Abstract
Bakgrunn
Pasienter med
KRAS
mutasjoner ikke svare på epidermal vekstfaktor reseptor hemmere (EGFR) og ikke klarer å dra nytte av adjuvant kjemoterapi. Mutasjon analyse av
KRAS
er nødvendig før du starter behandling med monoklonale anti-EGFR-antistoffer hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer (mCRC). Målet med denne studien er å utvikle en multiplex allel-spesifikk PCR (MAS-PCR) analyse for å påvise
KRAS
mutasjoner.
Metoder
Vi utviklet en single-tube MAS-PCR-analyse for påvisning av sju
KRAS
mutasjoner (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D). Vi utførte MAS-PCR-analyse analyse for
KRAS
på DNA isolert fra 270 formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) kolorektal kreft vev. Sekvenser av alle 270 prøver ble bestemt av pyrosekvensering. Sju kjente pek-mutasjon DNA-prøver fortynnet med villtype DNA ble analysert for å bestemme begrensning av deteksjon og reproduserbarhet av MAS-PCR-analyse.
Resultater
Totalt sett resultatene av MAS PCR-analyse var i god samsvar med pyrosekvensering, og bare syv uharmoniske prøvene ble funnet. MAS-PCR-analyse reproduserbart oppdaget 1-2% mutante alleler. De vanligste mutasjonene var G13D i kodon 13 (49,17%), G12D (25,83%) og G12V (12,50%) i kodon 12.
Konklusjon
MAS-PCR-analysen gir en rask , kostnadseffektiv og pålitelig diagnostisk verktøy for nøyaktig påvisning av
KRAS
mutasjoner i rutine FFPE- kolorektal kreft vev
Citation. Seekhuntod S, Thavarungkul P, Chaichanawongsaroj N (2016) Validering av multiplex Allele Spesifikke Polymerase Chain Reaction analyse for påvisning av
KRAS
genmutasjoner i formalinfiksert, parafin Embedded vev fra pasienter med kolorektal kreft. PLoS ONE 11 (1): e0147672. doi: 10,1371 /journal.pone.0147672
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 31 oktober 2015; Godkjent: 06.01.2016; Publisert: 26 januar 2016
Copyright: © 2016 Seekhuntod et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. SS ble støttet av 90-årsdagen for Chulalongkorn University fond (Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, GCUGR1125572134), og NC ble støttet av fakultet for Allied Health Sciences fondet 2014 (AHS-CU 58 004). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den vanligste kreftformen og den tredje største årsaken til kreftdød i verden [1]. I Thailand er CRC den tredje vanligste kreftformen blant menn og den femte mest vanlige blant kvinner [2, 3]. En av de store molekylære reaksjonsveier i CRC utvikling er induksjon av en aktiverende mutasjon i proto-onkogen
KRAS plakater (Kirsten rotte sarkom viral onkogen) [4, 5].
KRAS
genet er et medlem av
RAS
genfamilie og som koder for et 21-kDa RAS-protein, som er et nedstrøms GTP-bindende protein i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) signal transduksjon veien. De onkogene former av
KRAS
mutasjoner konstitutivt uttrykker RAS aktive protein som fører til økt celledeling, celleproliferasjon, forhindring av apoptose prosess, induksjon av angiogenese og metastase økt [6]. Nylig har kreft terapi er utviklet ved hjelp av monoklonale antistoffer, inkludert cetuximab og panitumumab, for å målrette EGFR [7, 8]. Disse midler er utformet for å blokkere ligand-induserte EGFR-tyrosinkinase-aktivering og dermed hemme nedstrøms signalisering [9]. Men bare CRC med villtype
KRAS
proto-onkogen svarer på anti-EGFR antistoffer behandling, mens ingen terapeutisk respons oppstår i CRC med
KRAS
mutasjoner [9-11]. European Society for Medical Oncology og American Society of Clinical Oncology har etablert store onkologi retningslinjer som disse antistoffene være begrenset til pasienter med
KRAS
villtype kolorektal kreft [12, 13]. Derfor påvisning av
KRAS
genmutasjoner har kritisk klinisk relevans for å utvikle individualiserte pasient terapeutiske strategier [7].
