Abstract
Vi har nylig beskrevet mitokondrie lokalisering og import av vitamin D reseptor (VDR) i aktivt prolifererende HaCaT-celler for den første gang, men dens rolle i organeller er ukjent. Mange metabolske mellomprodukter som støtter cellevekst er gitt av mitokondriene; følgelig identifisering av proteiner som regulerer mitokondrie metabolske veier er av stor interesse, og vi søkt å forstå om VDR kan modulere disse banene. Vi genetisk forstummet VDR i HaCaT celler og studert effekter på cellevekst, mitokondrie metabolisme og biosyntetiske veier. VDR knockdown resulterte i sterk vekst-inhibering, med opphopning i G0G1 fasen av cellesyklusen og redusert akkumulering i M-fasen. Effekten av VDR lyddemping på spredning ble bekreftet i flere humane kreftcellelinjer. Redusert VDR uttrykk ble konsekvent observert i to ulike modeller av celledifferensiering. Nedskrivningen av taushet HaCaT cellevekst ble ledsaget av sterk økning i mitokondriemembranen potensial, som sensitivisert cellene til oksidativt stress. Vi fant at transkripsjonen av subenheter II og IV av cytokrom c oksidase ble signifikant øket ved VDR demping. Følgelig behandling av HaCaT celler med vitamin D downregulated begge subenheter, noe som tyder på at VDR kan hemme luft kjeden og omdirigere TCA mellom mot biosyntese, og dermed bidra til metabolsk bryteren som er typisk for kreftceller. For å utforske denne hypotese, undersøkte vi flere acetyl-CoA-avhengige biosyntetiske reaksjonsveier, slik som mevalonat pathway (målt som kolesterolbiosyntese og prenylation av små GTPases), og histon acetylering nivåer; alle disse banene ble hemmet av VDR lyddemping. Disse dataene gir bevis for rollen VDR som en gatekeeper av mitokondrie respiratoriske kjeden aktivitet og en tilrettelegger for avledning av acetyl-CoA fra energiproduserende TCA syklus mot biosyntetiske veier som er avgjørende for cellulær proliferasjon.
Citation: Consiglio M, DESTEFANIS M, Morena D, Foglizzo V, Forneris M, Pescarmona G, et al. (2014) The Vitamin D Receptor Hemmer Respiratory Chain, Bidra til Metabolsk Switch som er avgjørende for Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10,1371 /journal.pone.0115816
Redaktør: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Japan
mottatt: 09.08.2014; Godkjent: 27 november 2014; Publisert: 29.12.2014
Copyright: © 2014 Consiglio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Minis dell’Istruzione Università e Ricerca. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
vitamin D reseptor (VDR), sammen med de andre medlemmene av steroid hormon reseptor familien, har generelt blitt beskrevet som en klassisk ligand-modulert transkripsjonsfaktor. De forskjellige effektene av VDR er utløst av ligand-induserte kjernefysisk translokasjon og binding til vitamin D-responsive element (VDRE) områder på regulerte gener, i samarbeid med heterodimerisering partnere, coactivators og corepressors. Forskjeller i corepressor bindende og DNA metylering reflektere den dype variasjon av VDR antiproliferative responser i ulike cellemodeller [1]. Resistens mot atom effekten av vitamin D har blitt rapportert i flere modeller av kreft, inkludert prostata, bryst og blære kreft, der økt corepressor uttrykk og lokalisering har vært ansett for å være ansvarlig for ufølsomhet for hormonet [2] – [4 ].
