Abstract
Den kanoniske transient receptor potensial (TRPC) kanaler er Ca
2 + -permeable kationiske kanaler som kontrollerer Ca
2+ tilstrømningen fremkalt av G-protein-koblet reseptor aktivering og /eller av Ca
2 + butikken uttynning. Her undersøker vi involvering av TRPCs i celledifferensiering av lungekreft. Uttrykket av TRPCs og korrelasjonen til kreft differensiering karakter i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble analysert ved real-time PCR og farging bruker microarray fra 28 pasient lungekreft prøver. Foreningen av TRPCs med celledifferensiering ble også undersøkt i lungekreft cellelinjen A549 ved PCR og Western blotting. Kanalen aktivitet ble overvåket av Ca
2 + bildebehandling og patch opptak etter behandling med all
trans
-retinoic syre (ATRA). Ekspresjonen av TRPC1, 3, 4 og 6 ble korrelert til differensiering grad av NSCLC hos pasienter, men det var ingen korrelasjon til alder, kjønn, røyking historie og kreftcellelungetype. Atrå oppregulert TRPC3, TRPC4 og TRPC6 uttrykk og forbedret Ca
2 + tilstrømning i A549 celler, men viste Atrå ingen direkte effekt på TRPC kanaler. Hemming av TRPC kanaler ved pore-blokkerende antistoffer redusert celle mitose, som ble motvirket av kronisk behandling med Atrå. Blokade av TRPC kanaler hemmet A549 celleproliferasjon, mens overekspresjon av TRPCs økt spredning. Vi konkluderer med at TRPC uttrykk korrelerer til lungekreft differensiering. TRPCs formidle den farmakologiske effekten av Atrå og spiller viktige roller i regulering av lungekreft celledifferensiering og spredning, noe som gir en ny forståelse av lungekreft biologi og potensiell anti-kreft terapi
Citation. Jiang HN, Zeng B, Zhang Y, Daskoulidou N, Vifte H, Qu JM et al. (2013) Involvering av TRPC kanaler i Lung Cancer Cell Differensiering og korrelasjonsanalyse i Human Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10,1371 /journal.pone.0067637
Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA
mottatt: 25 januar 2013; Godkjent: 20 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddene fra Shanghai Leading talent Projects (nr 036, 2010) og Shuguang Tracking prosjekt Shanghai Education Committee (01SG06) (til JMQ); Leverhulme Trust Fellowship Award (til S.Z.X.); Foundation Natural Science of Shanghai (nr 09ZR1406100) og Shanghai Ledende akademisk disiplin Project (No. B115) (til H.N.J.). B.Z. ble støttet av Kina Scholarship Council og universitetet student. N.d. fikk 80-årsdag PhD student fra University of Hull. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om overlevelse har blitt forbedret siden innføringen av tredje generasjons antineoplastiske midler og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) tyrosinkinasehemmere, er lungekreft fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall i verden [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Derfor forstå patogenesen av lungekreft utvikling og identifisering av nye potensielle mål er viktig for terapeutisk strategiutvikling.
Ca
2+ er viktig i signal kaskader av tumorigenesis. Den forbigående reseptoren potensial (TRP) ionekanal familie har vært implisert i regulering av kreftvekst og progresjon via modulering av Ca
2+ tilstrømning og nedstrømssignalene inkludert gentranskripsjon [6], [7], [8] . Blant de seks underfamilier (TRPC, TRPM, TRPV, trpP, TRPML og TRPA) av TRP kanaler, har de kanoniske trps (TRPCs) blitt foreslått som protein tyrosin kinase eller G protein-koblede reseptor-opererte Ca
2 + kanaler ( ROCer) eller interne Ca
2 + butikk-opererte kanaler (SOC), som formidler Ca
2 + oppføring fremkalt av mange hormoner og vekstfaktorer. Derfor er inhibering av disse kanalaktivitet eller ekspresjon fører til funksjonelle endringer i kreftcellevekst, migrasjon, kolonidannelse og tumorvekst [6], [9]. Nylig har flere studier vist at det finnes TRPC i forskjellige typer kreftceller eller cancervev, såsom TRPC1, 3, 6 i bryst kreft MCF7 celler [10], [11] og leverkreft HepG2 celler [12], TRPC1, 3, 4 i prostata cancer LNCaP-celler [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 i nyrecellekarsinom [15], TRPC1, 3, 5, 6 i humane maligne gliomer [16], TRPC1, 3- 7 i neuroblastom IMR-32-celler [17], TRPC3 i humane astrocytom 1321N1-celler [18], TRPC6 i spiserøret og magekreft [19], TRPC1, 3, 4, 6 og deres spleisede varianter i eggstokk-kreft [9], [ ,,,0],20], og TRPC1, 4 i basalcellekreft [21]. Videre bevis fra
in vitro
forsøk har vist at overekspresjon av TRPC kanaler eller stillhet av genekspresjon med siRNA kan regulere celleproliferasjon eller celleoverlevelse, tyder disse genene er viktige i cancerbiologi [6], [9] [20].
