Abstract
gemcitabin (Gem) har begrenset klinisk nytteverdi i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC). Denne studien undersøkte kombinasjoner av gemcitabin med antiangiogene agenter for ulike mekanismer for PDAC, inkludert bevacizumab (Bev), sunitinib (Su) og EMAP II. Celleproliferasjon og protein ekspresjon ble analysert ved hjelp av WST-1-analysen og Western blotting. In vivo eksperimenter ble utført via murine xenografter. Inhibering av in vitro proliferasjon av ASPC-1 PDAC celler ved gemcitabin (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) og EMAP (10 uM) var 35, 22, 81 og 6 prosent; Kombinasjonen av gemcitabin med bevacizumab, sunitinib eller EMAP hadde ingen additive effekter. I endothelial HUVECs, gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP forårsaket 70, 41, 86 og 67 prosent hemming, mens kombinasjonen av gemcitabin med bevacizumab, sunitinib eller EMAP hadde additive effekter. I WI-38 fibroblaster, gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP forårsaket 79, 58, 80 og 29 prosent hemming, med additive effekter i kombinasjon også. Netto in vivo tumorvekstinhibitering i gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP monoterapi var 43, 38, 94 og 46 prosent; to kombinasjoner av Gem + Bev, Gem + Su og Gem + EMAP førte til 69, 99 og 64 prosent hemming. Kombinasjoner av mer enn én antiangiogene middel med gemcitabin var generelt mer effektive, men ikke bedre enn Gem + Su. Intratumoral spredning, apoptose og microvessel tetthet funn korrelert med tumorvekstinhibitering data. Median dyr overlevelse ble økt med gemcitabin (26 dager), men ikke av bevacizumab, sunitinib eller EMAP monoterapi sammenlignet med kontroller (19 dager). Gemcitabin kombinasjoner med bevacizumab, sunitinib eller EMAP bedret overlevelse i lignende grad (36 eller 37 dager). Kombinasjoner av gemcitabin med Bev + EMAP (43 dager) eller med Bev + Su + EMAP (46 dager) førte til det maksimale overlevelsesgevinst observert. Kombinasjon av antiangiogene midler forbedrer gemcitabin respons, med sunitinib induserende sterkest effekt. Disse funnene demonstrerer fordelene ved å kombinere multi-målsagenter med standard gemcitabin terapi for PDAC
Citation. Awasthi N, Zhang C, Ruan W, Schwarz MA, Schwarz RE (2012) Evaluering av Poly Mekanistiske antiangiogenic Kombinasjoner som forbedre kjemoterapi Response i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (6): e38477. doi: 10,1371 /journal.pone.0038477
Redaktør: Chryso Kanthou, University of Sheffield, Storbritannia
mottatt: 28 november 2011; Godkjent: 09.05.2012; Publisert: 18 juni 2012
Copyright: © 2012 Awasthi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en av de. de fleste aggressive kreft hos mennesker og er fortsatt den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA. Rapid tumorprogresjon, sen diagnose, tidlig og aggressiv metastase og høy motstand mot konvensjonell kjemoterapi fører til svært dårlig prognose med en 5-års overlevelse mindre enn 5% [1]. Behandling av PDAC avhenger av stadium av kreft; den generelle resectability hastigheten er bare 10 til 15%, og postoperativ tilbakefall er vanlig [2], [3], [4]. Mye oppmerksomhet har vært rettet mot systemiske behandlingsalternativer for PDAC for mulig definitive eller perioperativ behandling fordel. Gemcitabin (Gem), en deoksycytidin nukleosid-analog, er et cytotoksisk middel som forårsaker inhibering av DNA-syntese og celle-død. The Food and Drug Administration (FDA) godkjente gemcitabin for behandling av avansert PDAC i 1997. Det er imidlertid gemcitabin klinisk effektiv bare i 20-30% av PDAC pasienter, som fører til en median progresjonsfri overlevelse på 5,7 måneder sammenlignet med 4,4 måneder i 5-fluorouracil behandlede gruppen [5]. Gemcitabin basert kombinasjonen kjemoterapiregimer har ikke klart å vise noen meningsfull overlevelse fordel over monoterapi gemcitabin [6], [7]. Disse fakta viser klart det presserende behovet for nye og mer effektive terapeutiske strategier for PDAC.