steroidreseptorer også ha en nongenomic modalitet av action, spesielt ved plasmamembran eller mitokondrielle områder, og VDR er intet unntak. Faktisk er den raske, nongenomic effekter av vitamin D-ser ut til å være formidlet av VDR [5] – [7]. Mange steroidreseptorer og nukleære transkripsjonsfaktorer gå inn i mitokondrie rommet, hvor de enten utøve transkripsjonsregulering av mitokondrisk DNA eller kontroll mitokondrie biogenese og metabolisme [8] – [11]. Vi har nylig beskrevet mitokondrielle lokalisering av VDR i en human prolifererende keratinocytt cellelinje (HaCaT) for første gang, og viste at mitokondrie innførsel av reseptoren er mediert av permeabiliteten overgangen pore-komplekset [12]. Imidlertid gjenstår funksjonen til VDR i denne organeller som skal belyses. Mitokondrier er multifunksjonelle organeller og mitokondrie aktivitet er viktig for cellulær proliferasjon og fysiologi. For eksempel, mitokondriene spille viktige roller i cellulær energi (ATP) via trikarboksylsyre (TCA) syklus koplet til oksidativ fosforylering (OXPHOS), så vel som i løpet av apoptose via reaktive oksygenarter (ROS) generering og cytokrom c frigivelse. Flere studier har indikert at mitokondriell dysfunksjon bidrar til utvikling og progresjon av forskjellige humane sykdommer, inkludert kreft [13]. Et kjennetegn på kreftceller er endret metabolisme støtter rask celleproliferasjon [14]. Mange metabolske mellomprodukter som støtter cellevekst er gitt av mitokondriene [15]; følgelig identifisering av proteiner som regulerer mitokondrie metabolske veier er av stor interesse, og vi søkt å forstå om VDR kan modulere disse banene.
I denne studien, ved hjelp av vår tidligere beskrevet modell (den voksende HaCaT cellen linje), vi genetisk forstummet reseptoren og undersøkte effekter på cellevekst, mitokondrie metabolisme og biosyntetiske veier. De innsamlede dataene gir holdepunkter for en ny rolle VDR som en negativ regulator av åndedretts kjeden aktivitet, og vi fremheve konsekvenser for celle anabolisme og vekst produsert av VDR på mitokondrie respirasjon. Basert på våre observasjoner, konkluderer vi med at VDR, ved å holde mitokondrie respiratorisk aktivitet, gjør at cellen til overs metabolske mellomprodukter, som kan være avledet fra oksideringsmetabolisme mot en biosyntetiske skjebne, støtte cellevekst. Vi validert den generelle rollen til VDR som en forsterker av celleproliferasjon utvide våre observasjoner til flere humane kreftcellelinjer.
Resultater
VDR stanse i HaCaT celler hemmer celledeling
Fordi vi tidligere preget VDR mitokondrie import i HaCaT celler, vi brukte denne modellen til å undersøke VDR funksjon ved hjelp av genetiske lyddemping. Den reduksjon av VDR nivåer ved lentiviral levert shRNA som hadde blitt reist mot den menneskelige VDR var bemerkelsesverdig, som demonstrert av mRNA og protein analyser i fig. 1A og 1B, og utløste potent vekst arrest i HaCaT celler, som evalueres av et spredning analyse, som fremhevet en tydelig nedgang i veksttakten i VDR-forstummet celler sammenlignet med kontrollceller (fig. 1c). Cellevekstarrest ble karakterisert ved akkumulering av VDR slå ned cellepopulasjon i G0 /G1-fasen av cellesyklusen, og en reduksjon i M-fase cellepopulasjon (fig. 1D). Ingen tegn til apoptotiske eller lider celler var tydelig i forstummet celler, som demonstrert av cellesyklusanalyse, som ikke avslører en sub-G0 topp, og MTT toksisitet analysen, som avslørte identisk levedyktighet i kontroll og forstummet celler (fig. 1E).