uttrykk for TRPC1, 3, 4, 6 i lungekreft har blitt oppdaget [22], [23] og foreningen av TRPC3 uttrykk med prognosen av lunge adenokarsinom har blitt beskrevet [ ,,,0],23]. Men korrelasjonen av TRPC uttrykk med differensiering karakteren av lungekreft og den underliggende mekanismen er i stor grad ukjent. Her forsøkte vi å identifisere ekspresjonen av TRPCs i human lungekreft og bestemme rollene til TRPCs i reguleringen av kreftcelledifferensiering og proliferasjon ved hjelp av spesifikk TRPC kanalblokkerende antistoffer. Vi undersøkte også potensialet korrelasjon av TRPC uttrykk med kreft differensiering klasse, celletype og røyke ved real-time PCR og immunhistokjemi på lungekreftmicroarray. For ytterligere å undersøke forholdet mellom TRPC uttrykk med celledifferensiering, ATRA, en potent celledifferensiering induktor i mange celletyper, ble anvendt i en
in vitro
lungekreft cellemodell.
Materialer og Metoder
pasienter og lungevev Prøver
Tjueåtte åtte~~POS=HEADCOMP pasienter (17 menn og 11 kvinner) i alderen 61,1 ± 1,7 år med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ble rekruttert mellom november 2008 og desember 2009. Alle pasienter med NSCLC ble diagnostisert som iscenesatt klinisk i eller II lungekreft og fikk operasjon i Thoracic Surgery av Zhongshan Hospital. De støtteberettigede pasientene hadde tidligere ubehandlet, histologisk eller cytologisk bevist NSCLC. Pasientene fikk enten preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling ble ekskludert fra denne studien. Den lungekreft vevet og den normale lungevevet som omgir svulsten utover 2 cm i avstand ble oppnådd fra samme pasient. De snap-frosset vev ble brukt for mRNA analyse og formalinfiksert vev for immuocytochemistry studien. Prosjektet ble godkjent av etikkomiteen av Zhongshan Hospital i Fudan University, og pasientene gav skriftlig samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Lung Cancer microarray
lungekreft microarray var foretatt ved hjelp av formalin-fikserte cancervev [24]. Tissue kjerner med 2 mm i diameter ble samlet basert på visuell innretting med det tilsvarende hematoxylin og eosin (HE) farging. En kjerne av normalt lungevev og to kjerner av tumorvevet ble tatt fra hver pasient og er lagt inn i mottakerens parafinblokker. Vevssnittene med 5 mikrometer tykkelse ble anvendt for immunfarging. Alle prøvene på microarray ble undersøkt av en patolog med histologisk klassifisering og differensiering klasse ifølge WHO klassifisering [25].
Cells Kultur og Gene Transfeksjon
A549 cellelinje, en vanlig brukt lungekreft cellemodell utledet fra adenocarcinomic humane alveolare basale epitelceller, ble dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Paisley, UK) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin, og holdt ved 37 ° C under 95% luft og 5% CO
2. Human TRPC1, ble TRPC3 og TRPC6 amplifisert fra cDNA av human ovarial kreft celler og human TRPC4 ble amplifisert fra cDNA av humane endotelceller fra aorta med 100% identitet med sekvensene i Genbank (deponeringsnummer: X89066 (TRPC1); U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) og BC093660 (TRPC6). Den TRPC cDNA ble subklonet inn pcDNA3.1 eller pEGFP-C1 vektorer og deres funksjonelle uttrykket har blitt bekreftet som vi rapporterte [9]. A549 celler ble transfektert med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid cDNA i pcDNA3-vektoren ved hjelp av Lipofectamine2000 (Invitrogen). De transfekterte celler ble sådd ut i 48-brønners plate for eksperimentet.
