Abstract
Bakgrunn
FoxM1 har blitt rapportert å være viktig i initiering og progresjon av ulike svulster. Men om FoxM1 har noen indikasjon for prognosen i ikke-småcellet lungekreft pasienter er fortsatt uklart.
Metodikk /hovedfunnene
I denne studien FoxM1 uttrykk i tumorceller ble undersøkt først ved immunhistokjemi i 175 NSCLC-prøver, og resultatet av dette viste at FoxM1 overekspresjon var signifikant assosiert med positiv røkere (P = 0,001), dårligere vev differensiering (P = 0,0052), høyere TNM trinn (P 0,0001), lymfeknutemetastase (P 0,0001), avansert tumor stadium (P 0,0001), og dårligere prognose (P 0,0001). Multivariabel analyse viste at FoxM1 uttrykk økt fare for død (hazard ratio, 1,899; 95% CI, 1,016 til 3,551). Videre, ved ulike
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter, viste vi at målrettet knockdown av FoxM1 uttrykk kan hemme trekk og invasive evner NSCLC celler, mens håndheves uttrykk for FoxM1 kunne økt invasjon og migrering av NSCLC-celler. Til slutt fant vi ut at en av de cellulære mekanismene som FoxM1 fremmer metastase er gjennom å indusere epitelial-mesenchymale overgang (EMT) program.
Konklusjoner
Disse resultatene antydet at FoxM1 overekspresjon i tumorvev er signifikant assosiert med dårlig prognose av NSCLC pasienter gjennom å fremme metastase
Citation. Xu N, Jia D, Chen W, Wang H, Liu F, Ge H, et al. (2013) FoxM1 er assosiert med dårlig prognose av ikke-småcellet lungekreft pasienter gjennom å fremme tumormetastaser. PLoS ONE 8 (3): e59412. doi: 10,1371 /journal.pone.0059412
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 18. august 2012; Godkjent: 14 februar 2013; Publisert: 25 mars 2013
Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Shanghai Leading akademisk disiplin Project, prosjektnummer B115 og China National «985» -prosjektet (fase III). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft har vært den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis i flere år. Den dårlig prognose for lungekreft hovedsakelig på grunn av små symptomer på et tidlig stadium, og når diagnostisert, tumorceller har alltid spredning til andre organer [1]. Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er betydelig i tumorcellemetastase og karakterisert ved oppløsningen av intercellulære overganger gjennom internalisering og nedregulering av forskjellige proteiner som er tilstede i tett veikryss, såsom zonula okkludens (ZO) -1, og adherens kryss, slik som E-cadherin [2], [3].
gaffelhodeboks M1 (FoxM1), et medlem av Fox familien av transkripsjonsfaktorer, har vist seg å være avgjørende for cellesyklusprogresjon og er en viktig cellesyklus-regulator kontrollerende overgang fra G1 til S-fasen, så vel som trer i og komplettering av mitosen [4]. Det har blitt rapportert å være overuttrykt i mange tumorer, inkludert lunge-, lever- og brystkreft [8], [9], [10], [11], [12], [13], og spilt en vesentlig rolle i utvikling og progresjon i forskjellige maligniteter [11], [14], [15], [16]. Nylig FoxM1 ble rapportert å kjøre hepatisk fibrose og metastase i HCC [17], og det er godt dokumentert at pinnsvin-signalveien ble aktivert i NSCLCs, og flere molekyler som er involvert i denne veien, inkludert PTCH1, SMO, GLI1, ble observert til å korrelere med flere prognostiske parametre av NSCLCs. Spesielt, disse molekylene ble også observert å korrelere med den økte ekspresjon av FoxM1 [18]. Men om FoxM1 kunne utøve en direkte effekt på prognosen for NSCLCs pasienter er ikke avklart. Yang og kolleger nylig rapportert at FoxM1 overekspresjon korrelert med dårlig overlevelse av pasienter som bruker immunhistokjemi analyser av 69 tilfeller av plateepitelkarsinom prøvene [19]. Imidlertid har prognostisk rolle FoxM1 uttrykk i andre typer NSCLCs ikke fastslått. Liu et al. fant at uttrykket status for FoxM1 i NSCLC er en uavhengig prognostisk faktor og negativt korrelert med prognosen., men deres studie fant ingen sammenheng mellom FoxM1 uttrykk og andre kritiske kliniske parametre [20]. I mellomtiden, alle studiene ovenfor ikke demonstrere de potensielle underliggende mekanismer. I vår forrige undersøkelse, har vi vist at FoxM1 fremmet
in vitro
metastatisk evne småcellet lungekreft [21]. I denne studien har vi som mål å bestemme prognostiske roller FoxM1 overekspresjon i NSCLCs og videre utforske den mekanismen som FoxM1 kunne bidra til metastasering av NSCLCs.
