Abstract
Kreft og behandlinger kan indusere kognitive svekkelser i kreftpasienter, og årsakssammenheng mellom kjemoterapi og kognitive dysfunksjoner ble nylig godkjent i dyremodeller. Nye kreft målrettet behandling har blitt mye brukt, og deres innvirkning på hjernens funksjoner og livskvalitet må utforskes. Vi evaluerte effekten av everolimus, et antikreftmiddel rettet mot mTOR vei, på kognitive funksjoner, cerebral metabolisme og hippocampus celledeling /vaskulær tetthet i mus. Voksne mus mottok everolimus daglig i 2 uker, og adferdstester ble utført fra en uke etter siste behandling. Everolimus-behandlede mus viste en markert reduksjon i vektøkning fra den siste dagen i behandlingsperioden.
Ex vivo
analyse viste forandret cytokromoksydase aktivitet i selektiv cerebral regioner involvert i energibalanse, matinntak, belønning, læring og hukommelse modulasjon, søvn /våkne syklus regulering, og opphisselse. Som kjemoterapi, fikk everolimus ikke endre emosjonelle reaktivitet, læring og hukommelse forestillinger, men i motsetning til kjemoterapi, ikke påvirker atferds fleksibilitet eller reaktivitet til nyhet.
In vivo
hippocampus nervecellevekst og vaskulær tetthet var også uendret etter everolimus behandlinger. I konklusjonen, gjorde to uker daglig everolimus behandling ved klinisk dose ikke fremkalle endring av kognitive prestasjoner vurderes i hippocampal- og prefrontal cortex avhengige oppgaver som ville vedvare i én til fire uker etter avsluttet behandling ferdigstillelse. Men akutt everolimus behandling forårsaket selektive CO modifikasjoner uten å endre mTOR effektor P70S6 kinase i cerebral regioner involvert i fôring atferd og /eller sove /våkne syklus, i hvert fall delvis under kontroll av den ensomme kjernen og parasubthalamic regionen i hypothalamus. Dermed kan dette området representerer et viktig mål for everolimus-medier perifere modifikasjoner, som tidligere har vært forbundet med symptomer som vekttap og tretthet
Citation. Dubois M, Le Joncour V, Tonon MC, Anouar Y , Proust F, Morin F, et al. (2014) Evaluering av virkningen av kreftbehandling Everolimus på sentralnervesystemet hos mus. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10,1371 /journal.pone.0113533
Editor: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA
mottatt: 17 april 2014; Godkjent: 24 oktober 2014; Publisert: 01.12.2014
Copyright: © 2014 Dubois et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av universitetet i Roue, Inserm og Baclesse sentrum motta støtte av Novartis (Novartis) 071160-001141-05. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikt: The Grant til baclesse Center of Caen, Frankrike, etter Novartis (Novartis- 071160-31 001141-05) var en generell pedagogisk stipend og ble brukt til å støtte en post-doc ledende forskning på everolimus. I tillegg til forfatterne har mottatt everolimus og mikroemulsjonen gjennom en MTA med Novartis. Pr Florence Joly er medlem av et konsulent vitenskapelig styret i Novartis. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Selv om fremveksten av potente legemidler mot kreft har bedret pasientens overlevelse, er det økende bevis for at både kreft og dens behandling kan indusere kognitive dysfunksjoner som påvirker daglige livskvalitet. Pasienter som får kjemoterapi rapport oppmerksomhet og konsentrasjon endringer, visuelle og verbale hukommelsessvikt, og demping av psykomotorisk behandling (referert til som «chemofog» eller «chemobrain») som kan vedvare i flere år etter fullført behandling [1]. I de senere årene har målrettede midler blitt stadig mer brukt i kreftbehandling, og tidligere rapporter tyder på at noen av dem kan trenge blod-hjernebarrieren og handle direkte i hjernen, påvirker cerebral angiogenese og fungerende [2]. I samsvar med denne hypotesen, administrasjon av bevacizumab ved metastatisk kolorektalcancer og sunitinib hos pasienter med metastatisk nyrekreft resulterte i flere rapporterte tilfeller av posterior leukoencefalopati [3], [4]. Videre kan en uforklarlig tretthet eller asteni, assosiert med målrettede kreft behandlinger, som ikke kan motvirkes ved hvile eller sove alvorlig påvirke både kognitiv funksjon og livskvalitet [5].
