innsetting [10], [11] , mutasjoner [12], og epigenetiske endringer [13], [14], er blitt rapportert i forskjellige typer kreft, spesielt i magekreft. MYC uttrykk er ofte forhøyet eller deregulert i humane svulster [4], og ser ut til å være i krysset av flere viktige veier og prosesser som er involvert i kreftutvikling [15], som er en viktig hendelse i magekreft [9]. Tidligere viste vår gruppe som
MYC
mRNA uttrykk og kopiere tallet øker i løpet av de sekvensielle trinn av intestinal-type magekreftutvikling i et ikke-menneskelige primater modell [16], noe som tyder på at
MYC
kan være involvert i mage tumor initiering og progresjon.
forståelsen av
MYC
biologi er av avgjørende betydning for å belyse sin rolle i patogenesen av magekreft. Opp til nå, er det ingen studie samkjøre
MYC
mutasjon, forsterkning, protein /mRNA nivåer, og metylering i denne neoplasi. Her vurderte vi sammenhengen mellom
MYC
endringer og clinicopathological funksjoner i magekreft. I tillegg
MYC
mRNA-ekspresjon og protein immunoreaktivitet, samt flere molekylære mekanismer som tidligere knyttet til deregulering som dens kopitall variasjon (CNV), mutasjon, og DNA-metylering, ble analysert i det samme sett av magekreft prøver.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle prøver ble hentet med skriftlig informert samtykke og godkjennelse fra University Hospital (Belém, Pará, Brasil) etiske gjennomgang tavler ( protokollnummer. 142004)
kliniske prøver
125 adenokarsinom i ventrikkel og 67 tilsvarende ikke-neoplastiske mage vev (kontrollprøver) ble oppnådd kirurgisk fra pasienter i João de Barros Barreto universitetssykehus i Pará State, Brasil. Alle forsøkspersonene ble ikke utsatt for enten kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Gastric tumorer ble klassifisert i henhold til Lauren [17] og svulster ble iscenesatt ved hjelp av standard kriterier TNM staging [18]. De clinicopathological funksjoner er vist i tabell 1 og 2.
dissekert tumor og kontrollprøver ble raskt frosset i flytende nitrogen til nukleinsyrerensing. En annen del av samme vev var formalinfiksert og parafininnebygd. For det fluorescerende
in situ
hybridisering (FISH) assay, ble den gjenværende tumorprøve dekomponeres som tidligere beskrevet [19].
MYC immunreaktivitet
Immunhistokjemisk analyse for MYC protein var utført på 125 formalinfiksert, parafininnstøpte tumorsnitt. Immunhistokjemisk farging ble utført i henhold til Calcagno
et al.
[10]. Tumor vevssnitt (3 eller 4 mm tykk) ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert serie av etanol. Etter varmeinduserte epitop henting, ble vevssnittene inkubert med primært monoklonalt museantistoff mot MYC (fortynning 1:50; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, USA og Zymed®, USA). En universell peroksydase-konjugert sekundært antistoff kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) ble anvendt for påvisningssystemet. Vi brukte 3,30-diamino-benzidin /H
2o
2 (Dakocytomation, Danmark) som kromogen og hematoxylin som counterstain. En hvilken som helst kjernefysisk flekken med eller uten cytoplasmatisk farge ble ansett for å være et positivt resultat, uavhengig av intensitet. En MYC-positiv sak ble definert som en som har 10% eller flere kreftceller positive for dette proteinet.
Nukleinsyre utvinning
genomisk DNA (gDNA) ble ekstrahert med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland) etter produsentens anvisninger. Total RNA ble ekstrahert med tri-reagent® (Life Technologies, USA) i henhold til produsentens protokoll. DNA og RNA-konsentrasjon og kvalitet ble bestemt ved anvendelse av Nanodrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland). RNA integritet ble bestemt ved gel-elektroforese (1% agarosegeler). Alle prøver ble lagret ved -80 ° C inntil bruk.