Resultater
Pasient Kjennetegn og relasjoner mellom FoxM1 Expression og Clinicopathologic kjennetegn
clinicopathologic kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell S1. De overordnede oppfølgings varighet varierte fra 1 til 84 måneder (median, 42 måneder). For å undersøke om økt uttrykk av FoxM1 ble forbundet med ulike prognostiske faktorer ble pasientene deles inn i to grupper i form av immunhistokjemisk farging for FoxM1 (Figur 1A, a-d): negativ /svakt uttrykk og sterke uttrykk. Som vist i Tabell S2, hos pasienter med lymfeknutemetastaser (figur 1A, e) hadde en vesentlig høyere ekspresjon av FoxM1 sammenlignet med de pasienter uten lymfeknutemetastase (figur 1A, f) (P 0,0001). I mellomtiden ble sterkere FoxM1 uttrykk korrelert med positive røykestatus (P = 0,001), dårligere differensiering (P = 0,0209), avansert tumor stadium (P 0,0001) og høyere TNM stadier (P 0,0001), mens ingen vesentlig forskjell ble observert i pasientenes alder, kjønn og histologi ved diagnosetidspunktet mellom høye og lave nivåer av FoxM1
(A) Representative resultatene av FoxM1 flekker i NSCLC tumorvev analysert ved immunhistokjemi (a, negativ, b., svak; c, moderat, d, intens, henholdsvis). Representative resultatene av FoxM1 uttrykk nivåer mellom lymfeknute positive (e) og lymfeknute negative (f) (a-f, venstre, forstørrelse: × 100, høyre, forstørrelse: × 400). (B) samlet overlevelse analyser for alle pasienter (a), pasienter med stadium I /II (b), og pasienter med stadium III /IV (c) i henhold til resultatene av immunhistokjemisk analyse. Den log-rank test ble brukt for å teste de to overlevelse distribusjoner. P 0,05 ble ansett for å ha statistisk signifikans
FoxM1 Expression positivt korrelert med tumorprogresjon og dårlig overlevelse av ikke-småcellet lungekreft pasienter
Først total overlevelse analyse ble brukt. for å undersøke korrelasjonen mellom FoxM1 uttrykk og prognose. Prognosen for pasienter med en sterk svulst uttrykk for FoxM1 var vesentlig dårligere enn for pasienter med en negativ eller svak svulst FoxM1 uttrykk (P 0,0001) (Figure1B, a). I videre analyser, ble FoxM1 uttrykk forbundet med dårligere overlevelsen hos pasienter med stadium I /II kreft (P = 0,049) (figur 1 B, b) og for pasienter med stadium III /IV kreft (P = 0,095) (figur 1 B, c) , selv om resultatet av trinn III /IV nådde ikke signifikans. En univariat analyse viste at tumorstadium (P 0,0001), lymfeknutestatus (P 0,0001), TNM stadium (P 0,0001) og FoxM1 uttrykk (P 0,0001), spådde hvert en betydelig dårligere prognose i NSCLC pasienter (tabell 1 ). Den kliniske prognose ble imidlertid ikke assosiert med alder, kjønn, røykestatus, histologi og differensiering.
