Abstract
phosphatidylinositide-3-kinase (PI3K) signalveien er kritisk for flere cellulære funksjoner inkludert stoffskifte, spredning, angiogenese og apoptose, og er den mest vanlige endret sti i kreft hos mennesker. Nylig har vi utviklet en ny musemodell for tykktarmskreft hvor svulster er initiert av en dominant aktiv PI3K (
FC PIK3ca *
). Kreft i disse musene er moderat differensierte invasive mucinkjertler adenokarsinomer i proksimale colon som utvikler av 50 dager gammel. Interessant, disse kreftformene danner uten en godartet mellommann eller avvikende WNT signalering, noe som indikerer en ikke-kanoniske mekanisme tumorigenesis. Siden disse tumorer er avhengig av PI3K vei, undersøkte vi muligheten for tumorrespons ved målretting av denne reaksjonsveien med rapamycin, en mTOR-inhibitor. En kohort av
FC PIK3ca *
mus ble behandlet med rapamycin med en dose på 6 mg /kg /dag eller placebo i 14 dager. FDG dual hybrid PET /CT bildebehandling vist en dramatisk tumorrespons i rapamycin arm og dette ble bekreftet på obduksjon. Tumorvevet blir igjen etter behandling med rapamycin demonstrert øket pErk1 /2 eller vedvarende fosforylert ribosomalt protein S6 (PS6), noe som indikerer potensielle resistensmekanismer. Denne unike modellen vil videreutvikle vår forståelse av sykdom hos mennesker og legge til rette for utvikling av legemiddel gjennom farmakologisk screening og biomarkør identifikasjon
Citation. Deming DA, Leystra AA, Farhoud M, Nettekoven L, Clipson L, Albrecht D, et al. (2013) mTOR Hemming utløser en dramatisk Response i PI3K-Dependent tykktarm kreft. PLoS ONE 8 (4): e60709. doi: 10,1371 /journal.pone.0060709
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 26 oktober 2012; Godkjent: 01.03.2013; Publisert: 09.04.2013
Copyright: © 2013 Deming et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av Conquer Cancer Foundation of American Society of Clinical Oncology gjennom en Young Investigator Award (til DAD); National Cancer Institute av de amerikanske National Institutes of Health gjennom T32 CA009614 (til DAD), P50 CA095103 Gastrointestinal Specialized Program for forskning Excellence Grant, Vanderbilt Ingram Cancer Center), R01 CA123438 (til RBH), P30 CA014520 (Kjerne Grant, Universitetet i Wisconsin (UW) Carbone Cancer Center); og oppstart midler (til RBH) fra UW Division of Gastroenterology og Hepatology, UW Institutt for indremedisin, og UW School of Medicine og folkehelse. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av målrettet terapi for behandling av kreft har vært gjenstand for stor interesse og innsats. Inntil nylig har nye rettet terapi blitt studert i stor grad uselekterte populasjoner. Begrenset effekt er vist ved hjelp av denne tilnærmingen. Men som vi utvikler oss nærmere en epoke av personlig medisin, hver histologisk subtype av kreft er å bli bedre forstått som en samling av sjeldne krefttyper med hver definert ved sin mutasjon profil. Derfor bør testing av målrettede midler utføres med en valgt befolkning bærer mutasjoner kjent for å aktivere signalveier blir målrettet.
Menneskelige colonic svulster inneholde flere mulige onkogene driver mutasjoner som potensielt kan være målrettet, inkludert
KRAS
,
BRAF
, og
PIK3CA product: [1] Disse muterte kinaser har vært viktige mål for den videre utvikling av terapeutiske midler. De har også vært viktig for å forstå biologien til motstand mot epidermal vekstfaktor reseptor rettet terapi, cetuximab og panitumumab [2], [3]. Til tross for betydelige fremskritt i behandlingen av denne dødelige sykdommen forblir tykktarmskreft den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA [4]. Å fremme behandlingstilbud for pasienter, er nødvendig videre undersøkelser om biologien til disse mutasjonene. Dette vil gi en bedre forståelse av hvilke pasienter som er mest sannsynlig å svare på bestemte behandlinger.