MYC
mRNA uttrykk
For å kvantifisere mRNA nivåer av
MYC
, total RNA ble isolert fra 49 parvise normale og tumorvev bruker Trizol (Life Technologies, USA). RNA ble revers transkribert ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies, USA). Komplementær DNA ble så forsterket av real-time PCR ved bruk av TaqMan prober kjøpes som Analyser-on-demand Produkter for Gene Expression (Life Technologies, USA) på en 7500 Fast Real Time PCR (Life Technologies, USA).
GAPDH
-genet ble valgt som en intern kontroll for RNA-inngang og revers transkripsjon effektivitet. All sanntid revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) ble utført i tre eksemplarer for både target genet (
MYC
: Hs00153408_m1) og internkontroll (
GAPDH
: NM_002046.3).
Relativ kvantifisering (RQ) av genekspresjon ble beregnet i henhold til Livak og Schmittgen [20]. Den tilsvarende kontrollprøve ble utpekt som en kalibrator fra hver svulst.
MYC
kopiere antall
FISH og qPCR ble brukt til å evaluere
MYC
kopiere nummer i en undergruppe av 49 tumorer, det samme som brukes i studiet av uttrykket. FISH ble utført i henhold til protokollen fra Pinkel
et al.
[21] med modifikasjoner introdusert av Calcagno
et al.
[22]. Celler ble hybridisert med
Spectrum Orange
Probe (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) for
MYC
genet region (8q24.12-q24.13) og kjerner ble kontra med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol antifade. Fluorescens ble påvist ved hjelp av et Olympus BX41 fluorescens mikroskop (Olympus, Japan) med eksitasjon filtre for 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (260 nm) og rhodamine (570 mn). For hvert tilfelle ble 200 interfase kjerner analysert ved hjelp av en ASI bildeanalysesystem (Applied Spectral Imaging, Israel). Positiv
MYC
gene signaler dukket opp som røde flekker i kjerner og ble scoret ved hjelp av kriteriene for Hopman
et al.
[23]. For å unngå feiltolkning på grunn av tekniske feil, normale lymfocytt kjerner og normal gastrisk vev ble anvendt som en kontroll. De FISH Resultatene ble presentert som prosentandelen av
MYC
forsterkning av en celle, der vi beregnet andelen av celler som viser 3 eller flere signaler for
MYC
sonde av cellen.
qPCR ble utført ved hjelp av kvantitative TaqMan CNV analyser (Life Technologies, USA) for
MYC
genet (Hs01764918_cn) og for den interne kontrollen
RNase P product: (# 4403326). Multiplex qPCR reaksjoner ble utført i fire eksemplarer med gDNA henhold til produsentens protokoll og sykkelforholdene i 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies, USA). Den relative kopitall ble beregnet for hver prøve ved hjelp av Kopier Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Kommersielle menneskelige gDNAs (G1521 og G1471, Promega, USA) ble brukt for kalibrering
MYC
metylering
metylering mønster og frekvensen på
MYC
promoter ble evaluert i 125 tumorer og 67 passet kontrollprøver av metyl-spesifikk PCR (MSP) som tidligere beskrevet [24]. gDNA (2 mikrogram) av alle prøvene ble endret av sulfitt behandling, konvertering unmethylated cytosines til uraciler og forlate denaturert cytosins uendret [25]. Spesifikke primere for
MYC
promoteren var som følger: F5′-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 «og R5′-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3′ for unmethylated reaksjonene (forventede produkt størrelse på 291 bp); F5»-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 «og R5′-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3» for denaturert reaksjoner (forventet produktstørrelse på 290 bp), som tidligere beskrevet [26].