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K ) /AKT /pattedyr-target av rapamycin (mTOR) signalkaskade er en nøkkel molekylære mål for kreftbehandling [6]. mTOR signalkomponenter blir uttrykt ved høye nivåer i flere områder av hjernen [7], [8], og den mTOR-reaksjonsveien er kjent for å være involvert i forskjellige nevrobiologiske prosesser, herunder neurittutvekst [9], axon regenerering [10], myelination [11], og cellulær metabolisme [12]. Spesielt har mTOR vist seg å være en sentral regulator av cellevekst og styres av et stort antall signaler inkludert næringsstoffer som glukose og aminosyrer, og vekstfaktorer slik som insulin og IGF-1. mTOR-aktivering stimulerer også proteinsyntese og cellulær hypertrofi i forskjellige celler og organer. I tillegg er mTOR aktivering involvert i hippocampus synaptisk plastisitet og lærings- og hukommelsesprosesser
via
proteinsyntese [13]. For eksempel, har inhibering av mTOR-aktivitet av rapamycin har vist seg å blokkere hemmende unngåelse langtidshukommelse [14], og til å svekke auditiv [15], frykt [16], [17], og romlig hukommelse konsolidering [18]. Videre genetiske defekter i Ras /Erk /PI3K /mTOR signalveier kan være årsaks knyttet til flere menneskelige genetiske sykdommer klassifisert som nevro-cardio-facial-kutane og hamartoma syndromer, og dermed kan være ansvarlig for kognitive svekkelser [19]. Dermed kan det bli foreslått at langsiktig forvaltning av mTOR-hemmere som forekommer i kreftbehandling kan påvirke hjernens funksjoner involvert i kognisjon og /eller metabolisme.
Everolimus (Afinitor, Novartis, Basel, Sveits), en oralt administrert rapamycinderivat, direkte blokkerer kinase aktiviteten av raptor /mTOR-kompleks (mTORC1)
via
binding til FKBP-12 og således danner en inhibitorisk kompleks med mTOR [20]. Denne typen mTOR-hemmer er godt preget for antineoplastiske egenskaper,
dvs.
indusere reduksjon av tumorcellevekst, spredning og angiogenese
in vitro Hotell og
in vivo product: [ ,,,0],21] – [23]. Imidlertid generelle bivirkninger som tretthet, ødem, asteni, pyreksi, slimhinnebetennelse, anoreksi, vekttap og smerte har blitt rapportert [24] – [27]. Mer spesifikt, har sentralnervesystemet (CNS) bivirkninger som hodepine /migrene eller smaksforstyrrelser, er også beskrevet [26].
Målet med studien var å evaluere potensialet kognitiv funksjon-svekkelse sannsynlig å bli indusert av målrettet terapi som everolimus ved hjelp av en validert mus atferdsmodellen [28]. Vi har spesielt fått oppmerksomhet i den dosen som brukes for å være så mye som mulig i de kreftpasientbehandlingsbetingelsene. Faktisk, basert på farmakokinetiske /dynamiske studier [29] – [31] den best tilpassede og indikerte dose i den avanserte hormonreseptor-positiv, HER2-negativ brystkreft, avanserte nevroendokrine svulster i bukspyttkjertelen opprinnelse, avansert nyrecellekreft, nyre angiomyolipoma med tuberøs sklerosekompleks (TSC) er 10 mg /daglig, men i tilfelle av forgiftning, er den anbefalte dosen 5 mg /daglig. Dessuten ble en rekke studier utført i dyremodeller med denne 5 mg /daglig administrering [22], [32], [33], og studier har vist at dette everolimus dosen er oralt aktiv i mus, og at steady state oppnådd i løpet av to uker med daglig dosering [22]. Dette 5 mg /kg /d planen synes å være minimal konsentrasjon for maksimal effektiv dose uten åpenbar toksisitet.
De potensielle langvarige effekter av everolimus behandling på mus kognisjon og nevrobiologiske prosesser ble evaluert ved hjelp hippocampal- og frontal cortex avhengig atferds oppgaver og på hippocampus celleproliferasjon, eller vaskulær nisje tetthet hhv. Dens akutt påvirkning på nervecelleaktivitet ble undersøkt
ex vivo via
vurdering av regional hjernen cytokromoksydase aktivitet.
Materiale og metode
Dyr og etikk uttalelser
Mann C57BL /6J Rj mus (Janvier, Le Genest Saint Isle, Frankrike) 7 ukers alder ble plassert under kontrollerte standard miljøforhold: 22 ± 1 ° C; 5 dyr per bur; 12 timer /12 timer lys /mørke syklus (lys på 00:00); vann og mat tilgjengelig
ad libitum
. I løpet av 2 uker prøveperioden ble dyrene håndteres daglig i vekt overvåking. Behandling administrasjon begynte da musene var 9 uker gammel. Musene ble veid daglig fra dag av den første behandlings inntak til den 36. dagen etter den siste administrasjonen. Vekten av dyrene før den første injeksjon (D0) ble brukt som grunnlag for å beregne verdien vektøkning under hele eksperimentet. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med den franske Etisk Komité samt retningslinjene i Europaparlamentet direktiv 2010/63 /EU og Rådet for beskyttelse av dyr brukt til vitenskapelige formål. Dette prosjektet ble godkjent av «Comité d’Ethique Normandie en MATIERE d’eksperimentering Animale» CENOMEXA under National Committee om forsøk med dyr, og mottok følgende nummer N /12-11-12 /35 /11-17. Animal manipulasjoner ble utført under oppsyn av en autorisert etterforsker (H. Castel;. Autorisasjon uten 76,98 fra Ministère de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche)
Drug Administration
.