Subkonfluente HaCaT celler ble infisert med lentiviral VDR shRNA 3 og shRNA kontroll partikler. Syv dager etter smitte og puromycin utvalg, ble VDR uttrykk evaluert i de cellulære ekstrakter. (A) mRNA uttrykk nivåer ble kvantifisert ved hjelp av sanntids analyse av VDR transkripsjoner, og verdiene er uttrykt som fold endringer i forstummet celler sammenlignet med kontrollene. (B) VDR uttrykk i de mitokondrielle fraksjoner (venstre panel) og totalt lysatene (høyre panel) fra shRNA-transfektert kontroll og shRNA-transfekterte VDR-celler ble analysert ved hjelp av western blotting. Tubulin oppdaget i totale ekstrakter og VDAC nivåer i mitokondrielle fraksjoner ble brukt som interne kontroller for protein lasting. Effekten av VDR lyddemping på proliferasjon ble undersøkt ved anvendelse av en krystallfiolett analyse i celler som var blitt farget ved forskjellige tidspunkter etter poding (C), så vel som ved hjelp av cellesyklusanalyse (D) i celler som ble høstet på dag 7 etter infeksjonen . (E) Cellelevedyktigheten ble evaluert ved anvendelse av MTT-analysen på dag 7 etter infeksjon, og verdiene er uttrykt som prosentandel av absorbansen til shRNA kontroll. Dataene er uttrykt som middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Differensierings og antiproliferative virkning av vitamin D in vitro er blitt tidligere beskrevet i litteraturen. Slike effekter medieres av transkripsjonen kontroll, som forutgås av nukleær translokasjon og forekommer ikke i vitamin D-stimulerte HaCaT-celler [12]. HaCaT-celler synes å være resistent mot de nukleære antiproliferative effekter av vitamin D, og tilsvarende, har vi funnet at vitamin D behandlingen forandret ikke veksten av HaCaT-celler (som vist i S1 fig.). Således HaCaT-celler representerer en modell av resistens overfor de unike egenskaper av vitamin D, og det er ikke noen uoverensstemmelse mellom den kjernefysiske antiproliferative rollen av vitamin D som er beskrevet i litteraturen, og de proliferative virkninger som utøves av VDR i vår modell celle. Resultatene av våre Silencing forsøk viser at VDR i HaCaT celler forbedrer cellevekst.
Mitokondrie lokalisering av VDR er en vanlig funksjon av humane kreftcellelinjer, og reseptor lyddemping hemmer celledeling
I for å vurdere om mitokondriene kan anses å være en vanlig mål for VDR, evaluerte vi dens ekspresjon i et panel av humane kreftcellelinjer, og de nevnte HaCaT-celler (fig. 2A). I hver cellelinje som testet positivt for VDR ekspresjon ble de mitokondrielle ekstraktene analysert via Western blotting og viste nærvær av reseptoren. Vi antok at dersom VDR var et kjennetegn på prolifererende celler og hadde potensial til å lette cellevekst, som foreslått av fenotype observert i forstummet HaCaT celler, så det kan lett bli spart, eller fjernet, i en differensiert tilstand. Dermed har vi evaluert VDR uttrykk nivåer i to modeller, noe som åpner for undersøkelse av menneskelige prolifererende celler og deres differensierte kolleger: Vi sammenlignet HaCaT prolifererende keratinocytt celler til fullt differensiert primære keratinocytter og rabdomyosakrom RD18 celler som hadde blitt overtalt til å differensiere ved den betingede uttrykk for MIR-206 [16]. Mitokondrie ekstrakter av begge differensierte cellepopulasjoner åpenbart redusert reseptor-ekspresjon sammenlignet med nivåene observert i prolifererende celler (fig. 2B).
