Abstract
Bakgrunn
gjensidige interaksjoner mellom epitel og stroma spille viktige roller for prostatakreft utvikling og progresjon. Forbedrede sekret av cytokiner og vekstfaktorer av kreft assosiert fibroblaster i prostatakreft skape et gunstig mikromiljøet for kreftceller til å vokse og spre. Vårt tidligere arbeid viste at progesteronreseptoren (PR) ble uttrykt i prostata spesifikt stromale fibroblaster og glattmuskelceller. Men uttrykket nivåer av PR og dens innvirkning på svulsten mikromiljøet i prostatakreft dårlig forstått.
Metoder
immunhistokjemi analyser brukes på menneskelige prostata vev biopsi. Cell migrasjon, invasjon og spredning analysene er utført ved hjelp av menneskelige prostata celler. Real-time PCR og ELISA brukes til å måle genuttrykk på molekylært nivå.
Resultater
immunhistokjemi analyser viste at PR proteinnivået ble redusert i kreft assosiert stroma sammenlignet med paret normal prostata stroma. Ved hjelp av
in vitro
prostata stromal cellemodeller, viste vi at kondisjonert medium samlet inn fra PR-positive stromale celler hemmet prostatakreft cellemigrasjon og invasjon, men hadde mindre undertrykkende påvirkning på kreftcelle spredning. PR trykkes utskillelsen av stromal avledet faktor-1 (SDF-1) og interlukin-6 (IL-6) av stromale celler uavhengig til PR ligander. Blokkering PR uttrykk av siRNA eller tilskudd av eksogene SDF-1 eller IL-6 til betinget media fra PR positive stromale celler motvirket hemmende effekten av PR til kreft celle migrasjon og invasjon.
Konklusjoner
redusert uttrykk for PR i kreft assosiert stroma kan bidra til forhøyet SDF-1 og IL-6 nivåer i prostatakreft og forbedre prostata tumorprogresjon
Citation. Yu Y, Lee JS, Xie N, Li E , Hurtado-Coll A, Fazli L, et al. (2014) Prostata stromale celler Uttrykk Progesteron Receptor å kontrollere Cancer Cell Mobility. PLoS ONE 9 (3): e92714. doi: 10,1371 /journal.pone.0092714
Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 01.12.2013; Godkjent: 24 februar 2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av kanadiske Institutes of Health Research Drifts Grant (MOP- 97934), Rising Star Award og Discovery Grant fra prostatakreft Canada til XSD og PNW prostatakreft SPORE pilot tilskudd til XSD og MG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft har flere cellepopulasjoner. Kreftceller er omgitt av ikke-epiteliale cellemiljø bestående av fibroblaster, glatte muskelceller og myofibroblasts. Akkumulerte bevis viser at det gjensidige epitel-stromaceller interaksjoner er kritiske for tumorutvikling, vekst og metastase [1], [2]. For eksempel benign prostatahyperplasi epitelcellelinje BPH-1 er vanligvis nontumorigenic i nakne mus. Imidlertid, når kombinert med karsinom-assosiert fibroblaster (kafeer) og podet inn i nyrekapselen, BPH-1 celler dannet tumorer [3]. Disse funnene viser at stromale celler spiller viktige roller i malign transformasjon. Gjennom sekresjon cytokiner og vekstfaktorer, kafeer gir også en støttende mikromiljøet for å lette tumorvekst, invasjon og metastase [4], [5]. Men til tross for disse kritiske roller stroma i prostatakreft (PCA), er terapeutisk strategi rettet mot prostata stroma sterkt under verdsatt. Dette gjenspeiler vår begrensede kunnskap om stroma-epitel samhandling på de cellulære og molekylære nivåer.