PCR reaksjoner ble utført med 0,1 mikromol /L av dNTP, 2 umol /l MgCl
2, 0,5 umol av primere, 1,25 U av Taq DNA-polymerase, og 100 ng av bisulfitt-modifisert DNA. Etter innledende denaturering i 5 minutter ved 94 ° C, 40 sykluser ved 9 4 ° C i 45 s, 52,4 ° C i 45 s, og 72 ° C i 30 s ble utført, etterfulgt av en endelig forlengelse i 5 minutter ved 72 ° C. PCR-produktene ble direkte lastet på 3% agarosegel og elektroforese. Gelen ble farget med SYBR® Sikker DNA Gel Stain (Livet Technolgies, USA) og direkte visualisert under UV-belysning. Som en positiv kontroll av alle MSP reaksjoner, en gDNA prøven var helt denaturert ved hjelp av CpG metylase (SSSI, New England Biolabs, USA) etter produsentens anvisninger. . Videre ble primere for villtype brukes til å overvåke fullstendig omdannelse av DNA oppnådd i det bisulfitt reaksjons
Prøver ble inndelt som: 1) hypomethylated prøver når positiv amplifikasjonsprodukt ble detektert bare i den PCR med spesifikke primere for unmethylated sekvenser; 2) hypermethylated prøver når positiv amplifisering ble detektert bare i den PCR med spesifikke primere for metylert sekvenser; 3) delvis denaturert prøver når positiv forsterkning ble oppdaget i PCR med de to primer settene.
MYC
Genotyping
De tre eksoner av
MYC
-genet ble valgt ut for mutasjonsanalyse i alle 125 magekreft prøver. De følgende primere ble utformet for PCR-amplifikasjon og sekvensering: ekson 1 F5′-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 «og R5′-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3′ (forventet produkt størrelse på 654 bp); exon 2 F5»-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 «og R5′-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3′ (forventet produkt størrelse på 423 bp), F5»-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 «og R5′-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3′ (forventet produkt størrelse på 507 bp); exon 3 F5»-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 «og 5′-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3′ (forventet produkt størrelse på 663 bp) 5»-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 «og 5′-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3» (forventet produkt størrelse på 639 bp).
PCR-reaksjonene ble utført med 0,1 umol /l av dNTP, 2 umol /l MgCl
2, 0,5 umol /l av primere, en U av Taq-polymerase, og 100 ng av DNA. PCR-betingelsene var 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 35 sykluser med 1 minutt for denaturering ved 95 ° C, 1 min av glødetemperaturen (i området 59-61 ° C), og 1 min av forlengelse ved 72 ° C. De amplikonene ble separert på en 2% agarosegel farget med SYBR® sikker DNA Gel Stain (Liv Technolgies, USA) og direkte visualisert under UV-belysning.
amplikonene ble sekvensert ved hjelp av Sanger-metoden [27]. Direkte sekvensering ble utført ved hjelp av Big Dye® Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, USA) og analysert på en ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, USA) ved hjelp av Pop 7 polymer. Den i silico mutasjonen søket ble utført ved hjelp av Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd, Australia). Referansesekvensen var Gene ID: 4609 (NCBI). ble rapportert varianter med mindre enn 1% mindre allel frekvens. Patogenitet av missense mutasjoner ble vurdert av i silico analyse ved hjelp PolyPhen (https://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) og sile (https://sift.jcvi.org).
Statistisk analyse
MYC
metylering, mutasjon, eller dets produkter «immunoreaktivitets odds ratio (OR) for clinicophatological funksjoner ble beregnet ved logistisk regresjon. Alderen på mage vev prøvetaking ble definert som kovariat i regresjonsmodellen.
normalitet distribusjons for kvantitative variabler ble testet av Shapiro-Wilk test. Data som ikke var normalfordelt ble transformert (z-poeng transformasjon) i en normalfordeling for analyse. Analyse av
MYC
mRNA uttrykk og kopiere nummer ble utført av General Linear Model (GLM) med justering for alder, som gir effekten størrelse og observert effekt (OP) for hver analyse. Effektstørrelsen for GLM-analyser ble basert på Eta kvadrerte (η
2), i hvilken 0,15 og nedenfor, ble bestemt som en liten effekt størrelse, 0,16 til 0,40 som en middels effekt størrelse, og over 0,40 som en stor effektstørrelse.