Angiogenese, en prosess der svulster skaffe blodtilførsel for sin fortsatte vekst, er avgjørende for utviklingen av primære og metastatiske faste tumorer inkludert PDAC. Angiogenese er initiert av hypoksi, vekstfaktorer, cytokiner, og aktivering av proto-onkogen og de-aktivering av tumor suppressor gene mekanismer [8]. Targeting angiogenese å redusere tumorprogresjon og metastasering kan gi ny tilnærming for kombinasjonsbehandling. Antiangiogene midler som anti-vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) middel bevacizumab (Bev), matrix metalloproteinase inhibitorer (marimastat) og cyklooksygenase hemmere (Celecoxib) har blitt studert i kombinasjonsbehandling i PDAC modeller med begrenset overlevelsesgevinst [9], [10 ], [11]. Erlotinib, epidermal vekstfaktor reseptor hemmer, har hittil vært den eneste agenten som medierer en beskjeden total overlevelse fordel i kombinasjon med gemcitabin [12].
Mange rapporter i litteraturen tyder på at VEGF signale spiller en viktig rolle i progresjon PDAC [13], [14], [15], [16]. Derfor bevacizumab, et rekombinant humanisert monoklonalt antistoff mot VEGF, ble evaluert i kliniske fase II og fase III studier. Selv om bevacizumab og gemcitabin kombinasjonen viste noen lover i en fase II studie, ble ingen signifikant forbedring observert i senere fase III studier [17]. Sunitinib (Su) er et multi-target-reseptor-tyrosinkinase (RTK) inhibitor med antiangiogene og antitumor-aktivitet [18], [19], [20]. Sunitinib hemmer RTK’er uttrykkes av tumorceller som er involvert i tumorcelle-proliferasjon og overlevelse blant stamcellefaktor-reseptor (c-KIT), Fms-relaterte tyrosinkinase 3 (FLT3), glial cellelinje avledet neurotrofisk faktor-reseptor (RET) og koloni-stimulerende faktor type 1 reseptor (CSF-1R) [18], [19]. Sunitinib hemmer også RTK’er uttrykkes på endotel og mural celler, slik som VEGF-reseptorer (type 1 og 2) og blodplateavledet vekstfaktor (PDGF) reseptorer α og β [20], [21]. I human PDAC, VEGF-reseptorer og PDGF-reseptorer er over-uttrykt, og har blitt korrelert med dårlig prognose [22], [23], [24]. Sunitinib har vist seg å ha antitumor-effekt i eksperimentelt PDAC [25], [26], [27]. Endothelial monocytt aktiverende polypeptid II (EMAP) er et proinflammatorisk cytokin med antiangiogenic og antiendothelial aktiviteter. EMAP har potente effekter på endotelceller (ECS) for eksempel inhibering av proliferasjon, migrering og vaskularisering, så vel som induksjon av apoptose [28], [29]. EMAP undertrykker primær og metastatisk tumorvekst [28], [30], [31] som kan være relatert til dens evne til å binde VEGF-reseptorer og α5β1 integrinet, som fører til en forstyrrelse i fibronectin- og VEGF-signalisering [32], [33] . EMAP har nylig vist seg å forbedre gemcitabin og docetaxel respons i eksperimentell PDAC [34], [35], [36]. Denne studien vurdert og sammenlignet kombinasjonsbehandling fordelene med gemcitabin med tre antiangiogene midler bevacizumab, sunitinib og EMAP for potensielt forbedret PDAC kliniske applikasjoner.
ASPC-en, HUVECs og WI-38 cellekulturer ble behandlet med Gem (10 uM), Bev (1 mg /ml), Su (10 uM) og EMAP (10 uM), enten alene eller i kombinasjon i 16 timer. Totale cellelysat fra behandlingsgruppene ble underkastet SDS-PAGE og immunoblotting. Uttrykk av α-tubulin ble analysert som intern lasting kontroll. Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Materialer og metoder
Material
gemcitabin ble kjøpt fra Eli Lilly (Indianapolis, IN). Bevacizumab ble kjøpt fra Genentech (South San Francisco, California). Sunitinib ble kjøpt fra LC Laboratories, Inc. (Woburn, MA). Rekombinant humant EMAP ble fremstilt som tidligere beskrevet [37], mens celleproliferasjon reagent WST-en ble kjøpt fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).