Giemsa Farging, mitose og celleproliferasjon Assays
A549 cellene ble sådd ut i 3,5-cm skåler med en endelig tetthet på 4 x 10
4 celler pr tallerken. cellene ble behandlet med 1 pM ATRA eller kjøretøy. Dyrkningsmediet mediet~~POS=HEADCOMP ble etterfylles hver 24 timer. cellene ble fiksert med metanol i 10 minutter og farget med en 1:09 fortynnet arbeidsoppløsning Giemsa (Sigma) i PBS ved pH 6,5 i 45 minutter, og vasket med vann og lufttørket. De totale mobilnummer og mitotiske celler ble talt på bildene fotografert underkant av 200 × forstørrelse. Celleproliferasjon ble også bestemt ved bruk av WST-1-analysen (Roche, UK) [9].
RT-PCR og Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra human lunge og lungekreft vev eller A549-celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, UK). RNA ble kvantifisert med en nanophotometer (Implen, tysk). MRNA (1 pg) ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse Multiscribe Revers transkriptase (Applied Biosystems, USA) og tilfeldige primere (Promega, UK). Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp StepOne ™ Real-Time PCR System eller ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, UK). Primeren sett er designet tvers intron og sekvensene ble gitt i Tabell S1. Hver reaksjon inneholdt 1 x SYBR Universal Master Mix (Applied Biosystems) 10 pl cDNA en ul, og forover og bakover primere 1,5 mL hver. Det humane husholdningsgenet glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase GAPDH ble anvendt som en indre standard. Ikke-mal eller ikke-RT ble angitt som negativ kontroll. PCR-syklus bestod av en innledende syklus på 50 ° C i 2 minutter etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter, deretter 50 gjentatte sykluser av 95 ° C i 15 s, 54 ° C varmebehandlingstemperaturen i 30 s, og den primer-ekstensjon ved 72 ° C i 30 s.
antistoffer, Western blotting og Immunohistochemistry
Kanin polyklonale anti-TRPC antistoffer (T1E3, T5E3, T367E3 og T45E3) ble generert mot ekstracellulære tredje sløyfe (E3) region nær kanalen pore [26]. Spesifisiteten til E3-målrettet mot antistoffer ble testet ved hjelp av ELISA, Western blotting og funksjonelle analyser, og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) [9], [26]. Fremgangsmåten for Western blotting er blitt beskrevet tidligere [26]. I korthet ble cellene lysert i RIPA-buffer (Sigma-Aldrich, Poole, UK), og proteinene ble separert på 10% SDS-PAGE-gel før de overføres på nitrocellulose-membran. Blottet ble inkubert med kanin-anti-TRPC antistoffer (1:200) over natten ved 4 ° C, vasket med fosfatbuffret saltvann (PBS) og inkubert med geite-anti-kanin-IgG-HRP ved 1:2000 fortynning (Sigma). Kanin-anti-β-aktin (Santa Cruz Biotech, USA) ved 1:400 fortynning ble anvendt som en indre standard for protein kvantifisering. Visualisering ble utført med ECLplus gjenkjenning reagenser (GE Healthcare, UK) og eksponering for X-ray filmer. Kvantifiseringen ble analysert ved bruk av bilde J programvare (NIH, USA). Den farging prosedyre var lik våre rapporter [9], [27] og Vectastain ABC system (Vector Laboratories, Peterborough, UK) ble brukt. Kanin-anti-TRPC1, 3, 4 og 6 antistoffer kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK) ble anvendt for humant lungevev og lungekreft seksjon farging. Fargingen Kvantifiseringen ble vurdert ved å utføre positive fargede celler og fargeintensitet rangert som 0 (negativ), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk) [28].