korrelasjonen mellom mRNA-ekspresjon og kopiantall ble analysert ved hjelp av Pearsons test, hvor en verdi av dens korrelasjonskoeffisient (r) under 0,30 ble bestemt som en svak korrelasjon, 0,30 til 0,70 som et medium korrelasjon, og over 0,70 som en sterk korrelasjon.
i alle analysene, konfidensintervallet var 95% og
p
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
MYC
forsterkning er kjent for å være relatert til høyt protein /mRNA uttrykk i magekreftutvikling [28], men til vår beste overbevisning, er det få studier har blitt utført for å beskrive rollen metylering og
mYC
mutasjoner i denne prosessen. For å nå dette målet, vi analyserte 125 tilfeller der 68% var menn og 32% var kvinner. Gjennomsnittsalderen for vår prøvesett var 62 år (spredning av 26-89 år). En litt høyere frekvens av intestinal-type (56,8%) og ikke-cardic (58,4%) tumorer ble observert (tabell 1 og 2).
MYC kjerneprotein ble funnet positive i 76,8% (96/125) av mage svulster (figur 1). MYC protein uttrykk ble oftere observert i intestinal-type enn diffuse-type tumorer (
p
0,001, OR = 7,856, KI 95% = 2,803 til 22,013) (tabell 1). MYC farging ble også assosiert med sen debut (p = 0,026, OR = 3,276; KI 95% = 1,152 til 9,315), dypere svulst forlengelse (
p
= 0,045, OR = 2,975, KI 95% = 1,027 -8,623), og tilstedeværelsen av fjernmetastaser (
p
0,001, OR = 17,682, KI 95% = 3,914 til 79,882) (tabell 1). Videre ber MYC immunoreaktivitets var assosiert med økt mRNA uttrykket (
p
= 0,003, η
2 = 0,178, OP = 0.870) og
MYC
kopiere nummer av fisk (
p
= 0,009, η
2 = 0,139, OP = 0,759) og ved qPCR (
p
= 0,003, η
2 = 0,177, OP = 0,869) (tabell 1).
A) intestinal-type magekreft uten MYC immunoreaktivitets (400 ×); B) intestinal-type magekreft presentere MYC immunoreaktivitets (400 ×); C) diffuse-type magekreft uten MYC immunoreaktivitets (400 ×); D) diffuse-type magekreft presentere MYC immunoreaktivitets (400 ×).
Uttrykket nivået av
MYC
mRNA var høyere i alle tumorprøver enn sine sammenkoblede kontroller (RQ = 3.39 ± 0,14; spekter av 1,57 til 5,18). En økt
MYC
mRNA uttrykk var assosiert med dypere svulst forlengelse (
p
= 0,006, η
2 = 0,152, OP = 0,801), tilstedeværelse av lymfeknutemetastase (
p
= 0,023, η
2 = 0,107, OP = 0,632), og fjernmetastaser (
p
0,001, η
2 = 0,788, OP = 1) (tabell 2 ). I tillegg mRNA nivået ble direkte korrelert til
MYC
kopiere antall (
p
0,01; r = 0,716).
Forsterkning av
MYC
kopier ble funnet i alle adenokarsinom prøver av fisk og qPCR analyser. Ved FISH, den midlere prosent av celler som presenterer
MYC
amplifisering var 72,1% (område fra 50 til 83,5% celler med forsterkning) (figur 2 A og B). Gjennomsnittet av
MYC
kopier av qPCR var 4,5 (spredning 3 til 9 kopier) (figur 2 C).
A) interfase kjerner presentere
MYC
forsterkning (rød) i intestinal-type magekreft; B) interfase kjerner presentere
MYC
forsterkning (rød) i diffuse-type magekreft; C)
MYC
kopiere nummer fordeling av qPCR i intestinal-type og diffuse-type svulster.