Det er kjent at kreft assosiert stroma øker utskillelsen av flere cytokiner, som er viktige komponenter i svulsten mikromiljøet [6]. Stromal celle-avledet faktor-1 (SDF-1) utskilles av stromale fibroblaster og virker ved å binde seg til sin reseptor, CXCR4, på membranen fra epitelceller til å utløse flere signalveier [7] – [10]. SDF-1 /CXCR4 akse har vist seg å lette kreftcelle invasjon, tumor angiogenese [11], [12], stimulere celleproliferasjon [13], [14] og beskytter cellene mot kjemoterapeutisk medikament-indusert apoptose [15] – [ ,,,0],17]. SDF-1 mRNA nivåene stiger som kreft vev sammenlignet med tilstøtende godartede vev [18] og er den høyeste i metastatisk PCa [19]. Videre er CXCR4 uttrykk også forhøyet i PCA vev [19], ytterligere forsterke handlingene til SDF-1. Interleukin 6 (IL-6) er også en viktig cytokin som kan stimulere Janus kinaser /Signal Svinger og Activator transkripsjon tre sti i kreftceller [20]. Både SDF-1 og IL-6 kan aktivere androgenreseptoren (AR) på lave nivåer av androgener i PCA-celler og bidra til tumorprogresjon til kastrering motstandsdyktig trinn [21] – [23]. IL-6 ble rapportert å forbedre PCa celleproliferasjon og beskytter cellene mot apoptose i tumorxenografter [24], [25]. Forhøyet serum-IL-6-nivåer ble også vist å være en dårlig prognose markør [26], [27].
Prostata stromale celler uttrykker også flere steroidreseptorer, inkludert androgen og østrogen reseptorer. Disse reseptorene ble rapportert å være viktig for stromale celler for å dirigere PCa utvikling ved å modulere ekspresjon av cytokiner /kjemokiner [28] – [30]. Vi har nylig rapportert at både progesteron reseptor (PR) isoformer, PRA og PRB, ble uttrykt spesifikt i prostata stroma og negativt regulert stromal celleproliferasjon [31]. I denne studien, utvidet vi vår innsats for å måle PR protein nivåer ved PCA og PR regulering av SDF-1 og IL-6 uttrykk i prostata stromale celler.
Materialer og Metoder
Menneske Prostata vev og Immunohistokjemi
Twenty-seven hele mount deler av menneskelige prostata vev biopsier ble hentet fra radikale prostatectomies. Detaljert informasjon om hver vevsprøve ble oppført i tabell 1. Alle pasienter inngikk et informert samtykke til en protokoll som ble gjennomgått og godkjent av UBC Clinical Research Ethics Board (Certificate #: H09-01628). Immunhistokjemi (IHC) ble utført ved hjelp av Ventana Discovery XT Autostainer (Ventana Medical Systems) med antistoffer mot PR (Abcam) og PRB (Cell Signaling) som rapportert [31]. Digitale bilder av vev lysbilder ble skannet av en BLISS skanner system (Bacus Lab Inc). Innenfor de perifere soner, 5 stromale felt ( 1000 kjerner) ble valgt av patologen (l.f) tilstøtende til benigne epiteliale celler og 5 andre stromale felt var fra tilgrensende kreft epitelceller. Fem andre stromale felt var fra overgangssoner. De patologiske scorene ble oppnådd ved programvaren Digital Image Hub (Leica Biosystems) for å beregne hvor stor andel av farget kjerner og fargeintensitet. De relative nivåer av PR og PRB ble beregnet som indeks for HScore = Σpi (i + 1), hvor i = intensitet av farging, og pi = prosentandelen av fargede celler. HSCOREs ble brukt for å sammenligne PR og PRB nivåer mellom normal og kreft stroma og mellom randsonene og overgangssoner.
prostata stromal cellelinjer
Menneskelig prostata stromal cellelinje (WPMY-1 ) og PCA cellelinjer LNCaP og PC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP avledet C4-2B celler ble kjøpt fra Urocore (Oklahoma City, OK, USA). LNCaP, C4-2B og PC-3 celler uttrykker ikke målbare nivåer av PR mRNA og protein. Humane kreft assosiert fibroblaster (hCAFs) ble vennlig levert av Dr. Simon Hayward (Vanderbilt University). De ble avledet fra humane primære dyrkede cancer forbundet fibroblaster [2]. Menneskelige primære prostata stromale celler, HPS-19I, ble sjenerøst gitt av Dr. David Rowley (Baylor College of Medicine) [4]. Eksogent PRA og PRB ble innført i WPMY-1, hCAF og HPS-19I av lentivirus, som beskrevet [31]. Protein uttrykk nivåer samt cellulær lokalisering av PRA og PRB ble bekreftet (Figur S1). Alle eksperimenter med hCAFs var innen 8-10 celle passasjer og HPS-19I cellene innen 5-6 passasjer på mottatt fra leverandører.