I tillegg ble en Cox modellen brukes til å anslå effekten av FoxM1 uttrykk på overlevelse. Den rå hazard ratio (HR) i FoxM1 sterkt uttrykk sammenlignet med FoxM1 negativ eller svak uttrykk var 1,899 (95% CI, 1,016 til 3,551, P 0,05), noe som indikerte at sterk FoxM1 status økt fare for lungekreft dødsfall med nesten to ganger så stor som negativ eller svak FoxM1 status. Med multivariabel analyse, FoxM1 uttrykk, lymfeknutemetastase og alder var signifikant assosiert med overlevelse (tabell 2). Disse funnene tyder på at FoxM1 synes å være en uavhengig og sterk prediktor for dårligere overlevelse.
Målrettet knockdown av FoxM1 Expression hemmet
in vitro
Metastatisk Potentials av NSCLC Cells
resultatene ovenfor viser at høy FoxM1 uttrykk var assosiert med dårlig prognose av NSCLC pasienter, men de underliggende mekanismene fortsatt uklare. I vår tidligere studie har vi vist at FoxM1 kan mediere proliferasjon av SCLC-cellelinjer, som kan være forbundet med den avanserte tumorstadium [21]. Men rollene FoxM1 uttrykk i NSCLC celle migrasjon og invasjon er i stor grad ukjent. Derfor, for å finne ut om FoxM1 formidler prognose i lungekreft gjennom å fremme metastaser, søkte vi lenti-virus transduksjon å slå ned FoxM1 uttrykk på trekkfugl og invasiv evne H1299 og PC-9 celler (Figur 2A og B). Resultatene antydet at avbrudd av FoxM1 uttrykk kan hemme trekk og invasive evner av NSCLC celler ved trans-vel migrasjon analysen (Figur 2C og D). Videre har vi også funnet at i forskjellige to cellelinjer, kan knockdown av FoxM1 ekspresjon signifikant hemme proliferasjonen hastighet ved 48 og 72 timer (figur S1A), og overekspresjon av FoxM1 fremmes tumor proliferasjon etter 72 timer i nakne mus (figur S1B), alle som var i tråd med våre tidligere resultater.
(A, B) påvisning av lentivirus-mediert knockdown av FoxM1 i PC-9 og H1299 celler ved henholdsvis WB og q-PCR,. (C, D) En representant resultat av trans-brønn migrasjon analyser for virkningene av FoxM1 på
in vitro
trekkende og invasive evnene til PC-9 og H1299 celler. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD, *
p
. 0,05
Tvangs Uttrykk for FoxM1 Økt
in vitro Hotell og
i vivo
Metastatisk evnene til NSCLC Cells
for å bevise rolle i NSCLC metastaser videre, vi stabilt overexpressed FoxM1 uttrykk i PC-9 og H292 cellelinjer (figur 3A og B). Først ved bruk av Trans-brønns analyser viste vi at overekspresjon av FoxM1 kunne gi en betydelig økning de trekkende og invasive potensialer av NSCLC celler (Figur 3C og D). For å bekrefte rollen FoxM1 i metastasering av ikke-småcellet lungekreft videre, har vi utviklet en musemodell ved halevenen injeksjon av PC-9 FoxM1 overekspresjon (PC-9-FoxM1) og kontroll (PC-9-Vector) celler . Fem uker etter celle inokulering, ble musene ofret for å oppnå i lungene (figur 4A), og overvåket ved fluorescens avbildning, og resultatene av disse viste at PC-9-FoxM1 celler viste mye sterkere fluorescens-signaler i lungene enn for kontrollceller ( Figur 4B). Videre histologisk undersøkelse viste at antallet av metastatiske noduler i lungene av FoxM1 overekspresjon gruppe var signifikant høyere enn i kontrollgruppen (figur 4C og D). Samlet utgjør disse funnene støtter hypotesen om at FoxM1 spiller en viktig rolle i tumormetastaser fra NSCLC.