Hel-celle Patch Clamp
hele cellen strømninger ble registrert med Axoclamp 2B eller Axopatch B200 patch clamp forsterker og kontrollert med pClamp 10 programvare. Prosedyrene for opptak TRPC strømninger var lik våre tidligere rapporter [29], [30]. En 1-s rampespenningsprotokoll fra -100 mV til 100 mV ble tilført ved en frekvens på 0,2 Hz fra et holdepotensial fra 0 mV. Signalene ble samplet på 3 kHz og filtrert ved 1 kHz. Den glassmikroelektrode med en motstand på 3-5 Megohm ble anvendt. Den 200 nM Ca
2 + pipette-løsning (115 CsCl, 10 EGTA, 2 MgCl
2, 10 HEPES, og 5,7 CaCl
2 i mM, pH ble justert til 7,2 med CsOH og osmolariteten ble justert å ~290 mOsm med mannitol). Den beregnede gratis Ca
2 + var 200 nM ved hjelp EQCAL (Biosoft, Cambridge, UK). Standard badløsning inneholdt (mM): 130 NaCl, 5 KCI, 8 D-glukose, 10 HEPES, 1,2 MgCl
2 og 1,5 CaCl
2. PH ble justert til 7,4 med NaOH. Eksperimentet ble utført ved romtemperatur (23-25 ° C).
Ca
2 + Imaging
A549 celler ble lastet med to mikrometer Fura-PE3 AM ved 37 ° C for 30 minutter i Ca
2 + -fri bad løsning, etterfulgt av en 20 minutters vask i vanlig bad oppløsning ved romtemperatur. Fura-PE3 fluorescens ble overvåket med en invertert epifluorescens mikroskop (Nikon Ti-E, Japan). En xenon buelampe tilgjengelig eksitasjonslys, bølgelengden som ble valgt av et Nikon avbildningssystem styrt av NIS Elements 3.0 programvare. Dual bølgelengde spent på 340 nm og 380 nm ble brukt for Fura-PE3 fluorescens og utslipp ble samlet via en 510-nm filter og fotografert av Orca-R2 CCD-kamera (Hamamatsu, Japan). Forholdet Ca
2+ fargestoff fluorescens ved F
340 /F
380 bølgelengde ble målt i [30]. Alle forsøkene ble utført ved romtemperatur.
reagenser og kjemikalier
Alle de generelle salter ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Poole, UK). Gadolinium-klorid (Gd
3+), 2-aminoethoxydiphenyl borat (2-APB), trypsin, all
trans
retinsyre (ATRA), og PCR-primere ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich, og Fura -PE3 AM var fra Invitrogen (Paisley, UK).
statistikker
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM Den statistiske signifikans ble analysert ved hjelp av ANOVA og forskjellen mellom gruppene ble vurdert med Dunnetts
t
-test i SPSS programvare. Elevens
t
test ble brukt for to gruppe sammenligning. Den Ridit analysen ble brukt til semikvantitative data for farging eksperiment.
P
verdi. 0,05 ble ansett betydning
Resultater
Expression of TRPCs i Lung Cancer
uttrykk for TRPCs i normal menneskelig lunge og lungekreft vev ble undersøkt ved immunfarging (fig. 1A). I normale lunge vevssnitt ble alveolære epitelceller farget med anti-TRPC1 og anti-TRPC6 antistoffer, men farging for TRPC3 og TRPC4 var negative eller svært svak. I lunge plateepitelkarsinom seksjoner ble plateepitel celler sterkt farget med anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 og anti-TRPC6 antistoffer. Tilsvarende positiv farging for TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 ble også sett i lunge adenocardionoma seksjoner. Ved hjelp av real-time PCR, kvantifisert vi uttrykk for TRPCs i normale lunge og kreft vev. Den mRNA fra TRPC1, 3, 4 og 6 ble påvist i både normale lunge og lungekreft vev. Ekspresjonsnivået av TRPC1 og TRPC6 var mye høyere enn for TRPC3 og TRPC4. De mRNA for TRPC5 og TRPC7 var umulig å oppdage i normale og lungekreft vev (Fig. 1B-C). Disse data tyder på eksistensen av TRPC1, 3, 4, 6-isoformer i NSCLC.