Flere molekylære metoder har blitt utviklet for å oppdage
KRAS
mutasjoner. Disse metodene omfatter direkte sekvensering [10], real-time PCR [11], med høy oppløsning og som smelter (HRM) [14], forsterkning ildfast mutasjon system polymerasekjedereaksjon [15, 16], pyrosekvensering [17, 18], ko-amplifisering ved lavere denatureringstemperaturen PCR [19], mutant-anrikede PCR [20], og digital-PCR [21]. I tillegg er flere kommersielle molekylære kits er allment tilgjengelig for
KRAS
mutasjonsdeteksjon, inkludert Cobas
® KRAS Mutation Test [22], 3D-Gene
® KRAS mutasjonsanalyse kit, TheraScreen
® KRAS RGQ PCR Kit [23], EntroGen er KRAS Mutation Analysis Kit for real-Time PCR [23], og KRAS PyroMark Q96 V2.0 Kit [24]. Men alle disse metodene krever teknisk kompetanse og spesialisert utstyr og instrumenter, og er for dyrt som prognostiske og diagnostiske verktøy for kreftpasienter i utviklingsland. I motsetning til dette, Multiplex allel-spesifikk Polymerase Chain Reaction (PCR-MAS) er en enkel, pålitelig og billig metode for påvisning av kjente mutasjoner og enkeltnukleotidpolymorfi [25, 26]. MAS-PCR er karakterisert ved primere med en allel-spesifikke 3 «terminus som hybridiserer spesifikt til mutert eller vill-type-DNA templat eneste [26, 27]. Vill-type og allel-spesifikke primere generere forskjellige størrelse av PCR-produkter som tillater lett påvisning av en kjent genmutasjon.
I denne studien, har vi utviklet en MAS-PCR-assay for analyse av mutasjonsstatus av
KRAS
kodon 12 og 13. Enkelt nucleotide punktmutasjoner i
KRAS
genet forekommer hyppigst i kodon 12 og 13 står for 80 til 82% og 15-17% av mutasjonene, henholdsvis [28-31 ]. Mutasjoner i andre posisjoner, for eksempel kodon 61, 117, 146 og 154, er mye sjeldnere på om lag 1% av alle
KRAS
genmutasjoner [17, 32]. I denne studien nærvær av de mest vanlige punkt-mutasjoner i kodon 12 og 13, som er G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D [18, 30, 32, 33], ble undersøkt i formalinfiksert, parafininnstøpte vevsprøver fra 270 CRC pasienter. Pyrosekvensering, en robust og følsom metode, ble brukt som en referansemetode for å sammenligne følsomheten av MAS-PCR-analyse for påvisning av
KRAS
mutante alleler.
Materialer og Metoder
Utarbeidelse av kliniske prøver
Formalin fiksert, ble parafininnstøpte colorectal adenokarsinomer fra 270 pasienter med CRC hentet fra Institute of Pathology, Ministry of Public Health, Bangkok, Thailand. Studien ble godkjent av etikkomiteen ved Institutt for patologi (IOP-KM-R57-007). Den etiske komiteen fravikes behovet for samtykke fordi dataene av vevsprøver ble analysert anonymt og rapportert. En erfaren patolog anmeldt og markerte adenokarsinom områder av hematoxylin og eosin farget lysbilder. Svulster ble manuelt mikro dissekert fra parafininnstøpte blokker, og 10 mikrometer tykke seksjoner ble samlet i en 1,5 ml tube. Parafin ble fjernet fra vevsblokker med xylen, og prøvene ble lufttørket. DNA ble ekstrahert fra prøvene og renset ved anvendelse av en DNA-QIAamp FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA mengde ble bestemt av Nanodrop spektrofotometri (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).