(A, B) Påvisning av lentivirus-mediert overekspresjon av FoxM1 i PC-9 og H292 celler ved WB og q-PCR, respektivt. (C, D) En representant resultat av trans-brønn migrasjon analyser for virkningene av FoxM1 på
in vitro
trekkende og invasive evnene til PC-9 og H292-celler. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD, *
p
. 0,05
(A, B) Visuell inspeksjon og fluorescens bildebehandling analyse av lungemetastatiske knuter i to grupper ( PC-9-vektor og PC-9-FoxM1) av musemodeller ved haleveneinjeksjon av tumorceller, respektivt. (C) Virkningene av
FoxM1
på
in vivo
metastatiske evner av PC-9 celler i xenograft modeller av nakne mus (n = 6) som bestemmes ved undersøkelse av mus lungene for mikroskopisk knuter. Representative resultatene av histologisk undersøkelse av mus lungene for metastatiske knuter (til venstre). Antall lungemetastatiske noudels i to grupper av musemodeller (til høyre). Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD, *
p
. 0,05
FoxM1 Induced epitel-mesenchymale Overgang av NSCLC celler og Tumor vevsprøver
Vi har videre observert celler med høy FoxM1 uttrykk, som ble funnet å ha fenotypiske forandringer som minner om EMT. Som vist i figur 5A, ble det observert klare morfologiske forskjeller mellom den H292-FoxM1 cellelinje og dens foreldre H292-vektor cellelinje i cellekultur. Mens H292 celler er mangekantet og vokser i klynger, H292-FoxM1 celler er langstrakt og spindel-formet, og vokse i en spredning mønster til samløpet. For ytterligere å undersøke mekanismene forbundet med den økte metastasepotensialet, testet vi noen viktige faktorer assosiert med EMT, som fremmer metastase i karsinomer. Vi fant at H292-celler som uttrykte FoxM1 lavere mRNA og proteinnivåene av E-cadherin og ZO-1 mens erholdt høyere mRNA og proteinnivåene av mesenchymale markører, som vimentin og N-cadherin (figur 5B og C). Slug er en transkripsjon repressor, som er potent induser av EMT. Vi har observert økt Slug uttrykk i FoxM1-overekspresjon celler (Figur 5D). Våre observasjoner tyder på at FoxM1 induserer metastaser gjennom EMT
(A) Representative fase kontrast til H292-vektor og H292-FoxM1 celler. (Forstørrelse: 200 ×). (B) kvantitative real-time PCR-analyse av den relative uttrykk for EMT markører som angitt. GADPH ble brukt som lasting kontroll. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± s.d, *
p
. 0,05. (C) Den relative uttrykk for EMT markører som indikert ble bestemt ved immuno (til venstre), og resultatene av disse var målbart (til høyre). β-actin fungert som en lasting kontroll. (D) Den relative uttrykk for Slug som indikert ble bestemt ved immunoblotting (til venstre), og resultatene av disse var målbart (til høyre). β-actin fungert som en lasting kontroll.
For ytterligere å demonstrere forholdet mellom FoxM1 uttrykk og EMT markører, ble immunhistokjemi flekker utført for E-cadherin, vimentin og Slug i svulster prøver. I menneskelige lungekreft prøver, økt vimentin og slug uttrykk og redusert E-cadherin uttrykk ble funnet i grupper med høy FoxM1 uttrykk, mens redusert vimentin og Slug uttrykk og økt E-cadherin uttrykk i gruppene med lav FoxM1 uttrykk (Figur 6A) . Videre har vi etablert subkutane solide tumormodeller. Etter 4 uker med injeksjon av PC-9-FoxM1 og PC-9-vektor celler, ble solide tumorer høstet, innebygd i paraffarin og farget for EMT markører. Som vist på figur 6B, sammenlignet med tumorer avledet fra PC-9-vektor-celler, tumorer avledet fra PC-9-FoxM1-celler viste økt ekspresjon av vimentin og Slug og redusert ekspresjon av E-cadherin (figur 6B). Våre observasjoner i morfologiske og molekylære endringer foreslår at FoxM1 overekspresjon induserer en EMT-lignende fenotype gjennom oppregulering av Slug i NSCLC celler.