Cell Culture
Den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinje ASPC-1, human fibroblastcellelinje WI-38 og human umbilikalvene endotelceller (HUVECs) ble alle innkjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). ASPC-1 og WI-38-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium og DMEM, henholdsvis (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS). HUVECs ble dyrket i EndoGRO-LS medium som inneholder endothelial celle vekst kosttilskudd (Millipore Corp., Billerica, MA).
celleviabilitet analysen
In vitro celle levedyktighet ble evaluert av WST-1-analysen . Fire tusen celler ble sådd i en 96-brønns plate og etter 16 timer ble mediet erstattet med lav serumholdig medium. Cellene ble behandlet med gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP. Det konsentrasjonsområde som brukes for gemcitabin, sunitinib og EMAP (10 nM til 10 uM); og for bevacizumab (1 pg /ml til 1 mg /ml) var sammenlignbare med klinisk oppnåelige konsentrasjoner. Etter en 72-timers inkubering ble 10 ul WST-1-reagens tilsatt i hver brønn, og absorbansen ved 450 nm ble målt etter 2 timer ved anvendelse av en mikroplateleser.
Nakne mus ble subkutant injisert med ASPC-1 celle (0,75 x 10
6) og behandlet med Gem, Bev, Su og EMAP, enten alene eller i kombinasjon, for 2 uker. Tumorvekst ble målt 2 ganger i uken ved hjelp calipers, og netto tumorvekst ble beregnet ved å trekke tumorvolumet på den første dag i behandlingen fra at på den siste dagen. Dataene er representative for gjennomsnittsverdier 6-8 mus per gruppe.
Nude mus ble subkutant injisert med ASPC-1 celler (0,75 x 10
6) og behandlet med Gem, Bev, Su og EMAP, enten alene eller i kombinasjon, for 2 uker. (A) svulstvev seksjoner ble immunostained med Ki67 atom antigen og fotografert under et fluorescerende mikroskop. (B) Ki67-positive celler ble tellet i fem forskjellige høy effekt felt. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Symboler • og * representerer signifikante forskjeller (P 0,05) sammenlignet med kontroller og Gem gruppe, henholdsvis
Nude mus ble subkutant injisert med ASPC-1 celler (0,75 x 10
6) og. behandlet med Gem, Bev, Su og EMAP, enten alene eller i kombinasjon, for 2 uker. (A) svulstvev seksjonene ble farget med TUNEL prosedyre og fotografert under et fluorescerende mikroskop. (B) tunel-positive apoptotiske celler ble talt opp i fem forskjellige høy effekt felt. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Symboler • og * representerer signifikante forskjeller (P 0,05) sammenlignet med kontroller og Gem gruppe, henholdsvis
Nude mus ble subkutant injisert med ASPC-1 celler (0,75 x 10
6) og. behandlet med Gem, Bev, Su og EMAP, enten alene eller i kombinasjon, for 2 uker. (A) svulstvev seksjonene ble farget med PECAM-1 antistoff og fotografert under et fluorescerende mikroskop. (B) PECAM-en positiv microvessel ble talt opp i fem forskjellige høy effekt felt. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Symboler • og * representerer signifikante forskjeller (P 0,05). Sammenlignet med kontroller og Gem gruppe, henholdsvis
ASPC-1 celler (0,75 x 10
6) ble injisert intraperitonealt i SCID mus, og etter 2 uker etterfulgt av behandling med Gem, Bev, Su og EMAP, enten alene eller i kombinasjon, for en to-ukers varighet. Kurven representerer dyret overlevelsestiden fra begynnelsen av behandlingen.