PCR Amplification og pyrosekvensering
pyrosekvensering for analyse av et
KRAS
genfragment spenner kodon 12 og 13 ble utført som tidligere beskrevet med noen endringer [18]. Sekvensen av prim ble tidligere beskrevet [18]. Reaksjonsbetingelsene med 1 uM forover primer (5′-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 «), biotinylert revers primer (5′-biotin-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3»), og 50 til 100 ng /ul DNA-templat ga et 82-bp produkt. Reaksjoner ble utført i 1 x PCR-buffer inneholdende 2,5 mM MgCb
2, 0.2 mM dNTP (BioLabs, England), og 0,625 U Amplitag Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems, USA) i en 30 pl totalvolum. PCR-betingelsene var en denaturerende trinn ved 95 ° C i 10 minutter, deretter 1 min ved 95 ° C, 1 minutt ved 55 ° C, 1 minutt ved 72 ° C i 35 sykluser, og etterfulgt av 7 minutter ved 72 ° C. PCR-produktene ble bekreftet ved 8% polyakrylamid-gel-elektroforese ved 140 V i 40 minutter, og gelene ble farget med SYBR grønn I Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) i 30 minutter. PCR-produktene ble sekvensert ved hjelp av pyrosekvensering PyroMark gull Q96 reagens (Qiagen, Tyskland). PCR-produkter på 30 pl ble blandet med 3 ul streptavidin-konjugerte Sepharose-kuler (Streptavidin Sepharose HP, Amersham Biosciences AB, Sverige), 40 ul bindingsbuffer og 17 ul destillert vann, etterfulgt av risting ved 1400 rpm i 10 min. De immobiliserte biotinylerte PCR produktene: streptavidin-konjugert Sepharose perler komplekser ble tatt med vakuum prep verktøy. Enkelt-trådet DNA-rensing ble oppnådd ved 1 x vask vakuum prep verktøyet i rekkefølge med 70% etanol i 5 s, denaturering oppløsningen i 5 s, og vaskebuffer i 10 sek. Biotinylert enkelt-trådet DNA ble tilsatt til en 96-brønners mikrotiterplate som inneholdt 40 ul av 0,4 uM sekvense PF1-primeren (5′-TGTGGTAGTTGG AGCTG-3 «) for analyse ved nukleotidene 35 og 38 stillinger, og PF2-primer (5 «-TGTGGTAGTTGGAGCT-3») for analyse ved nukleotid 34 posisjon [18]. Platen ble inkubert ved 80 ° C i 2 minutter, etterfulgt av avkjøling til romtemperatur i 5 min, og applisert på den PyroMark Q96 ID-systemet (Qiagen, Tyskland).
DNA Cloning
genomisk DNA fra åtte kliniske prøver husing
KRAS
villtype DNA og sju punktmutasjoner i
KRAS
kodon 12 og 13 (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, og G13D) ble utsatt for PCR forsterkning ved hjelp av universale
KRAS
primere (K-
ras
-codon 12/13-F 5′-CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG TAT T-3 «og K-
ras
-codon 12/13-R 5′-ATC TGT ATC AAA GAA TGG TCC TG-3 «). Alle 259-bp PCR-produkter ble klonet inn PSC-A-amp /kan vektor og transformert inn i kompetente
Escherichia coli
cellene ved hjelp av en Strataclone PCR kloning kit (Agilent Technologies, USA). De transformerte bakterier ble spredt på selektive LB-agarplater (Oxoid, USA) med ampicillin og X-Gal (Promega, USA). Etter en inkubering over natten ved 37 ° C, ble hvite kolonier valgt tilfeldig og dyrket i LB-medium, over natten. Plasmider ble hentet ved hjelp av veiviseren
® genomisk DNA rensing kit (Geneaid, Taipei, Taiwan) og deretter screenet for innsatsen fragment ved PCR. Positiv PCR produktene ble sekvensert ved Bioneer Corporation, Daejeon, Sør-Korea.