PIK3CA
mutasjoner forekommer hos 20-30% av menneskelige kolorektal kreft [5], [6]. Tre hotspot mutasjoner er ofte funnet, inkludert H1047R, E542K, og E545K, noe som resulterer i en konstitutivt aktiv form av PI3K p110α katalytiske subenhet [7]. Denne dominerende aktiv PI3K deretter resulterer i økt AKT /mTOR sti signalering og økt cellulær proliferasjon (figur S1) [8]. Mens flere etterforskere har undersøkt effekten av disse mutasjonene i cellelinjer, vårt laboratorium har nylig utviklet en musemodell for tykktarmskreft som er initiert av en dominant aktiv PI3K (
FC PIK3ca *
) [9]. I denne modellen, store moderat differensierte mucinkjertler invasive adenokarsinomer utvikle seg i proksimale colon etter bare 50 dager gammel. Disse svulstene er initiert av et ikke-kanoniske vei uavhengig av avvikende WNT signalering. Siden disse svulstene er initiert av aktivert PI3K, rettet vi å finne ut om disse svulstene er avhengig av denne veien. Her viser vi at behandling av
FC PIK3ca *
mus med mTOR-hemmer, rapamycin, resulterer i en dramatisk reaksjon i avanserte tykktarm kreft. Dette indikerer at humane svulster avhengig av PI3K /AKT veien vil trolig bli utsatt for hemmere av nedstrøms meklere.
Materialer og metoder
Mus Husbandry
Alle dyrestudier var utført under protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Wisconsin-Madison, etter retningslinjene til American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Homozygot
FC
+
hunnmus (FVB /N-Tg (Fabp1-Cre) 1Jig; NCI Mouse Repository, Strain nummer – 01XD8) ble krysset til homozygot
PIK3ca *
+ hannmus (C57BL /6-
Gt (ROSA) 26Sor
TM7 (Pik3ca *, EGFP) Rsky /
J, The Jackson Laboratory, Stock Number – 012 343) for å generere
FC PIK3ca product: * mus brukt i denne studien. Musene ble genotypet for
FC Hotell og
PIK3ca *
som beskrevet tidligere [10], [11].
DYR
FC PIK3ca product: * mus mellom 50 og 60 dager gammel ble valgt for studien påmelding så lenge de ikke var døende. Baseline dual hybrid
18F-FDG PET /CT-skanning ble utført før og 15 dager etter behandlingsstart. Svulsten størrelse ble subjektivt bestemt fra før behandling RAW-bilder og brukes til stratifisering under randomisering til rapamycin og kontrollgruppene. Dyr i kontrollgruppen fikk etanol oppløst i vann til en 1% sluttkonsentrasjon ved oral tvangsforing daglig i 14 dager. Dyr ble randomisert til rapamycin armen fikk 6 mg /kg rapamycin (LC Labs, Woburn, Massachusetts) ved oral gavage per dag i 14 påfølgende dager. Rapamycin ble oppløst i etanol til en konsentrasjon på 50 mg pr ml før suspendering i vann til et sluttvolum på 200 pl for administrering.