(A) VDR-ekspresjon ble analysert i et panel bestående av flere humane cellelinjer ved hjelp av western blotting totalt lysatene (tot VDR) og mitokondrielle ekstrakter (mitoc VDR). For RD og MCF7 celler, VDR deteksjon krevde en lengre varighet av eksponering for ECL. (B) To modeller av cellulær differensiering ble brukt for å vurdere VDR nivåer i den totale lysatene og mitokondrielle fraksjoner: Menneske prolifererende HaCaT celler vs. humane primære differensierte keratinocytter og differensiering-induserbar RD18 celler som bærer en doksycyklin-induserbar MIR-206-uttrykke lentiviral vektor i fravær (ikke-indusert: NI) eller nærvær av doksycyklin for fire (indusert: IND4) og seks dager (indusert: IND6). Tubulin oppdaget i totale ekstrakter og VDAC nivåer i mitokondrielle fraksjoner ble brukt som interne kontroller for protein lasting. Blottene er representative for et sett med tre uavhengige eksperimenter
Etter å ha oppdaget den utbredte mitokondrie uttrykk for VDR, søkte vi om å bekrefte at VDR ablasjon kompromisser celleproliferasjon.; dermed avskaffet vi VDR uttrykk i alle de kreftcellelinjer ved hjelp av genetiske lyddemping. VDR ekspresjon ble stille i alle de VDR-positive cellelinjer, så vel som de HaCaT-celler, og reseptorekspresjon ble igjen sterkt redusert, som evaluert både i de samlede ekstrakter og mitokondrielle fraksjoner (fig. 3A). Observasjonene er gjort i HaCaT celler ble sterkt støttet av resultatene av disse knockdown eksperimenter fordi spredning av alle cellene ble markert hemmet av VDR lyddemping. Faktisk var vi i stand til å demonstrere en generell reduksjon i spredning frekvensen av alle de forstummet celler, som var lik den som ble observert i HaCaT celler, da deres vekst ble evaluert mellom 72 timer og 5 dager i forhold til vill type-celler (fig. 3B). Det stilnet fenotype ble bekreftet ved hjelp av en annen shRNA for VDR (shRNA 4, som beskrevet i metodedelen), som var så effektiv i stanse VDR som shRNA 3 og også redusert cellevekst (S2 fig.). Videre, når vi plasserte et shRNA som var ineffektive når det gjelder VDR lyddemping (shRNA 2, slik det er beskrevet i metodedelen) spredning av HaCaT-celler ble ikke hemmet (S2 fig.).
(A) cellene ble infisert med lentiviral VDR shRNA 3 eller shRNA kontroll og lyddemping effekt ble undersøkt i både totalt og mitokondrie ekstrakter hjelp western blotting. Tubulin oppdaget i totale ekstrakter og VDAC nivåer i mitokondrielle fraksjoner ble brukt som interne kontroller for protein lasting. (B) Både dempede og kontrollcellene ble utsatt for proliferasjonsanalyser syv dager etter infeksjon og seleksjon. Cellene ble farget i 72 timer eller fem dager etter såing, og verdiene for de dempede celler er uttrykt som prosentandel av deres respektive kontroller. Dataene er uttrykt som middel ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
VDR lyddemping forbedrer mitokondriell respirasjon
Andre steroidreseptorer er tidligere blitt antydet for å regulere transkripsjon og mitochondrial aktivitet [17] – [19], spørre oss å undersøke om VDR, som er lokalisert i mitokondrie rommet (ligner sine familie analoger), styrer mitokondrie metabolisme. Først vurderte vi mitokondrielle luft aktivitet HaCaT celler ved å måle variasjoner i membranpotensialet via JC-en analyse ved hjelp cytofluorimetry. Som vist i fig. 4A, VDR lyddemping sterkt økt mitokondriemembranen potensial, og når vi utsettes disse cellene til oksidativt stress (H
2o
2), deres potensiale ble svekket i større grad enn for villtype celler utsatt for det samme behandling (fig. 4A). Imidlertid, når cellene ble eksponert for en annen, ikke-oksidativt stress (f.eks sorbitol-indusert osmotisk stress), den mitokondrielle potensialet av både villtype og slå ned celler ble redusert i samme grad (fig. 4B). Basert på disse observasjonene, konkluderte vi med at VDR hemmet mitokondriemembranen potensial og sannsynligvis behersket ROS produksjon, beskytte cellen fra ytterligere oksidativt stress. Tvert imot, VDR tap økt luft potensial, men gjengitt celler mer utsatt for en oksidant-drevet potensial kollaps. Denne muligheten ble støttet av den betydelig lavere glutation (GSH) forbruk i villtype celler, som avslørt av de høyere nivåer av antioksidanter molekyl som ble målt i villtypeceller sammenlignet med forstummet celler (S3 fig.).