Primer Design
Allele spesifikk (AS) primere ble utformet for hver av syv mutasjoner, og en mutasjon-uspesifikke region ble brukt som en referanse amplikon. Den 3′-terminale base av hver AS primer ble tatt i bruk i henhold til den tilsvarende mutasjon. Forsterkning reaksjoner ble utført med hoved
KRAS
fremover primer og fem AS primere (G12R-F, G12C-F, G12D-F, G12A-F, og G13D-F) som deler med en felles anti
KRAS
revers primer, og reaksjoner med to AS-primere (G12S-R og G12V-R) deling med en sunn fornuft
KRAS
fremover primer (fig 1). Sekvensen av primerne anvendt i denne undersøkelsen er angitt i tabell 1. Alle primere ble syntetisert og levert av Biodesign Co., Ltd. (Biodesign, Pathumthani, Thailand).
Posisjonene av primerne er vist. AS primere har samme forover primer eller revers primer. Solid Pilene viser forover og bakover primere. Den 3′-terminale base av hver AS primere ble tilpasset i henhold til den tilsvarende mutasjon, og er i fet skrift og understreket. Kodon og muterte baser er understreket.
Bilder
Multiplex allel-spesifikk PCR (MAS-PCR) Analyse
En enkel reaksjons hatt to hoved
KRAS
primere og syv AS primere rettet mot på syv muterte nukleotider i
KRAS
genet. MAS-PCR-reaksjon i 50 ul samlet volum inneholdt 1 x PCR-buffer, 2,5 mM MgCl
2, 0.2 mM dNTP (BioLabs, England), 0,625 U Amplitag Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems, USA), 50 til 100 ng /ul DNA-templat. Den optimaliserte konsentrasjoner av hver primer er vist i tabell 1. Reaksjonen ble amplifisert under de følgende betingelser: en innledende denatureringstrinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 10 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 45 s, 72 ° C i 60 s, et andre trinn på 20 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 64 ° C i 45 s, 72 ° C i 60 s, og et tredje trinn på 20 sykluser ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 45 s, 72 ° C i 60 s, og til slutt 10 minutter ved 72 ° C. Etter amplifikasjon ble amplikoner med et lastevolum på 20 pl analysert med 8% polyakrylamid-gel-elektroforese ved 140 V i 60 minutter, og gelene ble farget med SYBR grønn I Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) i 30 min. På grunn av den 3 «enden av hver AS primerpar med den respektive nukleotid-base i den muterte sekvensen av
KRAS
genet, allel-spesifikke fragment ble amplifisert hvilket gav en av 97-bp, 91 bp-, 89- bp, 85-bp, 83-bp, 68-bp og 64-bp produkter (representerte G12C, G12D, G13D, G12R, G12A, G12V, og G12S mutanter, henholdsvis) sammen med den positive 113-bp bandet som en intern kontroll. Mens villtype-DNA ved en hvilken som helst av de syv stillinger hindrer allel-spesifikk amplifikasjon resulterer i en tilsvarende manglende bånd (figur 2).
Assay skilles villtype
KRAS
genet kodoner 12 og 13 fra forskjellige mutanter ved hjelp AS primere. Lane M: Lav molekylvekt-DNA stige; Felt 1: negativ kontroll; Felt 2: vill-type; Lane 3: G12S mutant; Felt 4: G12R mutant; Lane 5: G12C mutant; Lane 6: G12D mutant; Lane 7: G12A mutant; Lane 8: G12V mutant; Lane. 9: G13D mutant
Følsomhet for MAS-PCR-analyse
Åtte plasmid kloner av
KRAS
villtype og sju
KRAS
mutanter (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, eller G13D) ble hentet. Hver mutert plasmid-DNA ble blandet med en villtype-plasmid-DNA i samlet mengde av 100 ng. Andelen av mutant-plasmid-DNA ble gradvis redusert for å oppnå avtagende forhold mellom mutant til villtype-DNA ved 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% og 0,1%. Presisjonen og reproduserbarheten ble bestemt i fire gjentatte kjøre ved å analysere blandinger på utvalget av laveste deteksjonsgrense som ble demonstrert av MAS-PCR.