FISH og qPCR analyser viste at økt
MYC
kopiere nummeret var assosiert med sen debut (
p
0,001; η
2 = 0,257, OP = 0,976;
p
= 0,025; η
2 = 0,103, OP = 0,662 henholdsvis), intestinal-type kreft (
p
= 0,037; η
2 = 0,091, OP = 0,557;
p
= 0,009; η
2 = 0,139, OP = 0,762, henholdsvis), og tilstedeværelsen av fjernmetastaser (
p
= 0,001; η
2 = 0,221, OP = 0,942;
p
0,001; η
2 = 0,356, OP = 0,999, respektivt). I tillegg
MYC
forsterkning av FISH var assosiert med avanserte kreft stadier (
p
= 0,037; η
2 = 0,091, OP = 0,558), men bare to tidlige svulster var analysert i denne undergruppe av prøvene (tabell 2).
Alle magekreft prøver presenteres positiv forsterkning med en unmethylated primer sett. Interessant, ble 86,4% av kreftprøver hypomethylated. På den annen side, nærværet av unmethylated sekvenser ved
MYC
promoteren ble observert hos 28,4% av kontrollprøver (delvis metylerte prøver), noe som tyder på at tapet av metylering i disse prøvene (figur 3). Primerne spesifisitet og MSP resultatene ble bekreftet ved hjelp av bisulfit sekvensering PCR (BSP) tilnærming [29] der vi tilfeldig valgt ut fem hypomethylated prøver; fem hypermethylated prøver og fem delvis denaturert prøver (data ikke vist).
MYC
hypometylering ble oftere observert i diffuse-type i forhold til tarm-type magekreft (
p
= 0,007; OR = 8,554; 95% CI = 01,798 til 40,695, ved hjelp diffus-type som referansegruppe). I tillegg
MYC
hypometylering var assosiert med avanserte kreft stadier (
p
= 0,033; OR = 6,602; 95% CI = 1,162 til 37,501), dypere svulst forlengelse (
p
= 0,022; OR = 4,752; 95% CI = 1,257 til 17,965), og tilstedeværelsen av lymfeknutemetastase (
p
= 0,032; OR = 5,12; 95% CI = 1,149 til 22,814) (tabell 1).
Prøve 1 presenteres delvis metylering. Prøvene 2, 3 og 4 presenteres en hypomethylated promoter. C-: blank; C +: positiv kontroll, gDNA prøve fullstendig metylert; U: unmethylated; M: metylert: MW: molekylvekt markør; bp. basepar
Med hensyn til gensekvensering, ble ingen ny mutasjon påvises i mage svulster. Thirteen (10,4%) tumorprøver presenteres minst en kjent mutasjon, med varianter på mindre enn 1% mindre allel frekvens. I alt ble 18 mutasjoner identifisert, med 4 prøver stiller samtidig forekommende mutasjoner. I exon 1, fem med GG og fire med CG på rs117856857; ett med GG på rs73707292; og fire med CT rs4645949. I ekson 2, om missense mutasjoner, to svulster næret en mutasjon ved kodon 47 resulterer i en endring fra tyrosin til histidin (rs114570780; sile prediksjon = skadelig; PolyPhen prediksjon = sannsynligvis skade), og to på kodon 72 resulterer i en endring fra Proline til serin (rs28933407; sile prediksjon = tolerert; PolyPhen prediksjon = sannsynligvis skade). Alle svulst med en mutasjon i ekson 2 presenteres en eller to kjent mutasjon i ekson 1. Exon 2 mutasjoner ble bare påvist i diffuse-type svulster i avansert stadium. Ingen mutasjon ble identifisert i ekson 3. Tilstedeværelsen av kjente
MYC
mutasjoner ble assosiert med diffuse-type tumorer (
p
= 0,004, OR = 21,717, 95% CI = 2,678 til 176,111; bruker diffuse-type som referansegruppe) og tilstedeværelsen av fjernmetastaser (
p
= 0,032, OR = 4,492, 95% KI = 1,141 til 17,679).