HaCaT-celler ble infisert med shRNA kontroll eller VDR shRNA 3 og mitokondriemembranen potensiale ble undersøkt ved hjelp JC-1 cytofluorimetric evaluering, i nærvær eller fravær av to forskjellige stressfaktorer: (A) Spenning og dempede cellene ble behandlet med enten 10 mM H
2o
2 eller (B) 0,5 M sorbitol. I begge figurene er et representativt bilde fra cytofluorimetric analysen er vist i toppanelet, mens resultatene fra tre separate forsøk er plottet i diagrammet i det nedre panel. Forholdet FL-2 /FL-1 ble beregnet, og verdiene er uttrykt i prosent av den ubehandlede kontroll shRNA. * P 0,05 sammenlignet med den ubehandlede kontroll shRNA,
$ P 0,05 sammenlignet med det behandlede shRNA kontroll. (C) Real time analyse av COX II (COX II) og IV (COX IV) subenhet transkripsjon uttrykk i kontroll og dempede celler. Fold endringer er plottet på diagrammene som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** P 0,01 sammenlignet med kontroll shRNA. (D) HaCaT-celler ble dyrket i nærvær eller fravær av 10 nM vitamin D og COX II og IV COX-transkript ekspresjon ble evaluert ved bruk av sanntids analyse etter 24 og 48 timer etter behandling. De plottede på grafene verdiene representerer ganger endring i transkripsjon uttrykk i behandlede versus ubehandlede celler og vises som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk.
§ P 0,05 og
§§ P. 0,01 sammenlignet med ubehandlede celler
Mitokondrie potensialet er påført proton gradient som er skapt av luft kjeden aktivitet; Derfor bestemte vi oss for å undersøke uttrykket av to subenheter av kompleks IV: cytokrom c oksidase (COX) subenheter II og IV, som transkripsjoner er av mitokondriell (tidligere) og kjernekraft (sistnevnte) opprinnelse. Både kjerne- og mitochondrially kodede proteiner er nødvendig for dannelsen av aktive luftveis komplekser. Mitokondrie RNA transkriberes som lange, polycistronic forløper transkripsjoner som er senere behandlet for å frigjøre enkelt rRNAs og mRNA. Derfor vurderte vi COX II å være en markør for mitokondrie transkripsjon aktivitet og COX IV til å være en markør for atom bidrag til respirasjonskjede modulasjon.
Økt uttrykk av begge underenhetene i forstummet celler sammenlignet med kontrollceller ble observert ved hjelp av real-time PCR (fig. 4C). For å bekrefte at den VDR negativt påvirket COX transkripsjon, behandlet vi villtype HaCaT-celler med vitamin D og observert at nivåene av alle transkripter ble redusert (fig. 4D). Gitt det faktum at transkripsjon av subenheten IV er kjernefysisk, mens det av subenheten II kodes for av mitokondrie DNA (mtDNA), konkluderte vi at vitamin D transkripsjonen kontroll utøves på begge nivåer, noe som ikke er overraskende gitt det faktum at kjernefysisk og mitokondrielle transkripsjon av respiratoriske kjeden proteiner er finjustert [20].
på grunn av at modulering av mitokondriell transkripsjon av VDR ikke tidligere har vært beskrevet, vurderte vi muligheten for direkte binding av reseptoren til mtDNA.