Western Blot analyse
En sub-sammenflytende cellemonolag ble behandlet med gemcitabin (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 mm) eller EMAP (10 mm) og inkubert 12 timer for HUVECs og 24 timer for ASPC-en og WI-38 celler. Totale cellelysat ble fremstilt, proteinkonsentrasjonen målt og like mengder av protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranene ble blokkert i en time i blokkeringsløsning (5% melk i TBS-T [Tris-bufret saltvann som inneholdt Tween-20]) og inkubert over natten ved 4 ° C med følgende antistoffer: spaltet poly (ADP-ribose) polymerase- 1 (PARP-1), kløyvde caspase-3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) eller α-tubulin (Sigma). Membranene ble deretter inkubert med tilsvarende HRP-konjugerte sekundære antistoffer (Pierce Bioteknologi, Santa Cruz, CA) i 1 time ved romtemperatur. Spesifikke bånd ble påvist ved hjelp av den forbedrede chemiluminescence reagens (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) på autoradiografisk film og kvantifisert ved densitometri.
Tumor Implantasjon og in vivo tumorvekst Experiment
All dyre prosedyrer og omsorg ble utført i henhold til de retningslinjer og godkjente protokoller ved University of Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional Animal Care og bruk Committee (Animal Protocol Antall 2008-0348). Atymiske kvinnelig naken mus (i alderen 4-8 uker) ble brukt i subkutan xenograft modell. Menneskebukspyttkjertelkreft ASPC-1 celler (0,75 x 10
6) ble injisert subkutant i hver mus. Etter 14 dager når alle musene hadde målbar tumor, ble musene tilfeldig gruppert (n = 6 til 8 pr gruppe) og behandlet intraperitonealt med PBS (kontroll), gemcitabin (100 mg /kg, to ganger ukentlig), bevacizumab (10 ug per mus, to ganger ukentlig), sunitinib (40 mg /kg for en
st uke, 20 mg /kg for 2
nd uke, 5 ganger ukentlig) og EMAP (80 mikrogram /kg, 5 ganger i uken) i 2 uker. Svulsten størrelse i alle musene ble målt to ganger ukentlig ved caliper. Tumorvolum (V) ble beregnet ved hjelp av formelen [V = ½ (L x (W)
2], hvor L = lengde og W = bredden. Netto vekst i tumorstørrelse ble beregnet for hvert dyr ved å subtrahere tumorvolum på den første behandlingsdagen fra at på den siste dag. etter fullførelse av behandlingen ble alle dyrene avlivet, tumorene ble fjernet, veiet, dissekert og bearbeidet for histologisk og immunhistokjemisk analyse.
Histologi og immunhistokjemisk analyse
Tumor vevsprøver fiksert i 4% paraformaldehyd og innstøpt i parafin ble anvendt for histologisk og immunhistokjemi analyse. intratumoral proliferativ aktivitet ble målt under anvendelse av Ki67 nukleær antigen farging i henhold til produsentens protokoll (Abcam, Cambridge, MA). i korthet parafin -embedded tumor vevssnitt ble kuttet, deparaffinized, rehydrert og antigen hentes. vevssnittene ble inkubert med CAS blokkeringsbuffer, etterfulgt av 1 times inkubering med Ki67-antistoff (1:200 fortynning). De vevssnitt ble så inkubert med Cy3 (1 :200 fortynning) sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) i 40 minutter. Objektglassene ble montert ved hjelp av monteringsløsning inneholdende 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proliferativ aktivitet ble evaluert ved å beregne Ki67-positive celler fra fem forskjellige kraftige felt (HPF) i en blindet måte. For påvisning av microvessel tetthet (MVD), ble vevssnitt inkubert med 1:100 fortynning av antistoff PECAM-1 (CD-31) (BD Pharmingen, Bedford, MA) over natten ved 4 ° C. Vevssnittene ble så inkubert med 1:200 fortynning av Cy3 sekundært antistoff i 40 minutter. Lysbilder ble montert ved hjelp av monteringsløsning som inneholder DAPI, og MVD ble evaluert ved å telle PECAM-1 positive fartøy innenfor en mikroskopisk HPF i en blindet måte. Intratumoral apoptose ble analysert ved farging vevssnitt med «Apoptag apoptose Detection Kit» i henhold til produsentens (Millipore) instruksjoner. Fluorescens mikroskopi ble brukt til å oppdage fluorescerende signaler ved hjelp IX81 Olympus mikroskop og bildene ble tatt med et Hamamatsu Orca digitalkamera (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) med en DSU spinnende konfokal enheten med Slidebook programvare (Intelligent Imaging Innovations, Philadelphia, PA).