Imaging
Dyr ble fastet i minst 6 timer før injeksjon av
18F-FDG (160 pCi; IBA Molecular, Romeoville, IL) eller
18F-FLT (140 pCi, University of Wisconsin Syklotron, Madison WI). Etter injeksjon ble dyrene holdt under anestesi i 60 minutter og deretter preparert for virtuelle colonography som tidligere beskrevet [12]. En 10-minutters PET Kjøpet ble utført, umiddelbart etterfulgt av CT-skanning. Maksimal intensitet anslagene ble opprettet i Siemens Inveon Forskning arbeidsplassen (Knoxville, Tennessee). PET-bildene ble rekonstruert ved hjelp OSEM3D /MAP (OSEM3D, 2 iterasjoner; MAP 18, iterations 16 undergrupper). Demping korreksjon ble utført ved hjelp av CT-data. CT-bilder ble rekonstruert ved hjelp av standard conebeam gjenoppbygging. Baseline og etter behandling PET skanner ble normalisert til injisert dose, dose forfall, aktivitet og vekt. Tumorvolumer ble estimert fra målinger på PET /CT-skanner (figur S2). PET billeddiagnostikk ble brukt til å lokalisere svulstene før volum estimering. Tumorvolumer kan bare estimeres, som skildre nøyaktig tumor grensene er vanskelig. Dette er fordi disse kreftformene er ikke luminal og subtile FDG signalendringer knyttet til hyperplastisk normal epitel rundt svulstene finnes. Tumorvolumer i hver årsklasse ble sammenliknet med en tosidig Student eksakte t-test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Histologi og Immunohistochemistry
Mus ble avlivet av CO
2 kvelning etter deres etterbehandling bildebehandling. Tynntarmen og tykktarmen ble fjernet, spylt med PBS, split langs, sprikende ut, og fiksert i 10% bufret formalin i 24 timer. Vevene ble deretter lagret i 70% etanol, behandlet, innstøpt i parafin og skåret i 5 um seksjoner. Hver tiende delen var farget med hematoxylin og eosin (H E) for histologisk vurdering. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av Histomouse ™ Max Broad Spectrum (DAB) kit som beskrevet av produsenten (Invitrogen, Carlsbad, California) og som tidligere beskrevet [9]. Immunfluorescens ble utført ved anvendelse av en lignende protokoll med de følgende endringer: 5% melk i PBS ble brukt til å blokkere vev. Alle trinn etter inkubasjon med det primære antistoff og vaskevæske ble utelatt og erstattet med følgende: inkubert med AlexaFluor 488 geite-anti-kanin-IgG fluorescerende sekundært antistoff (1:1000, Invitrogen) i en time, vasket i PBS, og montert ved hjelp av ProlongGold Antifade Reagens med DAPI (Invitrogen). De primære antistoffer som følger med: anti-Pakt (Ser473, 1:100, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-PS6 (1:200, Cell Signaling Technology), anti-Ki67 (1:1000, Cell Signaling Technology) og mus anti-β-catenin (1:200, BD Biosciences – Clone 14, San Diego, California).
Western blot analyse
Vevsprøver ble skåret ut og flash frosset. Etter 24 timer ble prøvene sonikert i T-PER vev proteinekstraksjon reagens (Thermo Scientific, Pittsburg, PA), proteasominhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma-Aldrich) . Hentet protein ble deretter drevet som tidligere beskrevet [9]. Primære antistoffer mot p110α, Pakt (Ser473), AKT (pan, 11E7), total Tuberin /TSC2 (D93F12), pmTOR (Ser2448), pS6K1 (p70 S6 kinase, Thr389), PS6 (Ser235 /236), Total S6 (5G10 ), ble spaltet caspase 3, pErk1 /2 (Thr202 /Tyr 204) og total ERK 1/2 (Cell Signaling Technology) inkubert i bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) ved en 1:1000-forhold i 16 timer. Anti-GAPDH antistoff (Cell Signaling) ble benyttet som en lasting kontroll i forholdet 1:5000.
Resultater
FC PIK3ca product: * mus utvikler proksimal tykktarm kreft som kan følges Langsgående for behandlingsstudier
FC PIK3ca *
mus raskt utvikle moderat invasive mucinkjertler adenokarsinomer [9]. Viktigere for denne studien, kan svulster i disse musene bli oppdaget av dual hybrid
18F-FDG eller
18 F-FLT PET /CT colonography (Figur S3
A Hotell og
B
, henholdsvis). I vår nylig beskrivelse av denne modellen, vi evaluert utvikling av tumorer i tykktarmen over tid [9]. Invasive adenokarsinomer ble identifisert i 75% av musene på bare 40 dager gammel. De aller fleste av mus blitt døende av bare 60 til 80 dagers alder. Gitt målet med denne studien for å måle effekten av rapamycin på pre-eksisterende tykktarm kreft med en dominant aktiv PI3K som er lagt inn i våre terapeutiske studie 22
FC PIK3ca *
mus ved 55 dagers alder, en alder da de fleste har pre-eksisterende kreft, men har ennå ikke blitt døende. Musene ble delt i grupper basert på kjønn og forbehandling tumor størrelse som estimert fra baseline dual hybrid
18F-FDG PET /CT colonography. Et volum på 50 mm
3 ble anvendt som en cut-off for å bestemme stor versus små svulster. Disse musene ble deretter randomisert i to behandlingsarmene, fikk enten placebo eller rapamycin ved oralt inntak. Baseline er vist i tabell 1.