Dataanalyse
Resultatene er hentet fra MAS-PCR og pyrosekvensering ble sammenlignet for de 270 formalinfikserte, parafininnstøpte prøvene og ble evaluert for signifikans ved hjelp av Kappa statistikken. En verdi på k 0,81 ble ansett å være betydelig og for å vise at begge metodene gir nesten perfekt resultat. Positive og negative avtale trygg intervaller ble bestemt for MAS-PCR resultater. Forskjeller i kategoriske variabler som alder, kjønn, histologisk grad og åsted for svulst mellom pasienter og med
KRAS
mutasjoner ble evaluert for betydning med chi-kvadrat test. Statistiske tester var tosidig, og p 0,05 ble betraktet som signifikant. Statistikk ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 11.5).
Resultater
pyrosekvensering analyse av
KRAS
genmutasjoner i CRC prøver
To hundre og sytti kliniske prøver ble først analysert ved pyrosekvensering for 6 forskjellige punktmutasjoner i kodon 12 (G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, og G12V) og en punktmutasjon i kodon 13 (G13D) i
KRAS
genet. Mutasjonene som er valgt for dette studiet er blant de mest ofte funnet i pasienter med kolorektal kreft. Av de 270 vevsprøver, sekvense Resultatene viste at 120 tilfeller (44.44%) hadde en mutasjon i enten kodon 12 eller 13 i
KRAS
genet, mens 150 tilfeller (55.55%) ble definert som
KRAS
villtype (tabell 2). Av de 120 tilfellene med
KRAS
mutasjon, 61 (50,83%) av pasientene hadde et kodon 12 mutasjon. Den hyppigste kodon 12 mutasjon var G12D på 25,83%, etterfulgt av G12V på 12,50%. Forekomsten av G12A, G12S og G12C mutasjoner varierte 6-3%, mens det av G12R var den laveste på 1%. Kodon 13-mutasjon G13D funnet på 49,17% var mer utbredt enn noen av kodonet 12 mutasjoner. Pasientene hadde enten en eller ingen påviselig mutasjon.
MAS-PCR analyse av
KRAS
genmutasjoner i CRC kliniske prøver
MAS-PCR-analyse, utført på 270 CRC vevsprøver for å oppdage
KRAS
kodon 12 og kodon 13 mutasjoner, avslørte resultater som tett avtalt med de av pyrosekvensering. Som vist i tabell 2, 113 (41,85%) tilfeller av
KRAS
mutasjon i kodon 12 og 13 og 157 tilfeller (58,15%) av
KRAS
villtypen ble identifisert av MAS-PCR-analyse . Blant de 113 muterte tilfeller 47,79% hadde en mutasjon ved kodon 12. Videre i referanse til pyrosekvensering resultater, ble syv muterte tilfeller (tre G12D, en G12R, og tre G12A) ikke oppdaget av MAS-PCR-analyse. Men alle kodon 13 mutasjoner ble korrekt identifisert, som med pyrosekvensering resultater.