Kvantitativ Real-Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizaol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. To mikrogram av total RNA ble underkastet en tilfeldig-primet revers transkripsjon ved å bruke SuperScritpt 2 revers transkriptase (Invitrogen). Real-time PCR ble utført i tre paralleller bruker Applied Biosystems 7900 HT med 5 ng av cDNA, 1fiM av hver primer par og SYBR Grønn PCR Master Mix (Roche). Primersekvensene ble oppført i tabell S1. Relative mRNA-nivåer ble normalisert til GAPDH. SiRNA rettet mot PR ble kjøpt fra Thermo Fisher (Cat N. J-003433-08-0005).
Samling av betinget Media
nitti prosent sammenflytende hCAFs, WPMY-en og HPS-19I stromal cellene ble vasket to ganger med PBS-buffer og etterfylles med serumfritt DMEM media i nærvær av kjøretøyet, P4 eller PR-antagonist RU486 i 48 timer. Protein konsentrasjoner av kondisjonert medium (CM) ble målt ved Bicinchoninic Acid analysen (Thermo Scientific). Samme mengde CM fra PR positive og negative celler ble brukt til å behandle PCA celler for celle migrasjon, invasjon og spredning analyser.
ELISA-analysen
SDF-1 og IL-6 konsentrasjoner i CM ble målt ved kommersiell ELISA kit etter produsentens protokoll (R 0,05 som *, P 0,01 som ** og P 0,001 s *** .
Resultater
PR proteinnivået er redusert i prostatakreft
Vi har samlet 27 hele montere deler av menneskelig prostata vev biopsier fra pasienter behandlet med radikal prostatektomi (tabell 1) . Pasientene er 46 til 88 år i alder, med Gleason score fra 6 til 9 og kreftstadier som spenner fra T2A til T3B. Ved hjelp av IHC-analyser, var både total PR og pRb isoformer påvist i kjernen av en del av prostata stromale celler (Fig.1A-B). Men HScore av PR (kombinert beregning av intensitet og persentil av positive kjerner) var 41% lavere (P = 0,001) i kreft assosiert stroma sammenlignet med paret normal stroma i prostata randsonene (Fig.1C). I tillegg HScore av PRB i kreft assosiert stroma var omtrent 44% lavere enn ved normal stroma (P = 0,004) (Fig.1D). Foreløpig er det ingen spesifikk antistoff for å påvise PRA isoform. Gitt det faktum at både total PR og PRB reduksjon i tilsvarende grad, er det sannsynlig at PRA ekspresjonsnivåene følger den samme trend som PRB. Det var ingen signifikante forskjeller i enten PR eller PRB HScore mellom godartede randsonene og overgangssoner (Fig.1C-D). Det var ingen statistiske forskjeller i samlede PR eller PRB proteinnivåer i forbindelse med Gleason score og serum PSA konsentrasjon blant disse 27 pasientene. Sammen indikerte disse resultatene at PR-nivåene ble redusert i kreft assosiert stroma.
Hele montere deler av menneske prostatabiopsier (n = 27) ble immunostained med PR antistoff (Abcam) eller PRB antistoff (Cell Signaling). Representative IHC bilder av PR (A) og PRB (B) fra godartede randsonene, kreft randsonene og overgangssoner vises. IHC farging av PR (C) og PRB (D) proteinnivået i paret godartet
vs
kreftrandsonene og i paret godartet perifer
vs
overgangssoner fra 27 hele montere deler av menneske prostatabiopsier ble scoret av Digital Image Hub (Leica Biosystems). HScore indekser ble plottet som ± SE. Enveis ANOVA og paret t-test beregner nivået av betydning.
stromal PR hemmer PCa celle migrasjon og invasjon
For å studere PR funksjoner på cellenivå, vi har søkt flere menneskelige prostata stromal cellemodeller inkludert hCAFs, WPMY-1 og HPS-19I. Disse cellene uttrykker lave nivåer av PR mRNA men ikke målbare nivåer av PR protein. Vi introduserte eksogene PRA eller PRB isoform i disse cellene ved lentiviral tilnærming som rapportert [31], som tillater oss å studere funksjonen til hver PR isoform. Selv WPMY-1 celler er avledet fra primære dyrkede stromale celler fra benign prostatahyperplasi vev, er disse cellene udødeliggjort av SV40 stor T antigen. De har lignende tumorigent kapasitet som hCAFs, når rekombinert med BPH-1 celler og podet i henhold mus nyrekapsel (upubliserte data).