In silico
analyse ble utført med sikte på screening mtDNA for å identifisere vitamin D-responsive element (VDRE) områder. Vi brukte en VDRE-sekvens representert ved en samling av posisjon vekt matriser (som beskrevet i metodedelen og vist i tabell S1B) for å beregne affiniteten til VDR for mtDNA-sekvensen. Bare to VDRE steder ble funnet å ha høy affinitet cutoffs (89% og 82% av maksimal poengsum) og begge ble plassert i forskyvning loop (D-loop), en non-koding og regulatoriske regionen. Vi har også identifisert totalt 40 VDRE områder med lav affinitet score ( 60% av maksimal) gruppert i noen regioner (se tabell 1 for en beskrivelse av de høyere affinitet VDRE nettsider og S1A bord for fullstendig liste). I noen tilfeller er disse VDRE områdene dannet av flere gjentakelser, noe som indikerer en betydelig tilstedeværelse av bindingssetene i disse regionene. Av notatet, ble de aller fleste VDRE nettsider finner på baksiden strand, noe som sannsynligvis skyldes den skjevheten i mtDNA nucleotide distribusjon. I tillegg ble det lave affinitet anriket på hypervariabel segment 1 (p = 0,01425). Den høye affinitet av de identifiserte områdene VDRE åpner for muligheten for VDR-mediert direkte transkripsjonen kontroll av mtDNA. Videre studier er planlagt for å undersøke hva som kjennetegner denne bindingen.
Den økte membranpotensialet som ble observert i forstummet celler, kombinert med indusert ekspresjon av COX transkripsjoner, viste at luft kjeden ble forsterkes i dempede HaCaT-celler.
Tatt sammen, våre resultater indikerer at VDR spiller en rolle i den negative modulering av respiratoriske kjede ekspresjon og respiratoriske aktivitet, noe som både moderate membranpotensialet, og er beskyttende mot oksidativt stress.
VDR lyddemping minimerer acetyl-CoA utnyttelse i biosyntetiske veier
i et forsøk på å knytte redusert cellevekst og økt mitokondrie potensialet som ble observert i VDR slå ned celler, vi hypotese at intens aktivitet i luft kjeden stimulerer TCA syklus i dempede celler. I hvilende celler, den grunnleggende funksjonen til mitokondriene er å frembringe ATP via en TCA-syklus-mater elektrontransportkjeden og oksidativ fosforylering for å levere energi til en rekke cellulære funksjoner; i motsetning til kreftceller ikke er sterkt avhengig av OXPHOS for sine energibehov og re-direkte TCA syklus mellom å bevare sin biosyntetiske funksjon. Således, i prolifererende celler, mitokondrielle trasé rewired å understøtte proliferasjon.
Våre data antydet at VDR, redusere de metabolske kravene til den respiratoriske kjeden, kan omprogrammere TCA-syklus, og dets mellomprodukter kan anvendes i biosyntetiske prosesser . For å teste denne hypotesen, analyserte vi biosyntetiske reaksjonsveier avhengig av acetyl-CoA avledet fra mitokondrie-katabolisme. Først vurderte vi produkter av mevalonat cascade, nemlig kolesterol, ubiquinone og isoprenic enheter essensielle for posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner. Kolesterol og ubiquinone
de novo
syntese ble målt i HaCaT celler. Kontroll og VDR knock down-celler ble merket med [
3H] acetat og lipidinnholdet av cellene ble analysert ved hjelp av TLC. VDR stanse redusert
de novo
syntesen av kolesterol (fig. 5A), mens ubiquinone biosyntetiske hastigheten var upåvirket av stanse (fig. 5B). Syntesen av isoprenic heter ble målt som prenylation status av to små GTPases: RhoA og Ras. VDR stanse resulterte i redusert prenylation av både proteiner, mens deres generelle uttrykk forble uendret (fig. 5C).
HaCaT celler ble infisert med shRNA kontroll eller VDR shRNA 3 og biosyntetiske banene ble undersøkt sju dager etter smitte. Den mevalonate veien ble vurdert som
de novo
syntesen av kolesterol (A) og ubiquinone (B). Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) isoprenoid-enheter som er produsert av den samme bane ble analysert som prenyl-del inkorporering i små GTPases RhoA og Ras. Kontroll og dempede cellene ble høstet og lysatene ble underkastet TX-114 fase-ekstraksjon for å separere de prenylated former. Total og prenylated proteiner ble analysert ved hjelp av western-blotting. VDAC og aktin uttrykk viste tilsvarende protein lasting av hydrofobe fase og totale ekstrakter, henholdsvis. (D) histon acetylering nivåer ble evaluert ved western-blotting-analyse ved anvendelse av et anti-acetyl H4-antistoff og tubulin som en lasting kontroll. Blottene er representative for et sett med tre uavhengige eksperimenter.