Animal Survival Analysis
Animal overlevelsesstudier ble gjennomført med 6- til 8-ukers gamle kvinnelige SCID-mus [38]. ASPC-en (0,75 x 10
6) celler ble injisert intraperitonealt i hver mus, og etter to uker ble musene tilfeldig gruppert (n = 6 til 8 pr gruppe) og behandlet intraperitonealt med PBS (kontroll), gemcitabin (100 mg /kg, to ganger ukentlig), bevacizumab (10 mikrogram per mus, to ganger ukentlig), sunitinib (40 mg /kg for en
st uke, 20 mg /kg for 2
nd uke, 5 ganger ukentlig) eller EMAP ( 80 ug /kg, 5 ganger ukentlig) i 2 uker. Dyrene ble avlivet når du skrur døende etter forhåndsdefinerte kriterier inkludert raske vekttap eller gevinst ( 15%), tumor størrelse, slapphet, manglende evne til å holde seg oppreist og mangel på styrke. Overlevelse ble målt fra den første dagen av behandlingen inntil døden.
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble analysert av den tosidige t-test ved hjelp GraphPad Prism 4 programvare (GraphPad Software, San Diego , CA). In vitro celle-spredningsdata er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Additivity av medikamentkombinasjoner ble bestemt ved å beregne en «samspill index» med Chou TC, Talalay P [39] og Lee JJ [40] metoder. Statistisk analyse for in vivo-studier ble utført ved ANOVA for multiple gruppe sammenligning og t-test for den enkelte gruppe sammenligning. Overlevelsesstudie statistikken ble evaluert med Statview for Macintosh (SAS, Carey, NC) ved metriske overlevelse statistikk og logrank testing. Verdier av p 0,05 ble ansett å representere statistisk signifikante gruppeforskjeller
Resultater
Effekt av gemcitabin, Bevacizumab, Sunitinib og EMAP på Cell Proliferation
In vitro celleproliferasjon analyse. i ASPC-1-celler ved hjelp av gemcitabin (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) og EMAP (10 uM) viste 35, 22, 81 og 6 prosent inhibering i celleproliferasjon, respektivt. Kombinasjoner av gemcitabin med enkle antiangiogene midler bevacizumab eller EMAP hadde ingen additive effekter, mens kombinasjonen av gemcitabin med sunitinib ikke kunne overgå effekten av monoterapi sunitinib. Kombinasjoner av mer enn ett antiangiogene middel med gemcitabin hadde ingen additiv effekt in vitro (tabell 1). Selv om gemcitabin hadde ulike effekter på de andre PDAC cellelinjer BxPC-3, MIA PACA-2 og Panc-1, effekten av kombinasjoner av antiangiogene midler hadde lignende resultater som de som ble observert med ASPC-en (data ikke vist).
i HUVECs, gemcitabin (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) og EMAP (10 uM) behandling forårsaket en 70, 41, 86 og 67 prosent inhibering i celleproliferasjon, respektivt. Kombinasjoner av gemcitabin med monoterapi bevacizumab, sunitinib eller EMAP resultert i betydelige additive effekter på hemming spredning. Imidlertid kombinasjon av mer enn en antiangiogene middel ikke har additiv effekt. I WI-38-celler, gemcitabin (10 pM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) og EMAP (10 pM) førte 79, 58, 80 og 29 prosent inhibering i celleproliferasjon, respektivt. Kombinasjon av gemcitabin med bevacizumab, sunitinib eller EMAP hadde betydelig additiv effekt og kombinasjon av mer enn én antiangiogene midler til gemcitabin hadde ingen ytterligere additive effekter (tabell 1). For gemcitabin kombinasjoner med forskjellige antiangiogene midler, median samspillet indeksen var 1,03 (variasjon 0,9 til 1,34) for ASPC-1 celler, 1,3 (spredning 1,06 til 2,59) for HUVECs og 1,35 (område 1,06 til 2,47) for WI-38 celler. Interaksjons indeksene ble oppnådd ved IC
25, IC
50, IC
75 og IC
90 nivåer og var ikke signifikant forskjellig fra 1 indikerer at i alle medikamentkombinasjoner den kombinerte effekten var additiv.