Diskusjoner
den MYC-proteinet har en effekt på omtrent 15% av genene i det humane genom [30]. Således kan MYC deregulering resultere i forandringer i forskjellige biologiske mekanismer som er involvert i kreft initiering og progresjon [5]. Men, oppdatert, forholdet mellom
MYC
endringer og clinicopathological parametre er ikke godt forstått. Våre prøvene presentert en mann-kvinne forhold på 02:01 og flertallet av pasientene var eldre enn femtifem. Videre intestinal-type magekreft var hyppigere enn den diffuse-type og svulster var hyppigere i ikke-Cardia. Disse epidemiologiske data er i samsvar med tidligere studier [28], [31] -. [33]
translokasjon i
MYC
locus er mest vanligste i hematopoetiske kreft. Men i solide humane tumorer som magekreft,
MYC
endringer er vanligvis på grunn av genamplifisering [34]. Videre
MYC
er anerkjent for å være den mest forsterkede protein-kodende gen på tvers av alle krefttyper [35]. I denne studien ble det observert tre eller flere
MYC
genkopier i alle mage svulster studert, bekreftende med tidligere studier i grunnskolen mage svulster personer fra vår befolkning [10], [28], [36] – [39], så vel som fra Øst-Asia og Europa [40] – [42]. Også,
MYC
forsterkning ble observert i plasma [43] og i mage kreft cellelinjer som er etablert i vår gruppe [44] – [47]. I tillegg vår gruppe hadde observert at klonal høy forsterkning av
MYC
er sjeldnere i diffuse-type enn i intestinal-type primær magekreft [10], [22], [28], og dette ble forsterket av denne studien.
MYC overekspresjon er beskrevet som strekker seg fra 15,6% til 100% i primær gastriske cancere [9].
In vitro
studier med slått ned MYC uttrykk i mage kreft cellelinjer demonstrerte avgjørende rolle MYC uttrykk i gastrisk tumorcellevekst, overlevelse, og opprettholdelse av tumorcelleparametre som kan bidra til malignitetspotensiale [48 ]. Videre Mehndiratta
et al.
, [49] viste en signifikant reduksjon (40%) i MYC uttrykk for både mRNA og protein og nedstrøms mål ved hjelp av siRNA.
I denne studien, 76,8% av mage svulster viste MYC immunoreaktivitets og alle svulster, intestinal og diffuse typen, present økt mRNA uttrykk i forhold til sine sammenkoblede kontroller. Videre observerte vi at MYC immunreaktivitet og øket mRNA-ekspresjon er assosiert med dypere tumor forlengelse og tilstedeværelse av metastasering. Disse funnene antyder at MYC har en rolle i den tumor invasivitet, metastase, og således aggressivitet, som bekrefter en tidligere studie [37]. Selv om noen analyser presentert en liten effektstørrelse, disse funnene er også i overensstemmelse med en tidligere studie av vår gruppe i ikke-menneskelige primater, hvor vi viste en kontinuerlig økning av
MYC
mRNA uttrykk og kopiere nummer under sekvensielle trinn av intestinal-type gastrisk karsinogenese i N-metyl-nitrosourea (MNU) -behandlet ikke-menneskelige primater [16]. På den annen side ble en hvilken som helst forbindelse mellom MYC og histologiske grad, tumor plassering, lymfeknutemetastase, eller patologisk fasen detektert i en ventrikkelkreftstudien utviklet i et kinesisk befolkning [50], forsterkende at etnisk av den rammede befolkningen kan medføre biologisk og klinisk magekreft undergrupper [51].
Selv er genamplifisering ikke nødvendigvis forbundet eller påkrevd for sin overekspresjon, viser vår studie at MYC immunoreaktivitets,
MYC
mRNA nivåer, og kopiere nummer var direkte korrelert.
DNA metylering er en potent mekanisme transcriptional undertrykkelse. Riktig genomiske metylering mønstre blir fundamentalt endret i kreftceller: både gevinster (hypermethylation) og tap (hypometylering) denaturert nettsteder har blitt observert [52], [53]. Hypometylering på bestemte arrangører kan aktivere avvikende uttrykk for onkogener og tap av imprinting i noen loci [44]. Så langt er det få studier diskutert forholdet mellom metylering mønster av
MYC
og dens effekt på genekspresjon og på kreftfremkallende prosesser.