For å fastslå effekten av PR i stromale celler på PCa celle migrasjon, vi utført sårtilheling analyser. CM samlet inn fra PR-positive og PR-negative hCAFs og WPMY-1 celler i nærvær av kjøretøyet eller 10 nM P4 ble anvendt for å inkubere ved hjelp av PC-3-celler. Sårheling analyser viste at CM fra PR positive celler resulterte i betydelig redusert celle migrasjon (Fig.2A-B). P4 behandling til stromale celler hadde ingen innvirkning på migrasjonsrate av PC-3 celler. Fig.2A-B viste representative bilder fra en av tre uavhengige forsøk. Vi hadde også utført celle migrasjon analyser for å ytterligere bekrefte ligand-uavhengig handling av PR i å kontrollere kreft celle migrasjon. PR positive WPMY-1-cellene ble behandlet med økende doser av P4, og deres CM ble oppsamlet og inkubert med PC-3-celler i cellemigrering assays (Fig.2C). Vi observerte at P4 hadde ingen innvirkning på PC-tre cellemigrasjon rente, heller ikke PR-antagonist RU486 (Fig.2D). Disse resultatene var repeterbare når vi byttet ut PC-3 celler med beinmetastatisk LNCaP-avledet C4-2B celler (Fig.2E-F).
Betinget media (CM) ble samlet inn fra foreldre hCAFs, WPMY-en eller deres avledede cellelinjer som uttrykker håne, PRA eller PRB, i nærvær av kjøretøyet eller 10 nM P4. PC-3-celler ble sådd ut i 6-brønners plater og inkubert med CM fra hCAFs (A) eller fra WPMY-1 (B) celler i 24 timer i sårheling analyser. Representative bilder etter 24 timers CM behandling ble tatt til fange av en invertert mikroskop. WPMY-1 og dets avledede cellelinjer som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med 0, 10 nM og 100 nM av P4 i 24 timer (C og E) eller med kjøretøy, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 for 24 timer (D og F). CM ble deretter samlet og inkubert med PC-3 celler (C-D) og C4-2B (E-F) i celle migrasjon analyser som beskrevet i materialer og metoder delen. Enveis ANOVA og paret t-test beregne statistisk signifikans satt til P 0,05 som * og P . 0.001 som ***
For å fastslå effekten av PR i stromale celler på PCa celle invasjon, søkte vi Matrigel invasjonen analysene. CM ble samlet inn fra PR-positive og PR-negative WPMY-1 celler behandlet med kjøretøy, 10 nM eller 100 nM av P4 (Fig.3A). Vi observerte at CM samlet inn fra PR-positive WPMY-1-celler resulterte i 50-75% av reduksjon i PC-3-celle invasjon. Denne PR funksjonen ble ikke endret ved P4 eller RU486 (Fig.3A-B). I tillegg ble tilsvarende resultater også observert når C4-2B celle ble brukt i matrigel invasjons assays (Fig.3C-D). Videre har vi også gjentatte forsøkene med CM samlet inn fra to andre prostata stromale celler, hCAFs og HPS-19I. Vi viste at CM fra PR positive hCAFs eller HPS-19I celler resulterte i ~20-30% av nedgangen i PC-3 celle invasjon, som PR-funksjonen var også uavhengig til P4 (Fig.3E-F). Sammen utgjør disse resultatene indikerte at PR besatt undertrykkende funksjon å PCa celle migrasjon og invasjon i en ligand-uavhengig måte.