Effekter av gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP på apoptose Relaterte Proteiner
Vi undersøkte om hemming i celle levedyktighet av gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP kan delvis være korrelert med induksjon av apoptose. Evaluering av PARP-1 cleavage og caspase-3 cleavage som markører for induksjon i apoptose avslørte at i ASPC-1 celler gemcitabin behandling forårsaket en liten økning, bevacizumab og EMAP forårsaket ingen økning, men sunitinib behandling førte til en betydelig økning. Kombinasjon av gemcitabin med sunitinib hadde additive effekter (figur 1). I HUVECs, gemcitabin, bevacizumab og EMAP forårsaket en liten økning og sunitinib forårsaket en sterk økning i PARP-1 og caspase-3 cleavage. Kombinasjoner av gemcitabin med antiangiogene midler hadde additive effekter. I WI-38 celler, gemcitabin og sunitinib begge forårsaket en tydelig økning; mens bevacizumab og EMAP viste ingen signifikant effekt på PARP-1 og caspase-3 cleavage. Kombinasjoner av gemcitabin med bevacizumab, sunitinib og EMAP alle hadde additive effekter på spaltet PARP-1 og caspase-3 protein uttrykk (Figur 1).
Effekter av gemcitabin, Bevacizumab, Sunitinib og EMAP om Local tumorvekst
underhudssykdommer murine PDAC xenoimplantater studier viste at gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP behandling hemmet lokal tumorvekst, med sunitinib monoterapi har sterkest effekt. Netto tumorvekstinhibitering etter en to ukers behandling med gemcitabin, bevacizumab og sunitinib og EMAP var 43, 38, 94 og 46 prosent, henholdsvis (figur 2). Tilsetning av monoterapi bevacizumab, sunitinib og EMAP til gemcitabin hadde additive effekter på tumorvekstinhibitering, som Gem + Bev, Gem + Su og Gem + EMAP førte til 69, 99 og 64 prosent tumorvekstinhibitering. Kombinasjoner av mer enn ett antiangiogene middel med gemcitabin var også effektiv, men ikke signifikant bedre i dette forsøket enn sunitinib alene (Figur 2, Figur S1). Ingen åpenbare tegn på legemiddelrelatert toksisitet ble observert i noen av behandlingsgruppene i form av dyr habitus, aktivitetsnivå og vekt (figur S2).
Effekter av gemcitabin, Bevacizumab, Sunitinib og EMAP på intratumoral proliferativ og apoptose aktivitet
Analyse av Ki67-positive celler som markør av intratumoral proliferativ aktivitet avdekket at gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP monoterapi forårsaket 34, 28, 82 og 22 prosent hemning i proliferativ indeksen. Kombinasjoner av gemcitabin med ett eller flere anti-angiogene midler var effektive, men ikke forsterke inhiberingen av intratumoral proliferative indeksen utover nivået som er oppnådd ved sunitinib alene (figur 3).
Evaluering av intratumoral apoptose ved TUNEL-farging viste en liten økning i apoptose av gemcitabin, bevacizumab og EMAP, og en betydelig økning av sunitinib alene. Kombinasjoner av bevacizumab og sunitinib eller EMAP med gemcitabin ført til økte nivåer av apoptose sammenlignet med enkle midler. Apoptotiske indekser (TUNEL-positive celler /totalt celle per HPF) i kontroller, og i Gem, Bev, Su, EMAP, Gem + Bev, Gem + Su, Gem + eMap gruppene var 0,13 ± 0,03, 0,21 ± 0,06, 0,19 ± 0,03 , 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,01, 0,26 ± 0,03, 0,53 ± 0,01 og 0,25 ± 0,02, respektivt. Kombinasjoner av mer enn én antiangiogene middel med gemcitabin også økt apoptose, men var ikke signifikant mer effektiv enn sunitinib alene (figur 4).