(A) Den relative uttrykk for E-cadherin, vimentin og Slug som angitt ble bestemmes ved immunhistokjemisk farging i humane tumorprøver med høy (over) og lav (under) FoxM1 uttrykk. (B) Den relative ekspresjon av E-cadherin, vimentin og Slug som er angitt ble bestemt ved immunhistokjemisk farging i nakne mus-svulster avledet fra PC-9-vektor-celler (ovenfor) og PC-9-FoxM1 celler (nedenfor).
Diskusjoner
i denne studien, vurderte vi uttrykket nivåer av FoxM1 bruker IHC flekker i en kohort av 175 kinesiske NSCLC pasienter og for første gang vist at forhøyet uttrykk for FoxM1 var korrelert med flere clinicopathological faktorer og spådd en ugunstig prognose hos NSCLC pasienter, inkludert SCC og AC. Videre fant vi at dereguleringen av FoxM1 uttrykk var signifikant assosiert med høyere metastatiske egenskaper gjennom å fremkalle EMT.
Med tanke på rollen FoxM1 i tumorcellevekst, har noen studier evaluert muligheten for FoxM1 uttrykk som en biomarkør å forutsi den kliniske utfallet av NSCLC pasienter. Yang et al fant at FoxM1 beslektet med kliniske faktorer og spiller avgjørende rolle i prognosen i 69 pasienter med SCC, ikke inkludert AC. og Liu et al vise at FoxM1 kan være en faktor for prognose i 68 NSCLC, inkludert 37 AC og 19 SCC, men forholdet mellom FoxM1 ekspresjon og andre clinicoparameters ble testet med ingen sammenheng. Disse paradoksale resultatene kan skyldes deres ulike studiepopulasjonen, liten utvalgsstørrelse og variert kliniske datakvalitet. I vår studie fant vi at FoxM1 uttrykk i tumor prøven ble positivt assosiert med flere clinicopathological parametere, slik som TNM stadium, tumorstadium og lymfeknutemetastase. Videre ble høyere FoxM1 ekspresjon korrelerte med en dårlig prognose av NSCLC. Resultatene indikerte at FoxM1 var relatert med NSCLC progresjon og prognose. Men, underliggende mekanismer må videre utforsket.
metastaser innebærer en rekke kompliserte trinn [22], inkludert redusert vedheft, økt bevegelighet, celle vedlegg, matrix oppløsning, og migrasjon [23]. Under tumorprogresjon, kreftceller gjennomgå dramatiske endringer i cytoskeletal organisasjon til å vedta invasiv fenotype og til slutt metastaserer til andre organer. EMT er en viktig prosess i tumormetastase [24], [25], [26], som assosiert med redusert celleoverflate-ekspresjon av E-cadherin, økt N-cadherin [27], [28] og endret ekspresjon av flere cytomegalovirus -skeletal proteiner, spiller en betydelig rolle i forhold til den vandrende aktiviteten av tumorceller [29].
Våre data viser at inhibering av FoxM1 kunne undertrykke metastaserende evne, mens oppregulert ekspresjonsnivå av FoxM1 i lungekreft celler forbedret trekk og invasive egenskaper in vitro og in vivo. Nivåer av E-cadherin, ZO-1 ble forhøyet og vimentin, N-cadherin ble redusert med høyere FoxM1 uttrykk. Også FoxM1 regulert Slug uttrykk, som er den induserer EMT. Disse resultatene antydet at FoxM1 var assosiert med prognosen ved å fremme metastasering av svulster cellene gjennom å fremkalle EMT. Hyun JP et al. viste også at i HCC, kunne FoxM1 aktivere Akt-Snail1 sti og involvere i EMT overgang [17]. Dessuten er det noen andre studier indikerte at MMP har dukket opp som sentrale faktorer i både lokal vekst og fjernmetastaser i tumorer [30], [31], og FoxM1 kan også regulere MMP å fremme OSCLC metastaser. Tatt sammen, kan FoxM1 spiller flere viktige funksjoner i tumorceller. Dens komplett rolle i vei om metastaser worths videre undersøkelse.