WPMY-en og dens avledede cellelinjer som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandles med 0, 10 nM og 100 nM av P4 i 24 timer (A og C) eller med kjøretøy, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 i 24 timer (B og D). CM ble så samlet opp og inkubert med PC-3 (A-B) og C4-2B (C-D) celler i celle invasjon analyser. hCAFs (E), HPS-19I (F) celler og deres avledede cellelinjer som uttrykker håne, PRA og PRB ble behandlet med 0, 10 nM og 100 nM av P4 i 24 timer. CM ble deretter samlet og inkubert med PC-3 celler i celle invasjon analyser. Cell invasjonen ble beregnet som beskrevet i Materiale og metode delen. Enveis ANOVA og paret t-test beregne statistisk signifikans satt til P 0,05 som * og P 0,001 s ***
For å studere rollen til stromal PR på PCa cellevekst
in vitro
, utførte vi celleproliferasjonsprosesser analyser (figur S2). LNCaP-celler uttrykker en mutant AR som kan stimuleres ved P4. Behandling av LNCaP-celler direkte med P4 i kulturmediet resulterte i tre gangers induksjon av celleproliferasjon. CM samlet inn fra PR-positive hCAFs i fravær av P4 hadde statistisk signifikant, men meget milde hemmende effekter på LNCaP-cellevekst. Tilsvarende milde undertrykkende effekter ble også observert ved bruk av CM hentet fra PR positive WPMY-1 celler i nærvær av P4.
PR undertrykker SDF-1 og IL-6 uttrykk i prostata stromale celler
Siden PR proteinnivået er redusert i kreft assosiert stroma og CM fra PR-positive stromale celler hemme PCa celle invasjon og migrasjon
in vitro
, vi hypotese at PR kan fungere for å undertrykke sekretoriske faktorer syntetisert av stromale celler og regulere prostata epitel i en parakrint mote. For å teste denne hypotesen, vi re-besøkt genet microarray data profilering PR regulert gener i prostata stromale celler [31]. Ved stratifisering alle cytokiner og vekstfaktorer, identifiserte vi SDF-1 og IL-6 som den øverste rangerte gener hvis mRNA-nivåene ble inhibert av PR. For å bekrefte disse funnene, utførte vi real-time PCR og viste at PRA hemmet 70%, mens PRB hemmet 80% av SDF-1 mRNA nivå i hCAFs (Fig. 4A-B). Dette PR handlingen var ligand uavhengig, som verken P4 eller RU486 hatt noen innvirkning på PR undertrykkelse til SDF-1 mRNA nivåer. Viktigere, undertrykte SDF-1 mRNA-nivåer hos PR resulterte i redusert SDF-1 sekresjon av prostata stromale celler målt ved hjelp av ELISA (Fig.4C). Videre ble det observert PR inhiberende virkning på SDF-1-ekspresjon, ikke bare i hCAFs, men også i WPMY-1 (Fig.4D-E) og HPS-19I celler (Fig.4F). Vi har også observert tilsvarende hemmende effekter av PR til IL-6-mRNA og proteinnivåene i en ligand-uavhengig måte (fig.5). Det er viktig å bli lagt merke til at PR ikke utgjør en generell undertrykkende effekt til alle cytokiner eller vekstfaktorer. Flere vekstfaktorer inkludert bFGF, HGF, VEGF og KGF er enten oppregulert eller ikke endret av PR og /eller P4 behandling (Figur S3).