mikroemulsjon av everolimus formulert ved 2% (vekt /volum), levert av Novartis (Rueil-Malmaison, Frankrike), ble oppløst i 0,9% NaCl og administrert daglig ved oral føring (5 ml /kg)
via
en fôring nål (fine Science Verktøy, Heidelberg, Tyskland) ved 5 mg /kg i 14 sammenhengende dager [34].
cytokromoksydase aktivitet og hjernens metabolisme
Mus som fikk bilen (
n
= 8) eller everolimus (
n
= 9) i løpet av 2 uker ble umiddelbart avlivet etter den siste dag av behandlingen for å studere cytokrom oksidase-aktivitet i forskjellige hjerneregioner. Musene ble bedøvet ved hjelp av isofluorane, halshugget, og hjernene hurtig fjernet 24 timer etter den siste dag av behandlingen, frosset i 2-metylbutan (Sigma-Aldrich, San-Quentin Fallavier, Frankrike) ved -30 ° C og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kryostatsnitt, hver 30 mikrometer tykke, ble kuttet fra bregma +3.20 mm til -6,48 mm og lagret ved -20 ° C inntil behandling. For hvert dyr, ble 8 grupper på 41 på hverandre følgende skiver tatt, for eksempel på en lysbilde 2 seksjoner ble separert ved 240 um.
Alle hjernesnitt av en batch pr dyr ble behandlet samtidig under de samme betingelser. Protokollen ble tilpasset fra tidligere publikasjoner [35], [36]. Seksjoner ble inkubert i mørket (37 ° C, 50 minutter) i 0,1 M fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 120 mg hest-hjerte cytokrom c, 24 g sukrose, 300 mg DAB-4-HCl, og 108 mg katalase ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) per 540 ml. Skivene ble vasket (5 min) med kald buffer (10% sukrose i PBS), nedsenket i 30 minutter i en 10% formalin /bufferoppløsning, og vasket to ganger (5 minutter) i buffer før dehydrering. Seksjonene ble deretter dekke-gled med Histokit (VWR International, Strasbourg, Frankrike) og mikroskopisk undersøkt.
Produktet av histokjemisk reaksjon (oksidert DAB) var synlig med optisk mikroskopi. I hvert område av interesse, var dens fargeintensitet målt ved densitometrisk analyse ved hjelp av en datamaskin-assistert bildeanalyse arbeidsstasjon (SAMBA Technologies, Meylan, Frankrike) [37]. For hvert område er undersøkt, ble et minimum på 2 stykker per dyr benyttes, avhengig av den anteroposteriore lengden av regionen, med målinger utført bilateralt når det er mulig. Bakgrunnen ble trukket for hvert lysbilde. De forskjellige cerebral regioner ble identifisert ved hjelp av Franklin og Paxinos [38] musen hjerneatlas.
Behavioral testing
Totalt 14 mus fikk everolimus behandling og 12 mus fikk løsemiddel (kjøretøy gruppe) i løpet av 2 uker. Behavioral testing begynte 7 dager etter den siste behandlingen administrering og varte i 23 dager (fig. S3A). Alle eksperimenter ble utført 13:00 til 18:00, i begynnelsen av dyrenes aktiv fase.