Effekter av gemcitabin, Bevacizumab, Sunitinib og EMAP på intratumorale microvessel Tetthet
PECAM-en farging av tumor vevssnitt for å studere tumorvaskulatur avslørte at gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP alle forårsaket en signifikant reduksjon i microvessel tetthet sammenlignet med kontroll (figur 5). Sunitinib alene indusert maksimal effekt på å redusere MVD blant alle midler testet. Kombinasjoner av gemcitabin med bevacizumab og EMAP viste additive effekter på minkmicrovessel teller sammenlignet med enkle midler. Alle kombinasjoner med sunitinib var svært effektive, men ikke overgå sunitinib alene effekter. Alle gruppene ble evaluert for gjennomsnittsmicrovessel tellinger, inkludert, kontroller (25,5 ± 3,5), gemcitabin (14,2 ± 2,1), bevacizumab (11,8 ± 2,6), sunitinib (5,0 ± 2,3), EMAP (11,1 ± 2,5), Gem + Bev (7,8 ± 2), Gem + Su (5,6 ± 1,1), Gem + EMAP (7,9 ± 1,7), Bev + Su (2.9 ± 1), Bev + EMAP (8,2 ± 1,5), Su + EMAP (5,2 ± 1,5), Gem + Bev + Su (3.9 ± 1), Gem + Bev + EMAP (5,5 ± 1,5), Gem + Su + EMAP (3,3 ± 0,6), og Gem + Bev + Su + EMAP (2.9 ± 1), henholdsvis (figur 5 ).
Effekter av gemcitabin, Bevacizumab, Sunitinib og EMAP på Animal Survival
PDAC murine xenograft studier i SCID-NOD-mus resulterte i en median overlevelse på 19 dager i kontrollgruppen. Median overlevelse (M.S.) økte beskjedent etter gemcitabin (26 dager, p = 0,02), men det var ingen signifikant overlevelsesgevinst med monoterapi bevacizumab, sunitinib eller EMAP sammenlignet med kontroll. Kombinasjonsbehandling med gemcitabin med monoterapi bevacizumab, sunitinib og EMAP alle betydelig forbedret dyr overlevelsen til en lignende grad, med median overlevelse i Gem + Bev gruppe på 36 dager (p = 0.003 vs kontroll, 0,006 vs. Gem), etter Gem + Su 37 dager (p = 0,003 vs. kontroll, 0,01 vs. Gem) og etter Gem + EMAP 36 dager (p = 0,002 vs. kontroll, 0,001 vs. Gem). Kombinasjonen av gemcitabin med Su + EMAP (M.S. = 36 dager) var ikke bedre enn kombinasjonen av gemcitabin med monoterapi sunitinib eller EMAP. Kombinasjon av gemcitabin med Bev + EMAP (ms = 43 dager, p = 0,001 vs. kontroll, 0,005 vs. Gem) eller med Bev + Su + EMAP (46 dager, p = 0,001 vs. kontroll, 0,003 vs. Gem) demonstrerte maksimal overlevelsesgevinst (figur 6).
Diskusjoner
Bukspyttkjertelkreft kreft~~POS=HEADCOMP har en svært dårlig prognose på grunn av sent stadium diagnose, tidlig metastatisk spredning og høy motstand mot stråling og kjemoterapi. Selv monoterapi gemcitabin terapi har produsert noen kliniske fordeler for metastatisk PDAC forblir total overlevelse fordel begrenset [1]. Siden angiogenese er kritisk for primær og metastatisk PDAC progresjon, er antiangiogen behandling en fornuftig og fortsatt lovende terapeutisk avenue på grunn av sitt potensial for synergistisk interaksjon med andre antitumormidler, lav toksisitet og forbedret antitumor effekt [41], [42]. Flere vekstfaktorer som VEGF, fibroblast vekstfaktor (FGF), PDGF eller insulinlignende vekstfaktor (IGF) er blant de viktigste angiogene aktivatorer i PDAC progresjon. Bevacizumab, den første FDA-godkjente angiogenese-inhibitor viste noen løftet i innledende PDAC studier i kombinasjon med gemcitabin, men har ikke vist noen vesentlig overlevelsesfordel i senere studier [17]. Sunitinib, en multitargeted hemmer av angiogene RTK VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT-3 og RET, er et interessant middel om sin kombinasjonsbehandling potensial, i forhold til å begrense pekt hemmere som hittil har vist ganske begrenset klinisk aktivitet. Våre resultater viser at 1 .: kombinasjonen av antiangiogene midler med gemcitabin, generelt gir bedre resultater enn monoterapi; 2 .: virkningene av sunitinib alene kan heller uttalt, i det minste i modellene som ble testet; 3 .: flere kombinasjoner av antiangiogene midler i tillegg til gemcitabin en tendens til å gi de beste resultatene; og 4 .: sunitinib og bevacizumab synes å ha noen åpenbar kombinasjon fordel.