hCAFs og deres avledede cellelinjer som uttrykker mock, PRA eller PRB var behandlet med bærer, en (A) eller bærer, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 (B) i 24 timer. Real-time PCR målt mRNA nivåer av SDF-1 i forhold til GAPDH. (C) hCAFs og deres avledede cellelinjer som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer eller 10 nM av P4 i 24 timer. CM ble oppsamlet og anvendt for å måle SDF-1-proteinnivåer ved hjelp av ELISA. WPMY-1 og dets avledede cellelinjer som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer, 1 nM, 10 nM og 100 nM av P4 (D) eller bærer, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 (E) for 24 timer. Real-time PCR målt mRNA nivåer av SDF-1 i forhold til GAPDH. (F) HPS-19I celler og deres avledede celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer eller 10 nM av P4 i 24 timer. Real-time PCR målt mRNA nivåer av SDF-1 i forhold til GAPDH. Enveis ANOVA og etterfulgt av t-test beregner betydningen satt til P 0,01 som * og P . 0.001 som ***
hCAFs og deres avledet celler som uttrykker mock, PRA eller PRB ble behandlet med bærer, en (A) eller bærer, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 (B) i 24 timer. Sanntids-PCR målte mRNA-nivåer av IL-6 i forhold til GAPDH. (C) hCAFs og deres avledede celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer eller 10 nM av P4 i 24 timer. CM ble oppsamlet og anvendt for å måle IL-6 protein nivåer ved ELISA. WPMY-1-celler og deres avledede celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer, 1 nM, 10 nM og 100 nM av P4 (D) eller bærer, 10 nM av P4 og /eller 10 uM av RU486 (E) for 24 timer. Sanntids-PCR målte mRNA-nivåer av IL-6 i forhold til GAPDH. (F) HPS-19I celler og deres avledede celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer eller 10 nM av P4 i 24 timer. Sanntids-PCR målte mRNA-nivåer av IL-6 i forhold til GAPDH. Enveis ANOVA og t-test beregnet betydningen satt med P 0,01 som * og P . 0.001 som ***
For å bekrefte PR mediert direkte hemming til SDF-1 og IL- 6 genuttrykk, vi transient transfektert prostata stromale celler med siRNA mot PR (Fig.6A-B). Akutt PR knockdown dramatisk reverseres de inhiberende virkninger av PR til både SDF-1 og IL-6-mRNA-nivåer. I tillegg, PR som utøves dets hemmende effekter direkte til SDF-1 og IL-6 gen-transkripsjon og ikke krever annet proteinsyntese, som PR forble undertrykkende selv i nærvær av cykloheksimid behandling (Fig.6C-D). Vi utførte også kromatin immunoprecipitation analyse for å vise at histone acetylering nivåer på SDF-1 promoter-regionen ble dramatisk redusert i PR-positive stromale celler. Disse endringene var i motsetning til histone acetylering status på GAPDH promoter (Fig.6E). Sammen utgjør disse resultatene støtter at PR spiller en direkte rolle i å undertrykke promoter aktiviteter SDF-1 og IL-6 gener og hemmer deres gentranskripsjon.
WPMY-1 celler som uttrykker mock, PRA eller PRB ble transient transfektert med kontroll siRNA eller siRNA mot PR. SDF-1 (A) og IL-6 (B) mRNA-nivåer i forhold til GAPDH ble målt ved hjelp av sanntids-PCR. hCAFs som uttrykker mock, ble PRA eller PRB isoform behandlet med enten kontroll eller 20 pg /ml cykloheksimid i 16 timer. Real-Time PCR-analyser målt mRNA nivåer av SDF-1 (C) og IL-6 (D) i forhold til GAPDH. (E) WPMY-1-celler og deres avledede celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB behandlet med bærer eller 10 nM av P4 i 24 timer. Kromatin immunoutfellingsstudier analyser ble utført ved anvendelse av acetyl-Histone 3 antistoff. Eluerte DNA-fragmenter ble underkastet for å måle anrikning av acetyl-histon 3 nivåer i SDF-1 og GAPDH-promotorområdene. Enveis ANOVA og t-test beregnet betydningen satt med P 0,01 som * og P 0,001 s ***
For å vise at PR-mediert hemming av SDF-1. og IL-6 ekspresjon er den viktigste mekanisme som reduserer PCa celle invasjon og spredningsevne, har vi transient slått ned PR ekspresjon og observert migrasjons og invasjons forekomst av PC-3 (figur 7a-C) og C4-2B (fig. 7B-D) celler ble utvunnet. I tillegg, når rekombinant SDF-1 eller IL-6-peptid ble tilsatt til CM, observerte vi at eksogent SDF-1 eller IL-6 opphevet PR-undertrykkende virkninger på PC-3-celle invasjon (Fig.7E). Sammen disse resultatene støtter at PR-mediert undertrykkelse til PCa celle mobilitet er hovedsakelig gjennom å hemme SDF-1 og IL-6 genuttrykk.