Til slutt ble tilgjengeligheten av acetyl-enheter for biosyntetiske formål evaluert som histon acetylering og VDR lyddemping også redusert denne prosess, som ble målt som histon H4 acetylering (fig. 5D).
Sammen er disse observasjonene tyder på at ved VDR stanse, oksiderer den økte luft kjeden aktivitet metabolske mellomprodukter, hindrer deres utnyttelse i biosyntetiske veier. Vi demonstrerte eksemplarisk avledning av acetyl-CoA, inkorporering av som er redusert i løpet av kolesterol biosyntese, prenylation hendelser og histon ombygging.
Diskusjoner
Vårt tidligere arbeid i HaCaT celler demonstrerte VDR mitokondrie lokalisering og mekanismen for import. I denne studien identifiserte vi en slående ny viktig rolle for reseptoren i organfunksjon og cellenes stoffskifte fordi vi demonstrert at VDR aktivitet dypt påvirker spredning.
MITOKONDRIELLE funksjoner har tidligere blitt beskrevet for andre steroidreseptorer, flere av hvilken stimulere mitokondriell respirasjon og er derfor ansett å være enten differensierende hormonreseptorer (dvs., skjoldbrusk-reseptoren, estrogen receptor beta og androgen reseptor) eller energi- utgifter enhancere og leverandører (dvs. glukokortikoidreseptoren) [17], [21], [22]. Hormonell stimulus påvirker transkripsjonen av mitochondrially kodet OXPHOS både indirekte, ved å fremkalle atom signaler (for eksempel mitokondrielle transkripsjonsfaktorer som positivt regulerer transkripsjon av mitokondrie genomet), og direkte, ved å lokalisere i organeller og samspill med responselementer i mitokondrielt DNA [ ,,,0],23]. Til dags dato, VDR funksjon i mitokondriene forblir uncharacterized.
I denne studien har vi vist at VDR fremmer spredning, som sin stanse sterkt påvirker vekst på HaCaT og andre kreftcellelinjer som uttrykker en mitokondrie VDR. Starter med tidligere karakteriserte HaCaT celler og utvide vår analyse til andre cellemodeller, fant vi at mitokondrie lokalisering av reseptor er en utbredt karakteristisk for prolifererende celler, og foreningen av VDR med spredning ble forsterket av resultatene av vår analyse av differensiert celler. Vi observerte reduserte mitokondrie VDR nivåer i to forskjellige modeller av differensierte celler (primærkulturer av keratinocytter representerer fysiologiske differensiering, mens MIR-206-indusert RD18 celler representerer en miRNA-drevet differensiert tilstand). Etter vår mening er dette en interessant observasjon som garanterer videre etterforskning av metabolsk effekt og molekylære mekanismer som styrer VDR downregulation i hvilende celler.
Forrige litteraturen beskrev de unike egenskapene til vitamin D, som tradisjonelt formidlet av kjernefysiske virkninger av VDR på transkripsjon. Imidlertid kreftceller er ofte motstandsdyktige mot de antiproliferative og differensierende egenskaper av vitamin D, som et resultat av den økte assosiasjon av VDR med corepressors på Kromatin [24]. Dette har blitt rapportert for hudkreft, blant de andre [25]. Den humane prolifererende keratinocytt cellelinje HaCaT reagerer ikke den antiproliferative virkningen av vitamin D (S1 fig.), Og vi tidligere har demonstrert at atomtranslokasjon av VDR, noe som er en forutsetning for transkripsjonen aktivitet, ikke er indusert ved ligand stimulering [12 ], og indikerer således ineffektive, eller svake, nukleær VDR signalisering i disse cellene. Derfor HaCaT celler representerer en god modell som kan brukes til å undersøke mitokondrie effektene av VDR aktivitet i bakgrunn var de unike egenskapene til vitamin D har gått tapt.