I sammendraget, våre funn tyder på at FoxM1 oppregulering kan ha effekt på NSCLC prognose og progresjon. Vi viste at FoxM1 overekspresjon var relatert til redusert total overlevelse og rask tumorprogresjon hos NSCLC pasienter. Videre overekspresjon av FoxM1 kan øke trekk og invasive evner av NSCLC celler. Disse resultater antyder at den FoxM1 uttrykket er kritisk for invasivitet av maligne NSCLC-celler, og denne effekten var i det minste delvis gjennom epithelial- mechenmychal overgang. Derfor vår observasjon gjør FoxM1 et attraktivt mål for lungekreft terapi, og kan brukes som en biomarkør for å forutsi prognosen.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Menneske deltakere involvert i denne forskningen, forutsatt at skriftlig informert samtykke i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Medisinsk etikk og menneske Clinical Trial Utvalget ved Zhongshan Hospital, Fudan University har godkjent denne studien samt samtykke prosedyre (Permit Number: 2011-221). Alle dyr protokoller ble godkjent av etisk komité for dyreforsøk ved University of Fudan Animal Care Committee, Shanghai, Kina (Permit Number: SYXK: 2008-0039). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
Pasienter og tumorprøver
Det er totalt 232 histologisk bekreftet NSCLC pasienter ble fortløpende rekruttert mellom januar 2005 og februar 2008 for behandling av ikke-småcellet cancer (NSCLC) ved Zhongshan Hospital, Fudan University. Fire pasienter ble ekskludert dersom de tidligere har fått strålebehandling og /eller kjemoterapi. Chest X-ray og CT ble utført for alle pasienter før operasjon. Det er 142 pasienter gjennomgikk kurativ kirurgisk reseksjon. Kjemoterapi med cisplatin et basert regime ble anvendt for de fleste pasienter med høy trinn (inkludert IIIB og IV) eller med høy risiko for tilbakefall og metastasering i henhold til behandling retningslinje for NSCLC på det kirurgiske tiden. For denne studien ble 53 pasienter ekskludert fra analysen, inkludert 38 pasienter med dårlig kvalitet og /eller kvantitet av vevsprøver, 11 pasienter med ufullstendige kliniske data og 4 pasienter døde av andre årsaker opprinnelig ble ekskludert fra analysen. Til slutt ble totalt 175 pasienter inkludert i denne studien (tabell S1). I alt 122 menn og 53 kvinner ble inkludert, inkludert 97 røykere og 78 ikke-røykere, med aldre, fra 30 til 77 år, hvorav 89 var mindre enn 55 år gammel. Det var 76 trinn I, 23 trinn II, 51 stadium III og 25 scene IV sykdommer, inkludert 91 pasienter uten lymfeknutemetastaser og 84patients med lymfeknutemetastase. Det var 36 pasienter med tumor i stadium 1, 75 med trinn 2, 25 med stadium 3 og 39 med stadium 4 og 118 pasienter med adenokarsinom (AC), mens 57 med plateepitelkarsinom (SCC). I form av differensiering, var det 93 pasienter med godt og moderat differensiering og 82 med dårlig differensiering. Totalt 74 pasienter var i live ved slutten av oppfølgingen, 101 pasienter døde av lungekreft, og pasienter døde av andre årsaker eller tapt for oppfølging ble ekskludert fra studien.
Clinicopathological informasjon for hver pasient, inkludert kjønn, alder, røykestatus, tumor stadium, lymfeknutestatus, TNM stadium, histologisk grad og total overlevelse, ble hentet retrospektivt fra kliniske poster og patologiske rapporter. Overlevelse ble definert som varigheten fra datoen for diagnose til dato for død eller slutten av oppfølgingen. TNM status ble bestemt i henhold til den syvende utgaven staging system for NSCLC [32].