Korrelasjonen av pasientenes egenskaper med
KRAS
kodon 12 og 13 mutasjoner
Median alder for pasientene ble 62 år, fra 27 til 90 år gammel. Flertallet av pasientene var mellom 60 og 79 år (55.19%). Mann til kvinne ratio var 1,55: 1. Den dominerende histologisk typen på 64,81% (175/270) ble moderat differensiert, og 88,52% av tilfellene (239/270) var kolorektal primære tumorer (Tabell 3). En mulig sammenheng mellom pasientenes demografiske karakteristika og oppdaget
KRAS
mutasjoner ble undersøkt som vist i tabell 3. Av de undersøkte pasienter
KRAS
mutert karsinom, ingen signifikante forskjeller ble funnet med hensyn til alder , kjønn, histologisk grad og svulststedet. Mutasjoner i kodon 12 og 13 ble rettferdig og jevnt fordelt i gruppene å være nær. 1: 1-forhold uavhengig av den karakteristiske
Sammenligning av MAS-PCR og pyrosekvensering
Resultater for 270 FFPE-prøver ble underkastet enighet analyser, og MAS-PCR-resultater ble sammenlignet med de av den pyrosekvensering metoden (tabell 4). Overensstemmende resultater av 263 av 270 prøver viste at begge metodene gitt et perfekt resultat (p 0,05) med ingen statistisk signifikant forskjell mellom de analysene (k = 0,947, 95% CI = 0,909 til 0,986). For 7 tilfeller ble uharmoniske oppnådde resultater, hovedsakelig om kodon 12 mutasjoner som var påvises ved pyrosekvensering og sanger direkte sekvensering, men ikke med MAS-PCR-analyse. Den positive avtalen og negative avtalen var 94% og 100%, henholdsvis.
Følsomhet, presisjon og reproduserbarhet av MAS-PCR for
KRAS
mutasjon
Å sensitivitetsberegninger for MAS-PCR-analyse, plasmid DNA av hver syv
KRAS
mutante kloner ble fortynnet i separate forsterker reaksjoner med plasmid DNA av en villtype
KRAS
klone. Andelen av mutant-DNA ble gradvis redusert for å oppnå avtagende forhold mellom mutant til villtype-DNA. MAS-PCR assay oppdaget mutante alleler ned til 1% for G12S mutant, og 2% for de G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, og G13D mutanter. Det representative eksempel på MAS-PCR-analyse for laveste Påvisningsgrensen er vist i figur 3. For å teste for presisjon og reproduserbarhet av vår MAS-PCR-analyse, vi kvantifisert
KRAS
mutasjoner i DNA-blandinger inneholdende hver av de syv mutant
KRAS
DNA og villtype-DNA til varierende forhold (10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% og 0,01%) i fire gjentatte forsøk. Resultatene var nøyaktig og reproduserbar, hvorav den samme laveste mengde
KRAS
mutante alleler ble påvist i alle gjentatte forsøk.
En representativ gel er vist. Fortynninger av G12R mutant plasmid og villtype plasmid DNA (fra 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% og 0,1% muterte alleler) Felt M: Lav molekylvekt-DNA stige; Felt 1: negativ kontroll; Lane 2-9: samsvarer med PCR-produkter fra 100% til 0,1%
Diskusjoner
Mange studier har undersøkt sammenhengen av
KRAS
mutasjoner med CRC [. ,,,0],8, 33-37].