FCPIK3ca * Mus tolerere Rapamycin Behandling
Rapamycin ble gitt til
FC PIK3ca *
mus i en dose på 6 mg /kg /dag ved oral føring for en total av 14 påfølgende dager, som hadde blitt vist tidligere for å være akseptabel for mus [13].
FC PIK3ca *
mus også tolerert denne behandlingen også (tabell 1). Ingen signifikant endring i aktivitetsnivå eller vekt ble sett mellom placebo og behandling kohorter gjennom hele studieperioden. To mus i placebogruppen ble døende på grunn av tarmobstruksjon fra store proksimale colontumorer og ble avlivet før gjennomføringen av den planlagte behandlingsforløpet. Begge disse musene hadde store svulster på baseline bildebehandling med volum over 80 mm
3.
Rapamycin induserer en betydelig tumorrespons i
FC PIK3ca *
Mus
Etter 14 dagers behandling, ble musene i både placebo og rapamycin armene avbildes en andre tid til å vurdere behandlingseffekten. Etter normalisering av bildedataene, ble en dramatisk respons nevnt i rapamycin-behandlede mus sammenlignet med kontroller (figur 1, figur S4, og Tabell S1). I flere dyr, kunne FDG aktivitet forenlig med svulstvev ikke funnet følgende rapamycin behandling. De PET /CT-bilder ble brukt for tumorlokalisasjon og volumene ble estimert basert på målinger fra disse bildene (figur S2). I placebogruppen, tumorvolumet nesten doblet i størrelse fra baseline med en økning fra baseline på 96%. Denne dramatiske endringen var ventet som disse kreftformene vokse ganske raskt i denne modellen. I rapamycin kullet, var det en markert reduksjon i tumorvolum, med bare 16,9% av grunnlinjen massen fremdeles er til stede i gjennomsnitt (figur 1
B
og tabell S1). Ikke alle svulster svarte i samme grad, om enn ingen av kreft i rapamycin armen ble vist å øke i størrelse mens du mottar behandling. Siden disse lesjonene er ganske følsomme for hemming av mTOR av rapamycin, dette videre indikerer at de er avhengig av PI3K /AKT /mTOR signalkaskade.
En gruppe på 22
FC PIK3ca *
mus ble fotografert med dual hybrid
18F-FDG PET /CT colonography og stratifisert basert på tumorstørrelse. Mus ble deretter behandlet med et placebo (etanol oppløst i drikkevann) eller rapamycin 6 mg /kg /dag ved oral tvangsforing i 14 dager. Etter gjennomføring av behandlingsforløpet, ble PET /CT colonography gjentas for å vurdere for tumorrespons. I musene som fikk placebo, svulstene økt i størrelse i løpet av 14 dagers behandlingsperioden (
A, venstre
). I rapamycin arm en signifikant respons ble notert (
A, midt
). Projeksjon og aksiale visninger presenteres på toppen og bunnen, henholdsvis. De ble plassert på PET-bilder og volumer svulster ble målt fra CT data. Den prosentvise endringen i tumorvolumet for hver svulst vises i en foss tomt (
B
).