Tumor progresjon kritisk avhengig av et komplekst samspill mellom flere komponenter, inkludert kreftceller, immunceller, egenkapitalbevis, ekstracellulære matrix (ECM) og stromale fibroblaster. Solid svulst behandling ved å målrette den EF og fibroblast oppbevaringsrom innenfor svulsten mikromiljøet har vist noen betydelige fordeler [43], [44]. EMAP, et tumor-avledet antiangiogen og antiendothelial cytokin, i vår erfaring viste antitumoreffekter i flere tumortyper inkludert PDAC [28], [30], [31], [34], [35], [45], [46] . Omfanget av denne studien var å evaluere forbedring av gemcitabin respons ved kombinasjon av mer enn én antiangiogene midler med hele spekteret av ulike mekanismer mot PDAC. For eksempel, vi nylig demonstrert at EMAP forbedrer gemcitabin pluss bevacizumab kombinasjonseffekter mot PDAC [34]. Legge til en multi-TKR målretting middel som sunitinib dukket derfor fornuftig. Gemcitabin hadde differensialveksthemmende respons på PDAC celler in vitro. Gemcitabin følsomhet ble sett i størrelsesorden BxPC-3 MIA PACA-2 Panc-1 ASPC-1, som indikerer BxPC-3 som mest sensitive og ASPC-en som minst sensitive celler (Figur S3). Kanskje dette er en ganske nyttig tilnærming som tillater testing av flere mekanismer for en in vivo kombinasjon fordel i motsetning til PDAC linjer som er gemcitabin-sensitive. Blant antiangiogene midler, bevacizumab og EMAP alene hadde ingen meningsfull effekt på ASPC-en spredning, mens sunitinib var svært effektive. Sunitinib Effekten var sterkere enn ekvimolar gemcitabin, mens tilsetning av to eller flere anti-angiogene midler var ikke mer inhiberende enn sunitinib alene. Som forventet, alle tre antiangiogene midler inhiberte signifikant EC og fibroblast proliferasjon in vitro, med sunitinib alene igjen å være den mest effektive. I våre studier, siden sunitinib hadde maksimal in vitro aktivitet mot kreftceller, egenkapitalbevis og fibroblaster, støtter det antagelsen om at in vivo antitumor aktiviteter sunitinib kan delvis være avhengig av dens innvirkning på kreftceller samt tumor blodkar og stromal komponenter, som tidligere rapportert [20]. Mendel et al. [20] viste at sunitinib IC
50 for VEGF- og PGDF-indusert HUVECs var i en nanomolar rekkevidde. En relativt svak aktivitet av sunitinib ble observert i denne studien; Vi antar at dette er på grunn av bruk av fullvekstmedium for HUVECs, noe som kan gjøre cellene mer motstandsdyktig mot tyrosin-kinase-hemmende effekter. Disse resultatene understøtter ideen om at fordelene kan være avledet fra kombinasjoner av multi-målsøkende midler i løpet av midler med begrensede mål alene, eller i tillegg til dem. Gemcitabin og sunitinib har blitt vist å indusere apoptose i tumorceller, så vel som endotelceller [49], [50], [51], [52], mens bevacizumab og EMAP har hovedsakelig proapoptotiske aktivitet overfor endotelceller [28], [53 ]. I den foreliggende undersøkelse, evaluering av induksjon i apoptose av gemcitabin og antiangiogene midler, enten alene eller i kombinasjon, ble korrelert til celle spredning resultater indikerer at tap i cellelevedyktigheten ved disse midler kan delvis skyldes induksjon i apoptose.
I vivo muse xenograft studier vist at gemcitabin, bevacizumab, sunitinib og EMAP hemmet lokal tumorvekst som monoterapi. Antitumor effekt av bevacizumab og EMAP er mer sannsynlig på grunn av deres effekt på egenkapitalbevis og fibroblaster i stedet for kreftceller, og følgelig effekten av disse midlene som monoterapi var begrenset.