KRAS
mutasjoner i CRC pasienter korrelerer med resistens mot anti-EGFR behandling, for eksempel cetuximab eller panitumumab [7]. Derfor vil nøyaktig prediksjon av behandlingstiltak spare pasientene for unødvendig behandling mens fokus på mer individualisert effektiv terapi. En lang rekke fremgangsmåter har blitt utviklet, og flere kommersielle kits molekyl er vanlig tilgjengelige for detektering
KRAS
mutasjoner [10, 11, 14, 17, 20, 23]. Hver teknikk har sitt eget sett med problemer og problemer. For eksempel, er direkte sekvensering de mest brukte metode for å screene for
KRAS
mutasjoner imidlertid følsomhet for påvisning av mutant-DNA er lav og krever minst 10% -30% av muterte alleler i en villtype bakgrunn [ ,,,0],14, 18, 38]. HRM er en hurtig metode som gjør det mulig for high-throughput screening av
KRAS
mutasjoner med en moderat analytisk sensitivitet på 5% til 6% [14], er imidlertid dens viktigste begrensning manglende evne til å identifisere kodonet som er mutert. HRM resultater bør bekreftes, og identifisering av spesifikke mutasjoner krever en annen teknikk, slik som direkte sekvensering [39]. Pyrosekvensering er nøyaktig, er det mulig og har overlegen analytisk sensitivitet på omtrent 5% mutant allel [14, 18]. Likevel krever denne analysen en kostbar instrument, og dyre reagenser og forbruksvarer, noe som gjør det koste prohibitive for bruk i utviklingsland. Kommersielle molekylsett har forskjellige fordeler, inkludert høy sensitivitet (dvs. deteksjonsgrense omkring 1% til mindre enn 5%), hastighet, lett tolkning av data, og mange detekterbare posisjoner av
KRAS
mutasjoner, også krever imidlertid denne analysen et kostbart instrument, kostbare reagenser, og har en forholdsvis høy kostnad per prøve [40]. Derfor er det behov for å utvikle en nøyaktig, enkel og kostnadseffektiv metode for å påvise
KRAS
mutasjoner kjent for å være assosiert med CRC som kan utnyttes i utviklingsland.
I denne studie, vi har utviklet svært følsom og spesifikk MAS-PCR-analyse, rettet mot sju (dvs. G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, og G13D) de vanligste mutasjoner i kodon 12 og 13
KRAS
genet. Vi har utviklet spesifikke primere for hver mutasjon, og en mutasjon-ikke-spesifikk region ble brukt som en referanse amplikon. Den 3′-terminale base av hver AS primer ble tatt i bruk i henhold til den tilsvarende mutasjon. MAS-PCR assay ble optimalisert for hver primer i form av primer konsentrasjon og forsterkningsparametre. MAS-PCR assay vi rapportert her er den første utbyggingen av multiplex allel-spesifikk PCR ansette standard PCR-metode som kan påvise de sju vanligste
KRAS
genmutasjoner. Fremgangsmåten kan bare bli utført ved lave ressurs laboratorier. Videre undersøkelser er på vei til å utvikle en enkel, rask og brukervennlig Nucleic Acid Lateral Flow (NALF) immunoassay [41] med biotinylerte primere basert på primere utviklet i denne studien. Videre probe-basert real-time PCR kan opprettes ved hjelp av vår MAS-PCR primer satt til å oppdage
KRAS
mutasjoner. Begge metodene kan være en fordel når det gjelder å forebygge crosstalk mellom prøvene og /eller miljømessige forurensninger under gjennomføre eksperimenter.
I denne studien har vi observert at hyppigheten av
KRAS
onkogene mutasjoner i kodon 12 og 13 i 270 prøver av kolorektal kreft thailandske pasienter var 44,44%. Lignende frekvenser, som strekker seg fra 20 til 50%, har tidligere blitt beskrevet [28, 30, 33]. Vi fant utbredelsen av mutasjoner i kodon 12 og kodon 13 var på 50,83% og 49,17%, henholdsvis, som var høyere enn de som er rapportert i andre studier (kodon 12: 70-90%, kodon 13: 10-30%) [28 , 30, 31, 33]. Men våre resultater ga lignende frekvenser (kodon 12: 52,62% (10/19), kodon 13: 42,12% (8/19)) som rapportert av Poehlmann et al [17]. Den ofte funnet G13D, G12D, og G12V mutasjoner identifisert i denne studien var blant de vanligste
KRAS
mutasjoner, i overensstemmelse med andre studier [17, 28, 33]. Våre data viste at ingen signifikant sammenheng mellom
KRAS
mutasjoner og alder, kjønn, histologisk grad eller svulst nettstedet. Men noen tidligere rapporter fant at frekvensen av
KRAS
mutasjoner var høyere hos kvinner enn menn [10, 42] som var motsatt til studiet av Poehlmann et al [17].