For å bekrefte respons data innhentet med PET /CT colonography, obduksjon ble utført følgende bilde oppkjøpet. En signifikant respons ble også iakttatt ved nekropsi (figur 2). Bruke en intent-to-treat analyse, cecal og /eller colontumorer var grovt til stede i 10 av 11 mus i placebogruppen, men var tilstede i bare fem av 11 mus i rapamycin arm (figur 2
C
, p = 0,021), noe som indikerer en signifikant behandlingseffekt med monoterapi rapamycin terapi. I placebogruppen, 8 av 11 mus hadde colontumorer, mens kreft var til stede i bare 3 av 11 rapamycin-behandlede mus (figur 2
C
, p = 0,034). Begge grupper hadde et likt antall coecale tumorer, med to av 11 mus å ha dem i hver arm. En av de
FC PIK3ca *
mus i kontrollgruppen med en cecal svulst også utviklet metastatisk sykdom med spredning av kreft til mesenteric vev tilstøtende milt og bukspyttkjertel (figur 2
D og E
). Ingen bevis for metastatisk sykdom ble påvist i noen mus behandlet med rapamycin.
Etter etterbehandling imaging, ble obduksjon. Tykktarmen ble skåret ut og delt på langs. Store submukøse svulster ble sett hos mus behandlet med placebo (
A
). En dramatisk respons ble observert ved obduksjon i rapamycin behandlede kohort (
B
). Hyperproliferasjon ble redusert i den normale proksimale tykktarm og minimal resttumor ble identifisert. 10 av 11
FC PIK3ca *
mus i placebo kohorten hadde identifiserbare svulster mens bare 5 av 11 mus i rapamycin armen hadde identifiserbare svulster (
C
). En mus i placebo kohorten ble funnet å ha metastatisk sykdom fra en cecal tumor (
D
). En stor lesjon innenfor mesentery ble identifisert tilstøtende milt og bukspyttkjertel (
D, pil
). På histologisk seksjonering en lignende morfologi ble registrert mellom metastatisk innskudd og den primære svulsten i cecum (
E
).
FC PIK3ca product: * Svulster Demonstrer p110 * Expression og Aktivering av PI3K Pathway som er redusert med Rapamycin Behandling Resulterer i tumorrespons og Redusert spredning
etter obduksjon ble colontumorer isolert og klargjort for histologisk seksjonering. H E farging viste hyperplastisk epitel vev og moderat differensiert invasive mucinkjertler adenokarsinomer som forventet i placebo kohort (Figur 3
En
, venstre). I de rapamycin-behandlede mus, ble en betydelig reduksjon i den hyperplasi av epitelvev angitt, og tumorstørrelsen ble redusert (figur 3
A
, etter til høyre). Søyle ondartede celler vanligvis omkranser mucinkjertler innsjøene var borte i de fleste av svulstene, noe som resulterer i færre celler farging sterkt for Pakt og PS6 i svulster fra rapamycin-behandlede mus sammenlignet med kontroller (figur 3
B og C
, etter henholdsvis). Redusert celleproliferasjon ble notert følgende rapamycin behandling som demonstrert av redusert Ki67 farging (figur 3
D
).
Etter obduksjon, colonic svulstvev med tilstøtende kolon epitelvev var formalinfiksert, parafin- innebygd, og gjennomgikk histologisk snitting. Vev ble farget med H E (
A
). Sammenlignet med placebo, ble en dramatisk reduksjon i størrelsen nevnt i svulster fra rapamycin-behandlede mus. Svulsten avbildet i
A, rapamycin
er fra en FC3K mus behandlet i en pilot av denne studien og valgt for dette tallet på grunn av den observerte dramatiske delvis respons. I tillegg ble ondartet søyle epitelet som omgir mucinkjertler innsjøene svekket etter rapamycin behandling sammenlignet med kontroll. Færre Pakt og PS6-positive celler ble observert i svulster fra mus behandlet med rapamycin i forhold til svulster fra mus som fikk placebo (
B Hotell og
C, etter henholdsvis). Tumorproliferasjon, målt ved Ki67, ble også redusert i tumorer fra mus behandlet med rapamycin sammenlignet med de som ble behandlet med placebo (
D
). Størrelse bar:
En
, 1 mm.
B-D
er ~3 × forstørrelser.