Immunohischemistry analysen
Et antistoff mot FoxM1 (Sigma Aldrich Inc., MO, USA) og en standard immunhistokjemisk teknikk som ble anvendt for å detektere ekspresjon FoxM1 som tidligere beskrevet [19], [20]. FoxM1 ble observert i cytoplasma eller cytoplasmisk og atom av cellene. Farging ble utredet i fem kraftige felt på 200 × forstørrelse. Fargingen resultatet ble inndelt i fire grupper som negativ = 0, svak = 1, middels = 2 og intens = 3 [20]. Den prosentvise areal farging positiv ble inndelt i fire grupper: mindre enn 25% tumorceller positiv = 0; 25% til 50% tumorcellene positive = 1; 50% til 75% tumorcellene positive = 2; mer enn 75% tumorcellene positive = 3. Merkings poengsum ble bestemt ved å multiplisere intensitet ved den prosentvise areal farging positiv, som skårer som 0, 1, 2, 3, 4, 6 og 9.The farging resultatet ble inndelt i to grupper som svak /negativ farging (poengsum 4) og sterk farging (poengsum ≥4). Denne terskelen ble bestemt ved visuelt å bestemme en klar positiv flekk understøttet av histogrammer av omfanget av score [20], [33], [34]. Den høyeste merking poengsum blant de tre vevsdelene ble inngått for statistiske analyser. Patologene som utførte den immunhistokjemiske vurdering av FoxM1 ble blindet for pasientens histopathologic og oppfølgingsdata.
Epidemiologiske og kliniske data Collection
Pasient demografiske parametre og røyking historie ble oppnådd gjennom -personen intervju på tidspunktet for første besøk, oppfølging i klinikker eller journal gjennomgang. En person som røykte mer enn 100 sigaretter i historien ble definert som en stadig røyker, ellers som aldri røyker [35]. Oppfølging informasjon om pasientens død og overlevelse ble oppdatert 3-måneders intervaller gjennom stedet intervju, direkte kall, eller medisinsk diagram gjennomgang. Den siste oppfølging i denne studien ble utført på mai 2012.
cellelinjer, cellekultur og kjemoterapeutiske Reagenser
Den menneskelige lunge adenokarsinom cellelinje PC-9 og human lungekreft cellelinje NCI-H292, NCI-H1299 ble alle hentet fra Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) [36]. Disse cellene ble dyrket ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone Inc., UT, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble regelmessig sertifisert som fri for Mycoplasma forurensning.
shRNA Eksperimenter
lenti-virus shRNA vektor ble konstruert som beskrevet tidligere [37]. Kort sagt ble FoxM1 og negativ kontroll shRNA subklonet inn i Mlul /Clal steder av en pLVTHM vektor (Addgene) med følgende oligonukleotider henholdsvis: 5′-CGCGTCGGCCGGAACATGACCATC AATTCAAGAGATTGATGGTCATGTTCCGGCTTTTTTCCAT-3’and 5′-CGATGGAAAAAAGCCGGAACATGACCATCAATCTCTTGAATTGATGGTCATGTTCCGGCCGA-3’for FoxM1, og 5 « -CGCGTCGGT AGCGACTAAACACATCAATTCAAGAGATTGATGTGTTTAGTCGCTACTTTTTTCCAT-3’and 5»-CGATGGAAAAAAGTAGCGACTAAAC ACATCAATCTCTTGAATTGATGTGTTTAGTCGCTACCGA-3’for den negative kontrollen. Lenti-virus generering og infeksjon av H1299 og PC-9-celler ble utført som beskrevet ovenfor.
Transduksjon av tumorceller
Plasmid (EX-Z5438-LV135) og lenti-Pac ™ HIV Expression emballasje Kit ble kjøpt fra Gene Copoeia Inc. (Gene Copoeia Inc., Guangzhou, Kina) transductions av H292 og PC-9 celler ble utført i henhold til instruksjoner fra produserer. Stabile transfektanter ble ytterligere bekreftet ved RT-PCR og immunoblotting på grunnlag av deres FoxM1 uttrykk.
tumorcelle migrering og invasjon Assays
Analyser for å måle tumorcellemigrering ble utført i et modifisert Boyden kammer (Transwell, Corning Costar, MA, USA) inneholdende en gelatin-belagt polykarbonat membranfilter (8 um porestørrelse). Bio-Coat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), som rekonstruerer basalmembranen, ble brukt for å vurdere celle invasjon. Graden av tumorcellemigrering og invasjon ble evaluert i henhold til foregående protokoller [38]. Ikke-migrerte celler ble fjernet fra den øvre side av membranen ved skrubbing. Celletelling ble gjennomført ved Coomassieblå farging og cellene ble visualisert under et mikroskop (Leica Inc., Solms, Tyskland) senere.