A, Eksempler på normalt humant lunge (
n
= 20) og lungekreft vevssnitt (
n
= 28), inkludert adenokarsinom (AC) og plateepitelkarsinom (SCC) ble farget med anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 og anti-TRPC6 antistoffer ved hjelp Vectastain ABC system. Den positive farging ble vist som brun farge. Kjernene ble kontra farget av hematoxylin. B mRNA ble detektert ved sanntids-PCR i normalt lungevev ved å bruke primerne i tabell S1. GAPDH ble brukt som intern vaktmester genet kontroll for kvantifisering (
n
= 25 pasienter for TRPC1, 4, 5 og 6 grupper;
n
= 24 for TRPC3, og
n =
9 for TRPC7). C, mRNA nivåer i lungekreft vev (AC:
n
= 9-15; SCC:
n
= 8-11)
Korrelasjonen av. TRPC Expression til kreft Differensiering Grade
forskjellen i mRNA nivåer mellom kreft differensiering karakterer, celletyper, røyker og ikke-røyker ble oppdaget av real-time PCR. Ekspresjonen av TRPC1, 3, 4 og 6 kanaler var signifikant lavere i dårlig differensiert lungekreft enn i den godt moderat differensiert gruppe (Fig. 2A, se også Tabell S2). Men det var ingen signifikant forskjell mellom de røyker og ikke-røyker grupper (Fig. 2B). Lineær multivariance regresjonsanalyse viste også en negativ korrelasjon av mRNA uttrykk for TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 til lungekreft differensiering klasse med standardiserte β koeffisienten sekvens av TRPC1 (-0,563) TRPC4 (-0,360) TRPC6 (0,271 ) og TRPC3 (-0,057), respektivt. Trinnvis regresjon viste at TRPC1 var en betydelig variabel (P 0,01)., Men korrelasjonen av kreft differensiering karakter til kjønn, alder, røyking, og kreftcelletype var ikke signifikant
A, mRNA-ekspresjon av TRPCs i lungekreft vev med godt moderat (grad II (
n
= 17) og klasse III (
n
= 6)) eller dårlig (grad IV,
n
= 5) differensiering karakteren ble oppdaget av real-time PCR. GAPDH ble brukt som husholdningsgenet kontroll. B, mRNA uttrykk for TRPCs i lungekreft vev oppnådd fra røyker (20 sigaretter per dag for mer enn 10 år,
n
= 11) og ikke-røyker (
n
= 17 ). C, Eksempel på to microarray med normal lunge (N) og lungekreft (C) etiketter ble farget med anti-TRPC1 antistoff. Den celletype og differensiering karakteren av hver del var preget av HE-farging. De to eksempler (11C og 9C) med godt differensiert adenokarsinom ble vist i innfellinger. Korrelasjonen av fargeintensitet til andre faktorer ble vist i tabellen, og signifikans ble vurdert ved Ridit analyse. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
. 0,001
Vi har også undersøkt sammenhengen av lungekreft differensiering klasse til de TRPC protein uttrykk nivåer ved hjelp av semikvantitativ farging. To microarray med 20 normale lungevev og 28 NSCLC prøver inkludert 15 tilfeller med adenokarsinom, 11 tilfeller med plateepitelkarsinom, og 2 tilfeller med blandede celletyper adenosquamous karsinom ble bygget (Fig. 2C). Lungekreft celletype ble bekreftet ved HE-farging. Den TRPC1, TRPC3, og TRPC6 i de tilstøtende mikromatrise vevssnittene ble sterkt farget med anti-TRPC1, 3, og 6 antistoffer med en prosentandel av positivt farget kreft deler av 71,4%, 75,0% og 71,4%, henholdsvis, mens mild farging var ses for TRPC4 med en positiv farging prosentandel på 32,1%. For normale lungeseksjoner på mikromatriser, er positiv farging prosent for TRPC1, 3, 4 og 6 var 70%, 70%, 45% og 85%, respektivt. Den Ridit Analysen viste at fargeintensitet av TRPC1 var forbundet med differensiering karakter (Fig. 2C). Imidlertid lineær regresjonsanalyse multivariance viste ingen signifikant korrelasjon av de protein fargings score til TRPC til lungekreft differensiering karakter, celletype, røyking, alder og kjønn.