MYC
hypometylering ble tidligere forbundet med onkogene progresjon og metastase induksjon i en rottemodell for leverkreft [54] og i menneskelige kolorektal kreft prøver [55]. I tillegg
MYC
hypometylering var også assosiert med
MYC
uttrykk i magesvulster [26], [56] – [58] og cellelinjer [48]. Men vi var ikke i stand til å observere en signifikant sammenheng mellom
MYC
hypometylering og dens uttrykk i våre prøver. Blant andre faktorer, kan denne mangel på assosiasjon skyldes nærværet av
MYC
forsterkning i alle tumorer med hypomethylated promotorer (86,4% av prøvene) og dermed, maske den mulige effekten av denne epigenetisk modifikasjon på
MYC
transkripsjonsregulering.
Suzuki
et al.
[59] tidligere vist at et høyt nivå av hypometylering var en indikator på dårlig prognose i både mage og tykktarm kreft, og epigenetiske forandringer var aldersavhengig, forekommende før genetiske endringer. I denne studien, noen kontroller allerede presentert unmethylated sekvenser i
MYC
promoter. I tillegg viste vi at
MYC
hypometylering var assosiert med en mer aggressiv fenotype (tumor aggressivitet, tilstedeværelse av lymfeknute metastaser, og histologiske typer kreft). Disse funnene tyder på at
MYC
demetylering kan akkumuleres i løpet av tumorprogresjon og dette kan være en vanlig hendelse i mage carinogenesis [60], [61], siden denne mekanismen har blitt observert for andre gener i flere krefttyper [ ,,,0],62], [63]. Som allerede foreslått for DNA hypermethylation [64], kan arrangøren hypometylering brukes som en ny generasjon av biomarkører og holder diagnostisk og prognostisk løftet for klinikere.
Så langt vi kjenner til,
MYC
genet eksoner har aldri blitt fullstendig sekvensert i menneskelige mage svulster. Her sekvensert vi de tre eksoner av
MYC
: exon 1 er en ikke-kodende protein, eksoner 2 og 3 er proteinkodende [for gjennomgang se (Pelengaris Khan, 2003)]. Vi fant ikke noen ny mutasjon, men vi observerte at 4 svulster presenteres missense mutasjoner (rs114570780 og rs28933407) på ekson 2. Disse mutasjonene var i en evolusjonær konservert sekvens av
MYC
: den transdomene [4] , [65]. I tillegg ble begge identifisert mutasjoner betraktes som sannsynligvis skade i henhold til PolyPhen programvare. Endringen av prolin til serin ved kodon 72 ble også tidligere rapportert som en sykdomsfremkallende variant i NCBI dbSNP database (https://omim.org/). Således kan begge mutasjoner i exon 2 påvirke MYC aktivitet i mage-tumorer. I tillegg er nærvær av
MYC
mutasjoner var forbundet med fjern metastase. Men ytterligere undersøkelser er nødvendig for å avklare om
MYC
mutasjoner har en rolle i metastatisk prosess.
Ifølge Laurén klassifisering, er adenokarsinom i ventrikkel klassifisert hovedsakelig i tarm og diffuse typer [17]. Intestinal-type magekreft utvikler seg gjennom en rekke av sekvensielle trinn, som begynner med atrofisk gastritt, etterfulgt av intestinal metaplasi, intraepitelial neoplasi, og karsinom [66]. På den annen side, den diffuse-type vanligvis ikke utvikle seg fra forstadier til kreft [67], [68]. I den foreliggende undersøkelse, observerte vi at intestinal-type presentert hyppigere MYC immunoreaktivitet, samt et høyere antall
myc
kopier enn diffus-type tumor, noe som bekrefter med tidligere studier av vår gruppe [10] , [22], [28], [38]. I tillegg
MYC
hypometylering og punktmutasjoner ble oftere observert i diffuse-type i forhold til intestinal-type svulster.