dataene viste en overlegen konsistens mellom MAS-PCR-analyse og pyrosekvensering (k = 0,947). Syv discordances ble funnet i henhold til pyrosekvensering resultater. Direkte sekvensering og pyrosekvensering viste de samme muterte alleler, som består av 3 tilfeller av G12D, 3 tilfeller av G12A, og en sak av G12R. En mulig resultat er dannelse av kryss-dimerer mellom primerne som fører til forspent forsterkning, noe som kan redusere følsomheten til MAS-PCR-analyse [43]. I tillegg kan FFPE vevsprøver ha nedbrutte nukleinsyrer på grunn av fikseringsprosessen, og effekten av tverrbindings fiksativ på nukleinsyrene er skadelig forårsaker PCR-inhibering [44, 45]. Interessant, vår MAS-PCR-analyse viste høy analytisk sensitivitet for deteksjon, med ca 1-2% mutant allel oppdaget basert på DNA-blanding eksperimenter med genomisk DNA isolert fra plasmid klonet DNA. Imidlertid kan en slik følsomhet påvirkes med tanke på bruk av kliniske prøver som vanligvis komplisert med tilstedeværelse av PCR-interfererende komponenter i prøvene. Likevel kan de fleste forstyrrende komponenter elimineres ved DNA-rensing under anvendelse av FFPE vev kits som vi anvendt i denne studien, og som tidligere beskrevet [46, 47]. Videre, MAS-PCR-analyse som vi har utviklet har en høyere følsomhet enn den som er rapportert for direkte sekvensering og HRM (dvs. 5% til 20%), og er tilsvarende den som er rapportert for pyrosekvensering og kommersielle molekyl sett (dvs. 1% til 5%) [14, 18, 38]. Videre fant vi en god presisjon og reproduserbarhet av den industrialiserte analysen, som fire gjentatt kjøring ga de samme resultatene. I tillegg er MAS-PCR et hurtig assay krever kun 4 timer for å fullføre analysen (med unntak av DNA); det er billig, koster ca $ 8 per test. Videre benytter analysen bare en PCR instrument, og ikke krever en høy grad av teknisk kompetanse og spesialutstyr.
Konklusjoner
I konklusjonen, har vi utviklet en MAS-PCR-analyse for påvisning av de syv mest vanlige mutasjoner i kodon 12 og 13 på
KRAS
genet. MAS-PCR-analyse er en DNA-basert protokoll som var lett å utføre, som er hurtig, kostnadseffektiv, meget følsom og meget spesifikk. En analyse med disse egenskapene er viktig for analyse av kliniske prøver, såsom FFPE-vev, særlig for å hjelpe klinikere i å forutsi det kliniske forløpet av monoklonalt anti-EGFR-antistoff behandling av mCRC pasienter.
Takk
forfatterne ønsker å takke dr Chupong Ittiwut og Dr. Rungnapa Ittiwut (Senter for fremragende forskning i medisinsk genetikk, Chulalongkorn University) for deres råd om pyrosekvensering teknikker. Vi ønsker å takke Institutt for medisinske tjenester, Institute of Pathology, Ministry of Public Health for å gi CRC vevsprøver og pyrosekvensering instrument. Vi ønsker å uttrykke vår takknemlighet til Prof. Dr. Kathleen L. McCoy (Institutt for mikrobiologi og immunologi, School of Medicine, Virginia Commonwealth University), som ble finansiert av tilskuddet for utenlandske akademikere og forskere for å øke publiserte artikler i internasjonale tidsskrifter gjennom Chulalongkorn University Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund 2015 for hennes kritisk lesning av dette manuskriptet. Vi ønsker også å erkjenne Assoc. Prof. Dr. Pornpimol Rongnoparut for korrekturlesing hjelp.