Oppregulering av TRPC Expression ved kronisk behandling med ATRA
TRPC1, 3, 4 og 6 ble påvist i A549-celler, men TRPC5 og TRPC7 var umulig å oppdage selv om primersettene for TRPC5 og TRPC7 kan forsterke mRNA isolert fra hjerne eller HepG2-celler (fig. 3A). De to TRPC1 bånd i gelen var a og p-isoformer, og båndene for TRPC4 var α, β, γ og S-isoformene, henholdsvis, som vi beskrevet i eggstokkreft celler [9]. De mRNA og proteinnivåer for TRPC3, TRPC4 og TRPC6 ble betydelig økt ved kronisk behandling med en mikrometer Atrå i 96 timer (fig. 3B-C), derimot, forskrift om TRPC1 uttrykk var ikke signifikant. Disse data antyder videre at ekspresjon av enkelte TRPC isoformer er assosiert med celledifferensiering.
A, ble mRNA fra TRPC1, 3, 4 og 6 påvist i A549-celler ved RT-PCR ved anvendelse av primeren angitt i tabell S1. PCR-band for TRPC5 og TRPC7 var negative i A549 celler, men positiv i menneskets hjerne eller HepG2. B, ble mRNA detektert ved real-time PCR i A549 celler behandlet med all
trans
retinsyre (ATRA, 1 mm) i 96 timer. Den β-aktin ble benyttet som en husholdningsgenet for relativ kvantifisering. De 2
(- ΔΔCt) metoden ble brukt for beregningen. C, De TRPC proteiner ble kvantifisert ved Western blotting ved anvendelse av anti-TRPC1 (T1E3), anti-TRPC3, anti-TRPC4 (T45E3) og anti-TRPC6 antistoffer. Anti-β-actin antistoff ble brukt for relativ protein kvantifisering (
n
= 3 uavhengige eksperimenter og hvert forsøk med triplikatprøvene).
Effekter av Atrå om Ca
2 + Slipp og Tilstrømningen i A549-celler og TRPC Kanal aktivitet
A549 celler ble kronisk behandlet med ATRA (1 mm) for 4 dager med hver 24-timers forfriskninger av cellekulturmedium. Dynamikken i intracellulær Ca
2+ ble overvåket av Fura-PE3 /AM. Trypsin på 0,2 nM induserte en robust Ca
2+ utgivelse i Ca
2 + gratis løsning, som ble etterfulgt av en andre Ca
2 + topp i A549 celler. Perfusjon med 1,5 mM Ca
2+ etter butikk-uttømming med trypsin økte Ca
2 + tilstrømning i Atrå-behandlede celler (fig. 4A-B), noe som tyder på kronisk behandling med Atrå forbedret Ca
2+ tilstrømning, men hadde ingen effekt på den Ca
2+ frigjøringssignal. Ved hjelp av hel-celle-patch opptak, ble strømmen av A549-celler ikke endres av akutt perfusjon med ATRA (Fig. 4C-E). For å undersøke potensialet direkte effekt av Atrå på TRPC kanaler, ble HEK-293 celler indusere uttrykking TRPCs brukt for helcelle patch opptak. Strømmene i TRPC3, 6 og TRPC4 strømninger ble aktivert av trypsin eller Gd henholdsvis
3+ (100 mm). Den nåværende spenning forhold (
IV
) kurver for disse strømmene var lik vår forrige rapport [29]. Atrå 1 mikrometer og 10 mikrometer hadde ingen stimulerende eller blokkerende effekt på disse kanalene, men alle disse strømmene ble blokkert av TRPC blocker 2-APB, noe som tyder på at Atrå hadde ingen akutt direkte effekt på Ca
2 + strøm eller Ca
2+ tilstrømning gjennom TRPC kanaler (fig. 4F-I). Den kroniske styrking av Ca
2+ tilstrømning i Atrå behandlet A549 celler kan utelukkende bidratt med TRPC genet oppregulering.