Genetisk stanse av VDR i HaCaT celler produsert to effektene som var knyttet: redusert spredning som tilsvarte en økning i respiratorisk kjede ekspresjon og mitokondrielle membranpotensiale. Vi hadde bevis for at VDR balanserer elektron kjeden aktivitet, noe som resulterer i to fordeler for cellen: beskyttelse mot oksidativt stress og støtte for spredning gjennom lett tilgjengelig biosyntetiske mellomprodukter. Den tidligere konklusjonen ble nådd når vi observert økt sårbarhet dempede celler til en sterk oksydativ fornærmelse, ledsaget av en redusert intracellulær GSH bassenget. Sistnevnte tolkning, den andre store funn av vårt arbeid, ble foreslått ved eksperimenter som tar sikte på å evaluere den biosyntetiske kapasitet av dempede HaCaT-celler. Vi analyserte ulike biosyntetiske veier som er avhengige av acetyl-CoA mitokondriell opprinnelse. Acetyl-CoA er et viktig byggesten for den endogene biosyntesen av fettsyrer og kolesterol, og er involvert i isoprenoid-baserte proteinmodifiseringer; acetyl-CoA er også nødvendig for acetylering reaksjoner som modifiserer proteiner, slik som histon acetylering. Vi fant at VDR knock down-celler viste en innskrenket biosyntetisk rate av mevalonat reaksjonsveien, målt som redusert produksjon av kolesterol og prenyl-molekyler som skal anvendes i proteinmodifisering. Vi utelukket at det i våre eksperimenter var vi å slette positiv modulering av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A (HMG-CoA) reduktase, nøkkelenzymet i mevalonat kaskade fordi nivåene av ett av produktene fra reaksjonsveien, ubikinon (Coq), ble ikke påvirket av VDR lyddemping. I stedet tilskrevet vi hemmet biosyntetiske hastighet til redusert acetyl-CoA tilgjengelighet, og denne muligheten ble validert av observasjon at VDR lyddemping også avtatt histone acetylering. Den ufølsomhet av ubikinon syntese til en reduksjon i acetyl-CoA nivåer, noe som er kritisk for andre lipider, kan skyldes forskjeller i Km verdiene av gren-punkts enzymer i reaksjonsveien mevalonat. Prinsippet for den klassiske strømnings avledning hypotese indikerer at variasjoner i størrelse av forløperen bassenget vil først og fremst påvirke kolesterol syntese fordi Km av squalensyntase for dets substrat er høy, mens alle de andre gren-punkts enzymer som oppviser lave Km-verdier og den hastighetsbegrensende enzymer av coq biosyntetiske gren kan ha de laveste Km verdier. Dessverre, den fullstendige detaljer om Coq syntese i animalsk vev gjenstår å bli belyst.
Vi konkluderte med at VDR, ved å holde mitokondrie respiratorisk aktivitet, reservedeler mitokondrielle metabolske mellomprodukter, som kan avledes fra oksideringsmetabolisme mot en biosyntetisk skjebne . Sluttproduktene som ble funnet å være påvirket av denne bryteren i denne studien er avgjørende for spredning; spesielt kolesterol, som kontinuerlig blir innlemmet i membraner, og flere rapporter indikerer at kolesterol-er vesentlig forhøyet i forskjellige kreftceller [26] – [28]. I tillegg er prenylation en post-translasjonell modifikasjon av flere små GTPases og er avgjørende for dokking og aktivitet av disse enzymer; hindrer GTPase aktivitet forstyrrer spredning, som har blitt grundig rapportert for de to små GTPases som ble analysert i denne studien, RhoA og Ras, den prenylation som er nødvendig for deres evne til å indusere malign transformasjon, invasjon og metastasering [29] . Endelig er histon acetylering status et viktig aspekt ved spredning, fordi den representerer et epigenetisk strategi for kontroll av kromatin remodeling. follows:
5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,
5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,