WPMY-1 celler som uttrykker mock, ble PRA eller PRB transient transfektert med kontroll siRNA eller siRNA mot PR i 24 timer. Cellene ble vasket to ganger med PBS-buffer og etterfylles med serumfritt DMEM-medium i 48 timer. CM ble oppsamlet og inkubert med PC-3 (A og C) eller C4-2B (B og D) celler for cellemigrasjon analyser (A og B) og matrigel invasjons analyser (C og D) som beskrevet i Materialer og metode, avsnitt. (E) CM ble oppsamlet fra hCAFs i nærvær av kjøretøyet eller 10 nM av P4 og deretter blandet med kjøretøy, 10 ng /ml SDF-1 eller 10 ng /ml IL-6 og inkubert med PC-3-celler i Matrigel invasjon analyser. Enveis ANOVA og paret t-test beregner signifikansnivået satt til P 0,05 som * og P 0,001 s ***
Diskusjoner
Våre studier viser. at PR-proteinnivåer er redusert i kreft assosiert stroma og at PR utøver inhibitoriske virkninger for PCa cellemobilitet ved å modulere ekspresjonen av to viktige cytokiner, SDF-1 og IL-6. Disse observasjonene tyder på at redusert PR uttrykk i kreft assosiert stroma endrer balansert prostatamikromiljøet, noe som kan bidra til å PCa celle invasjon og metastasering.
Observasjonen at redusert PR uttrykk i kreft assosiert stroma er lik det som ble rapportert med andre steroidreseptorer som AR og ER-β [34] – [36], noe som tyder på et generelt prinsipp at tap av steroidreseptorer kan være nødvendig for prostata stroma å bli re-aktivert og å bygge en støttende mikromiljøet for PCa. I favorisere denne hypotesen, ble stromal AR vist seg å undertrykke PCa celleproliferasjon og invasjonen [37]. ER-β-agonist forbedret apoptose av prostata stromal og epitelceller i aromatase knock-out mus [38]. Selv om PR og AR dele høy homologi i deres DNA bindende domener, har genet microarray studier viste forskjellige gener profiler regulert av disse to reseptorer [31], [39]. Videre er PR uttrykt som to store isoformer med identisk DNA-bindende domener. Men regulere de forskjellige transkriptom. En forklaring kan være at PR utøver sin transkripsjonen aktivitet gjennom protein interaksjoner med andre transkripsjonsfaktorer [40], [41].
Den mekanismen som PR uttrykk nivåer er redusert i PCA celler er ukjent. Både intensiteten av PR-farging og prosenten av PR-positive kjerner er lavere i PCA vev. Siden ikke alle prostata stromal celler uttrykker PR, er det uklart om PR negative stromal cellepopulasjon blir dominerende, eller om PR-positive cellene mister sitt uttrykk i tumorprogresjon. Vår tidligere arbeid viste at PR-positive stromale celler proliferated mye tregere enn PR-negative celler [31]. Men det kan også være mulig at kreftceller kan utøve parakrine konsekvenser å re-aktivere prostata stromale celler ved å undertrykke deres PR uttrykk. Disse mulighetene er ikke ekskluderende for hverandre og kan sameksistere under utvikling av kreft.
IHC-analyser ble påført på hele monterings deler av prostatabiopsier, snarere enn vev microarray (TMA), for å måle stromale proteinmarkører. Den heterogenitet av prostata stroma krever flere områder per pasient lysbilde som skal analyseres av patolog. Dette er en viktig standard som ikke kan være fornøyd hvis du bruker TMA. På grunn av de små størrelsene av vev kjerner på TMA, er det teknisk vanskelig å fange representant paret godartet og kreft assosiert stroma og utføre patologisk sammenligning analyser.
ligand-uavhengige handlingene til PR på gentranskripsjon ble rapportert i flere studier [42], [43]. Både liganded og unliganded PR kan være lokalisert i cellekjernen, men i forskjellige sub-atom kamrene [44], [45]. Posttranslasjonelle modifikasjoner som fosforylering eller sumoylation bidrar også til PR aktivering i fravær av progestin [46]. Interessant nok har det nylig blitt rapportert at AR regulerer c-myc ekspresjonen ligand-uavhengig av hverandre, noe som bidrar til kastrering motstandsdyktig progresjon av PCa [47]. Disse funnene sammen tyder på at det kan være et bredere spekter av gener hvis ekspresjon er regulert av steroidreseptorer uavhengig til ligander.