A, A549 celler ble lastet med to mikrometer Fura-PE3 /AM og Ca
2+ ble målt som forholdet (F
340 /F
380) av Ca
2 + fargestoff fluorescens. Ca
2 + utgivelsen ble fremkalt av trypsin (0,2 nM) og Ca
2 + tilstrømningen ble introdusert av 1,5 mM Ca
2+ i perfusjon løsning. Cellene ble inkubert med 1 pM ATRA i 96 timer og kontrollcellene ble inkubert med samme volum bærer. B, Mean ± standardavvik data for Ca
2+ inngang når lageret uttømming av trypsin som vist i (A).
n
= 21-32 for hver gruppe, ***
P
0,001. C, Whole-celle strømmer samplet ved ledespenning på ± 80 mV i A549-celler før og etter perfusjon med ATRA (1 uM), trypsin (0,2 nM) og 2-APB (100 uM). D,
IV
kurver for (C). E, Midlere data for effekten av ATRA. F-H, Effekt av Atrå på hel-celle strømmer av TRPC3, TRPC4 og TRPC6 i HEK293 celler som overuttrykker individuelle TRPC isoformer. Jeg mener ± standardavvik data målt ved -80 mV, og
n =
4-6 for hver gruppe.
Cell Differensiering Regulert av TRPC Kanal aktivitet
differensiering av A549 lunge kreftceller ble vurdert ved Giemsa-farging som kan visualisere kromosomer. Cell med atom mitose vises mørk blå kjerne eller tvilling atomkjerner flekker (Fig. 5). ATRA (1 uM) i betydelig grad hemmet celle mitose ved 24 timer og 48 timer cellekultur. Prosentandelen av mitotiske celler ble mindre etter 72 timer og 96 timer cellekultur og forskjellen mellom de to gruppene viste ingen betydning (Fig. 5B). Tapet av statistisk forskjell etter 72 timer cellekultur kan være grunn til celle-kontakt-inhibering som forekom i de konfluente cellene etter 3 til 4 dager cellekultur. Derfor vurderte vi effekten av TRPC kanalblokkere på mitose innen 48-timers kultur. Spesifisitet og funksjonen av TRPC pore blokkerende antistoffer er blitt vist i tidligere studier [9], [31], [32], [33]. Hemming av TRPC1, TRPC3 og TRPC6 kanaler ved T1E3 og T367E3 antistoffer vesentlig hemmet mitose, mens effekten av T1E3 og T367E3 viste mindre effektiv etter behandling med Atrå sammenligne gruppene behandlet med kokt antistoff eller gruppen uten tillegg av antistoff.
A Eksempel Giemsa-farging av A549-celler, og behandlingen med eller uten ATRA i 0-96 timer. Mitotiske celler ble angitt med pil. B, Andel mitotiske celler i kontroll og Atrå-behandlede grupper (
n
= 32-40 mikroskopiske felt for hver gruppe inneholder 6 kultur retter, ***
P
0,001). C, Effekt av TRPC kanalblokkerende antistoffer på celle mitose. Mediet uten antistoff (No-Ab) og kokt antistoff (Kokte-Ab) som kontroller (
n
= 18 mikroskopiske felt fra 6 kultur brønner for hver gruppe, NS: ikke-signifikant, *
P
0,05, og **
P
0,01). De delta (Δ) endringer i Atrå-indusert hemming ble også sammenlignet mellom kokt-Ab (Control) og blokkerer antistoff behandlet grupper.
TRPC Channel og A549 Cell Proliferation
Cell differensiering og spredning er to nært beslektede cellulære prosesser, derfor har vi også observert effekt av TRPC kanal aktivitet på A549 celleproliferasjon. Celletallet ble økt med ~ 8-folder etter 96-timers cellekultur. ATRA (1 uM) vesentlig hemmet celleproliferasjon etter 72-timers og 96-timers cellekulturer (fig. 6A), noe som tyder på at virkningen av ATRA på celleproliferasjon er en langsom prosess-angrep. Imidlertid er anti-proliferativ effekt ved å blokkere TRPC kanal aktivitet var mye raskere og signifikant forskjell ble oppnådd innen 24 timer etter inkubering med 2-APB, en ikke-selektiv TRPC kanalblokkeren. EF
50 for to-APB var 87,9 mikrometer (Fig. 6B). Ved hjelp av de blokkerende antistoffene T1E3 og T367E3 spesifikt blokkere TRPC1 og TRPC3 /6 i A549-celler også hemmet proliferasjonen av cellene uten ATRA-behandling, men den hemmende effekten var mer uttalt når cellene ble behandlet med 1 pM ATRA i 48 timer (figur . 6C), noe som tyder på at aktiviteten til TRPC kanal kan forsterkes ved Atrå. For ytterligere å demonstrere involvering av TRPC kanaler i lungecancer celleproliferasjon, ble A549-celler transfektert med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid cDNA. Celleformering ble øket i A549-celler som overuttrykker TRPC1 og TRPC6, men ikke vesentlig for cellene som overuttrykker TRPC3 og TRPC4 (fig. 6D). Disse resultatene indikerer at lungekreft celleproliferasjon reguleres av aktiviteten av TRPC kanaler.