Etter behandling med rapamycin, oppstrøms aktivering av PI3K veien forble uforstyrret som forventet (figur 4). Ved obduksjon noen svulstvev ble flash frosset før protein forberedelse og kvantifisering. Proteinet P110 *, den dominerende aktive form av PI3K anvendt i denne modellen, ble uttrykt i tumorer og normale epitel av den proksimale tykktarm hos alle dyr, uavhengig av behandling. Betydelig Pakt uttrykk ble også bemerket i svulster og normal proksimale colon vev. Nivået av pakt synes ikke å være påvirket av rapamycin behandling. Proteiner pmTOR, pSK61, og PS6 ble redusert som følge av rapamycin behandling i de fleste vev, selv om noen svulster fant viser klart fortsatte aktivering av disse proteinene. Svulstene med vedvarende PS6 signale hadde mindre av en respons på rapamycin behandling som nevnt på PET billeddiagnostikk.
Alle
FC PIK3ca *
svulster og hyperplastisk tykktarm vev demonstrert uttrykk for p110 *, den dominerende aktive katalytisk subenhet av PI3K i denne modellen. Dette resulterte i økt fosforylering av AKT
9. Nivåene av Pakt og total AKT ble ikke endret som følge av rapamycin behandling. TSC2 totale nivåer heller ikke variere. Nivåene av pmTOR, pSK1, og PS6 imidlertid varieres med rapamycin behandling. I tumorer fra placebokohorten (-), ble det observert høye nivåer av PS6. I tumorer som ble behandlet med rapamycin (+), reduserte nivåer av PS6 ble sett i de fleste tumorer og korrelert med øket respons på PET avbildning. Økt pErk1 /2 ble observert hos noen placebobehandlede kreftformer og også rapamycin-behandlede tumor med vedvarende PS6 signalering.
FC PIK3ca *
svulsten og hyperplastisk vev hadde økt kløyvet caspase 3 på grunn av økt cellefornyelsen. En reduksjon i spaltede kaspase 3 ble identifisert i tumorer som innehar øket pErk1 /2-signalering som indikerer at tumorer med økt fordel kan være resistente mot rapamycin behandling gjennom redusert apoptose. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Motstand mot Rapamycin Behandling av
FC PIK3ca *
Mus Kan bli formidlet gjennom Perk Up-regulering og Vedvarende PS6 Signa fører til redusert apoptose
Noen svulster hadde en begrenset respons på rapamycin behandling. Vi antok at dette kan være relatert til opp-regulering av Raf /MEK /ERK-signalkaskade eller vedvarende PS6 signalering. ERK1 /2 oppregulering har tidligere blitt beskrevet i respons til rapamycin behandling [14], [15]. Nivåer av pErk1 /2 ble evaluert i normal tykktarm vev, proksimale colontumorer, og cekale tumorer (figur 4). pErk1 /2 ble funnet å være dramatisk oppregulert i en mus fra hver behandlingsgruppe. I en gruppe på ti svulster fra ubehandlede
FC PIK3ca *
mus, seks demonstrert en viss grad av pErk1 /2, som indikerer mulig mekanisme (er) for iboende motstand (figur S5
A
). I tillegg har alle vev som ble behandlet med rapamycin gjorde vise en økning i pErk1 /2 over kontroller. Disse data indikerer at en subpopulasjon av
FC PIK3ca *
tumorer besitte aktivering av ERK signalering. Denne signalisering kan være ansvarlig for en viss grad av motstand mot mTOR inhibering, da ERK-reaksjonsveien ikke inhiberes med denne behandlingsstrategi. Denne motstanden kan være iboende til svulsten eller indusert sekundært til behandling.
For å bekrefte at WNT signalering er ikke avvikende i disse svulstene, som beskrevet tidligere, [9] vi utført histologisk analyse undersøker etter bevis for kjernefysisk β -catenin. Ingen kjernefysisk β-catenin ble sett i kontroll tumorer (figur S5
B
). I tillegg ble tumor rester fra rapamycin-behandlede mus også kontrollert for avvikende WNT signalering for å bestemme om induksjon av denne bane kan være en ytterligere mekanisme for å redusere følsomheten av disse svulstene til rapamycin. Ingen bevis for kjernefysisk β-catenin ble demonstrert i svulstene av rapamycin-behandlede mus (figur S5
B
).