Animal Experiments
Fire- fem uker gamle BALB /CA naken mus (kjøpt fra Shanghai Institute of Material Medicine, Chinese Academy of Science, Shanghai, Kina) ble opprettholdt under patogenfrie (SPF) betingelser. Den anvendte metode er den samme som den som er beskrevet tidligere for generering av brystkreftmodell [39]. PC-9-FoxM1-celler (2 x 10
6 per mus) som stabilt uttrykker FoxM1 eller vektor ble injisert i halevenen til nakne mus (n = 6). Fem uker senere ble musene avlivet og lungene ble fjernet. Deretter ble disse lunger behandlet for histologisk undersøkelse og overvåket for eventuelle lungetumormetastaser av fluorescens-avbildning [40]. Metastatiske lesjoner ble identifisert ved fluorescens signaler (Night Owl LB 981
In Vivo
Imaging System, Berthold, Tyskland) og analysert ved WinLight32 programvare. For histologisk analyse, ble lungene høstet ved obduksjon og fiksert i 10% formalin. De faste prøver ble deretter innstøpt i parafin, og tre ikke-sekvensiell seriesnitt ble erholdt per dyr. Seksjonene ble farget med H E og analysert for forekomst av metastase
Statistical Analysis
Flere clinicopathological faktorer ble vurdert.. Fishers eksakte test ble brukt for å vurdere sammenhengen mellom clinicopathological variabler og uttrykk for FoxM1. De clinicopathological variablene og ekspresjon av FoxM1 ble tatt hensyn til ved analyse av overlevelse på grunnlag av Kaplan-Meier-metoden; Multivariabel analyse ble utført med Cox regresjonsmodell å undersøke uavhengig prognostisk effekt av FoxM1 på overlevelse ved å justere for konfunderende faktorer. En P-verdi 0,05 ble ansett å være signifikant i alle analyser. SPSS 17.0 ble brukt til å gjøre de statistiske analysene i denne artikkelen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekter av endret FoxM1 uttrykk på proliferasjonsrate
in vitro Hotell og
in vivo
. (A) spredningshastighet FoxM1 av SPC-A-1 sh-FoxM1 (til venstre) og H1299 sh-FoxM1 (høyre) celler. FoxM1 uttrykket ble først stabilt slått ned av lenti-virus infeksjon i SPC-A-1 og H1299 celler. Spredningshastigheter på celler i gruppene transfektert med shRNAs mot FoxM1 (sh-FoxM1) (rød linje) sank betydelig, sammenlignet med shRNA-måls negativ kontroll (sh-NC) (blå linje). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. (B) spredningshastigheten av tumorer avledet fra PC-9-FoxM1cells in vivo. PC-9-vektor og PC-9-FoxM1-celler ble subkutant injisert inn i nakne mus. Den tumordiameter ble målt ved de angitte tidspunkter. Formeringshastigheten av tumorer avledet fra PC-9-FoxM1 celler (blå linje) økt betydelig, sammenlignet med det fra PC-9-vektor-celler (rød linje). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059412.s001 plakater (JPG)
Tabell S1. .
Kjennetegn på pasienter med ikke-småcellet lungekreft
doi: 10,1371 /journal.pone.0059412.s002 plakater (docx)
Tabell S2.
Klinisk profil og korrelasjon mellom clinicopathological funksjoner og uttrykk av FoxM1
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059412.s003 plakater (docx)
Takk
takke Dr. Qun Wang (Institutt for thoracology, Zhongshan Hospital) for å hjelpe oss med oppfølging av pasientene og Dr Deming Han (Institutt for patologi, Zhongshan Hospital) for å hjelpe med å samle inn prøver av ikke-småcellet lungekreft.