A, tidsforløpet for effekten av ATRA på A549 celleformering. B, ble A549-celler inkubert med 2-APB ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer (
n
= 8 brønner for hver grupper) og celleproliferasjon ble analysert ved WST-1-celleproliferasjonsanalyse kit. C, A549-celler behandlet med spesifikk E3-måls TRPC blokkerende antistoffer eller kombinasjon med ATRA i 48 timer (
n
= 6-7 for hver gruppe, sammenlignet med kontrollgruppen (
#), * eller
#
P
0,05, ** eller
##
P
0,01). D, A549 celleformering ble undersøkt ved WST-1 etter transfeksjon med TRPC1, 3, 4, og 6 plasmid-cDNA-er i 48 timer (
n
= 8 for hver gruppe, **
P
. 0,01)
Diskusjoner
i denne studien har vi vist at TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 eksisterer i human lungekreft inkludert adenokarsinom, plateepitelkarsinom og adenokarsinom-avledet cellelinje A549. Ekspresjonsnivået av TRPC kanaler er korrelert til differensiering grad av lungekreft. Atrå oppregulerer TRPC genuttrykk i A549 celler. Hemming av TRPC kanal aktivitet viser antiproliferativ effekt. Disse funnene er viktige for å forstå rollene TRPC kanaler i lungekreft celledifferensiering og spredning.
TRPC kanaler er påvist i mange vev [32], [34], [35], [36] inkludert kreft vev, som for eksempel brystkreft [37], eggstokk-kreft [9], [20], hepatom [12], prostatakreft [13], basalcellekarsinom [21], nyrecellekarsinom [15], maligne gliomer [16] , glioblastom [8], og gastriske tumorer [19]. Ekspresjonsnivået av hver TRPC isoform i forskjellige typer av kreftceller eller vev er variabel, noe som tyder på at bidraget eller biologiske viktigheten av hver TRPC isoform i forskjellige krefttype kan være forskjellig. For eksempel er ekspresjon av TRPC7 negativ i A549 og SKOV-3, men positiv i HepG2-celler i denne undersøkelsen og de differensierte neuroblastom-celler [17]. Dessuten kan de alternative skjøtes varianter også bidra til funksjonaliteten TRPC kanaler, for eksempel TRPC1 og TRPC4 skjøtes isoformer i eggstokkreft SKOV3 celler [9]. I tillegg kan ekspresjonsnivået av TRPC kanaler avhengig av differensiering status for kreftceller, fordi vi har funnet at mRNA-ekspresjon av TRPC1, TRPC3, TRPC4 og TRPC6 i lav differensiering karakter lungekreft var lavere enn det i den godt differensiert cancer , som er konsistent i vår observasjon i eggstokkreft [9] og det lave nivået uttrykk for TRPC4 og TRPC6 i umodne stamceller [38]. Selv om våre data viste at mRNA-nivåene av TRPCs i normal lunge var høyere enn det i lungekreft, er det vanskelig å gjøre en slik sammenligning på grunn av variasjon av celletyper, fordi de normale lungeprøver inneholder mye mer ikke-epiteliale celler enn det i de faste tumorprøver, for eksempel vaskulære celler, alveolære makrofager, fibroblaster, og blodceller. Den farging på lungekreftmicroarray viste mindre signifikant, noe som kan skyldes den lave følsomhet av metodikk sammenlignet med den høye følsomheten til real-time PCR.