Histologisk undersøkelse av et representativt rapamycin bestandig
FC PIK3ca *
tumor viste en lignende morfologi til kreft fra kontrollene (figur 5). I tillegg ble det ingen forskjeller i celleproliferasjon eller nivåer av Pakt bemerket (Figur 5
C
). I en tumor fra en kontroll mus, ble PS6 bemerket i slimhinne hyperplasi samt tumorvevet, som forventet (fig 5
D
, nederst). Men i svulsten fra en rapamycin-behandlede mus, ble det observert en reduksjon i PS6 i det normale epitelvev, men PS6 signal vedvarte i den gjenværende kreftvev (figur 5
D
, topp, fig S6
A
). Mengden av PS6 til stede i disse resistente kreftcellene overstiger det som ses i det reagere kreft i figur 3. Dette indikerer en differensial respons på normalt vev sammenlignet med tumorvev og kan være en mekanisme for resistens overfor inhibering mTOR i denne innstillingen.
en svulst resistente mot rapamycin (øverst i hvert panel) og en svulst fra en placebo-behandlede
FC PIK3ca *
mus (nederst i hvert panel) ble innlemmet i samme histologiske blokken. En lignende fenotype og proliferasjonsrate ble notert på H E og Ki67 farging, henholdsvis (
A Hotell og
B
). Ingen signifikant forskjell i Pakt ble sett mellom svulster fra placebo og rapamycin behandlet mus (
C
). I vev fra placebo-behandlede mus, økt PS6 ble sett i svulstvev og liggende hyperplastisk vev som forventet (
D
). Interessant, i vev fra rapamycin-behandlede
FC PIK3ca *
mus, reduserte PS6 er notert i den hyperplastisk vev, men økte PS6 signalering forblir i den resistente tumorvevet til tross for rapamycin behandling. Dette tyder på at vedvarende PS6 omgivelser innenfor de svulster kan være mekanismen av tumorresistens. Denne samme fargemønster ble observert i alle tumorer (3/3) med noen neoplastiske celler som er tilbake etter behandling med rapamycin som ble undersøkt. Størrelse barer:
En
,
C Hotell og
D
, 1 mm;
B
, 500 mikrometer.
Diskusjoner
Målrette onkogene veier har ført til nylige spennende fremskritt i flere krefttyper, inkludert vemurafenib i
BRAF
mutant melanom, erlotinib i
EGFR
mutant ikke-småcellet lungekreft, og crizotinib i lungekreft med EMLA4-ALK trans [16] – [18]. Disse midler anvendes i innstillingen av spesifikke genetiske endringer som koder for onkogene proteiner. Rettet mot disse driver proteiner resulterer i en høy svarprosent til agenter rettet mot dem. Denne tilnærmingen er tillatt for hensiktsmessig evaluering og FDA-godkjenning av disse midlene for disse indikasjonene [19]. Utviklingen av disse midlene i spesifikke molekylære innstillinger har ført til realisering at hver histologisk type kreft er egentlig en samling av mange sjeldne undergrupper. Disse subtyper hver er differensiert etter sin profil mutasjoner.
PI3K /AKT veien er den vanligste genetisk endret signalkaskade i kreft. Betydelig klinisk interesse rettet mot PI3K /AKT /mTOR vei fortsetter å øke etter hvert som nye hemmere av denne veien fortsetter å bli utviklet. Inhibering av PI3K reaksjonsveien i krefttyper som innehar
PIK3CA
mutasjoner har vist klinisk fordel i bryst og gynekologiske kreftformer, men tilstedeværelsen av disse mutasjonene alene ikke forutsi følsomheten til disse metodene [20]. En undergruppe av pasienter som er mest sannsynlig å dra nytte av den videre utvikling av nye hemmere av PI3K veien er fortsatt uklart.
Inntil nylig virkningene av en aktivert PI3K på pattedyrs tarm hadde ikke blitt undersøkt. Vi var de første til å beskrive utviklingen av avanserte invasive mucinkjertler adenokarsinomer utviklings i proksimale colon som et resultat av uttrykk for en dominerende aktiv PI3K [9]. Interessant nok har disse tumorer utvikler seg raskt, uten en betydelig luminal komponent eller avvik i WNT signalering, noe som indikerer en ikke-kanonisk mekanisme startfasen. Her viser vi at svulstene forming i
FC PIK3ca *
mus er i stor grad avhengig av PI3K veien. I denne modellen er en dominerende aktiv PI3K uttrykt i tykktarmen som resulterer i startfasen. Disse kreft er veldig aggressive og er i stand til å bli fulgt i lengderetningen med dual hybrid
18F-FDG PET /CT colonography. Etter bare to uker med rapamycin terapi ble observert en signifikant respons med bildebehandling og bekreftet ved obduksjon. Disse resultatene indikerer at
FC PIK3ca *
svulster er avhengige av denne veien. Hvis tilsvarende svulster er til stede hos mennesker, kan inhibering av PI3K veien resulterer i signifikant klinisk fordel for pasienter som hensiktsmessige.
hypotese at en subpopulasjon av humane tumorer dannes som en konsekvens av en dominerende aktiv PI3K, og at disse tumorene er avhengig av denne reaksjonsvei. I en fersk patologisk serie, aktive mutasjoner i
PIK3CA
ble observert oftere hos mucinkjertler tykktarm kreft hos mennesker, i likhet med vår modell, og ble assosiert med forverret prognose [21]. Aktivering mutasjoner i
PIK3CA
ble omvendt forbundet med translokasjon av β-catenin [21]. Translokasjon av β-catenin forventes hvis disse svulstene ble initiert av avvikende WNT signalering som en del av de tidligere omtalte kanoniske mekanismer for tumordannelse i tykktarm kreft [22]. Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at en undergruppe av menneskelige tykktarm kreft oppstår i innstillingen aktivert PI3K, lik det som er sett i vår modell. Bare et lite antall svulster har blitt avhørt for avvik i WNT signale og mutasjoner i
PIK3CA
, og dermed ytterligere undersøkelser er garantert videre karakterisere denne pasientgruppen. Basert på disse tidligere studier, tror vi at dette sannsynligvis representerer 1-5% av alle tykktarm kreft.
Selv med betydelige responser sett i denne studien, motstand mot rapamycin terapi ble identifisert. Økt pErk1 /2, PS6, eller begge deler ble observert i tumorer som vedvarer til tross for rapamycin behandling. Disse resistensmekanismer kan være iboende i svulstene eller indusert sekundært til rapamycin behandling. Rapamycin er kjent for å hemme ribosomale S6 kinaser (S6K1 og S6K2) gjennom sin interaksjon med mTOR [23]. Inhibering av S6Ks avtar nedstrøms fosforylering av S6 ved Ser
240/244 og Ser
235/236 [24]. Studier i S6K1 /S6K2-null mus embryonale fibroblaster bekreftet at disse S6Ks var de store kinaser som påvirker S6, men viste også en MEK1 /2 avhengige mekanismen for S6 fosforylering på Ser
235/236 [25]. I tillegg har ERK1 /2 blitt vist å aktivere p90 ribosomal S6-kinase (RSK), som deretter kan fosforylere S6 i det Ser
235/236 uavhengig av mTOR signalering (figur S7) [26]. I alle tumorer fra
FC PIK3ca *
mus, observerer vi fosforylering av S6 antas å være relatert til aktivering av PI3K pathway. I en undergruppe av svulster, vi også observere økt pErk1 /2 og vedvarende PS6. Disse data indikerer at den alternative fosforylering av S6 mediert av ERK1 /2 aktiveringen av RSK kan være en mekanisme ved hvilken disse svulstene er resistente mot rapamycin. Kombinasjoner av målrettet terapi vil trolig være nødvendig i enkelte tilfeller for å overvinne disse resistensmekanismer. PI3K og Raf /MEK /ERK pathway inhibitor kombinasjonsregimer fortsette å være et aktivt område på preklinisk og klinisk forskning [27] -. [29]
Selv om rapamycin er et velkjent hemmer av mTOR og PI3K veien, nye agenter fortsette å bli utviklet for å målrette denne veien.