kognitive funksjoner ble evaluert ved bruk av Morris vannlabyrint, hvori mus er nødvendig for å unnslippe fra en vannbeholder ved å finne en plattform plassert i bassenget [39]. En sylindrisk tank (diameter 93 cm, høyde 45 cm) ble fylt med vann (opprettholdt ved 23 ± 1 ° C) til en høyde på 40 cm, gjort ugjennomsiktige med hvit, inert, vandig akrylemulsjon (Accusol OP 301, Viewpoint, Frankrike ). Tanken ble plassert i et belyst rom (50 lux på sentral overflaten av bassenget) med ekstra-labyrint signaler på veggene. Vannet labyrint ble delt inn i fire virtuelle kvadranter: nord-vest (NW), nord-øst, sør-øst, og sør-vest, og dyreatferd ble videoen sporet. På dag 1, ble dyrene kjent med basseng og deres motivasjon og visuo-motoriske evner evaluert. En flukt plattform (diameter 9,7 cm) ble plassert i sentrum av tanken, som kommer 1 cm over vannflaten og med en liten svart ball festet på den, for å lette dets visning på en del av dyrene. Mus ble plassert på plattformen i 20 sekunder. Umiddelbart etterpå, en økt bestående av fire 60-sekunders studier (inter-rettssaken intervall: 30 minutter) ble gjennomført. Dyrene ble plassert, mot veggen, på ett av fire startstedene (nord, sør, øst eller vest) og lov til å svømme til synlig plattform for maksimalt 60 sekunder. Mus ikke finne plattformen ble plassert manuelt på det i 20 sekunder. På dager 2-5, ble romlige læreevne evaluert i en treningsfase av 4 daglige prøvelser, maksimum 60 sekunder hver, der flukten plattformen ble plassert i NW kvadrant, nedsenket 1 cm under vannflaten. 2 timer etter den siste prøve av den siste dagen av opplæringen perioden, ble en sonde test utført ved å fjerne plattformen og tillater dyrene å svømme i 60 sekunder, med tiden som brukes i det tidligere riktige kvadrant (NW) målt. Romlige minne evner ble evaluert i et gjenfinnings fase på dag 10, ved hjelp av en enkelt sesjon 4 forsøk under de samme betingelsene som treningsfase. Læring plastisitet ble evaluert i en overføringsfase over 4 påfølgende dager (4 forsøk /dag, maks 60 sekunder hver) ved daglig endre den skjulte plattformen plassering. Avstand krysset og flykte ventetid ble målt.
hippocampus celleproliferasjon, vaskulær tetthet og fosforylert P70S6 kinase immunolabeling
5-brom-2-deoxyuridine (BrdU) -merkede celler innenfor og utenfor subgranular sonen av hippocampus (SGZ) ble tellet. Å merke voksen-generert celler i dentate gyrus av hippocampus, 6 intraperitoneal injeksjon (50 mg /kg) av BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) ble administrert i løpet av de siste dagene av behandlingsperioden hos mus ikke omgår atferds evaluering (fig. S3C). Dagen etter siste inntak, og 3 timer etter BrdU injeksjon, mus ble bedøvet ved hjelp isofluorane, halshugget, og hjernene raskt fjernet, frosset i 2-metylbutan (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrike) ved -30 ° C og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Hjernene ble kuttet med en kryostat til serie koronale seksjoner (tykkelse 20 um) fra den fremre del av dorsal hippocampus (anteroposteriore, 1,20 mm fra bregma -1,44 mm). Hver seksjon 12, hver adskilt med 240 um, ble montert på objektglass belagt med gelatin-krom-alun og lagret ved -20 ° C inntil behandling.
Seks hippocampus seksjoner fra hver av 4 dyr per gruppe ble farget samtidig i BrdU visualisering. Hjerneskiver ble fiksert (4% paraformaldehyd i PBS, vasket 3 x 5 minutter med PBS, pH 7,4, og inkubert (2N HCl; 45 ° C; 45 minutter) for å denaturere DNA-Snittene ble deretter vasket (PBS, 3 x 5 minutter). , inkubert i 1 time i blokkeringsløsning inneholdende 1:50 normal esel serum, 1% bovint serum-albumin, og 0,3% Triton X-100 (VWR International, Strasbourg, Frankrike) i PBS, og inkubert over natten ved 4 ° C med sau anti -BrdU immunoglobulin G. (IgG, Abcam, Paris, Frankrike) ved 1:400 i blokkering løsning Deretter delene ble vasket (PBS, 4 x 5 minutter) og inkuberes (2 timer, romtemperatur) med Alexa 488-konjugert esel anti -sheep IgG (Invitrogen, Boulogne-Billancourt, Frankrike) ved 1:400 i PBS. skylles delene ble lokket glapp med Mowiol. §§ ble undersøkt på et Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon Instrument, Champigny-sur-Marne, Frankrike) tilkobles med Mercator programvare (ExploraNova, La Rochelle, Frankrike). En modifisert objektiv stereological metoden ble brukt til å telle BrdU-positive celler i SGZ av dentate gyrus og i området utenfor SGZ [40], [41]. Antallet fargede celler i 6 seksjoner ble regnet bilateralt, og som hver 12. delen ble brukt, var dette tallet multiplisert med 12. Alle tellinger ble gjort av en etterforsker blindet for behandlingsgruppen.
For undersøkelse av hippocampus vaskulær nisje tetthet, hjerne Snittene ble fiksert, vasket, og inkubert som beskrevet ovenfor. Det primære antistoff var kanin anti-IQGAP1 (H-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, France) fortynnet 1:400 i blokkeringsløsning, og det sekundære antistoff var Alexa 488 -konjugert esel anti-kanin-IgG på 1:400 i PBS. Seksjoner ble kontra med kjernefysisk markør DAPI (1 mikrogram /ml). Immunfluorescens ble observert under et konfokal mikroskop og IQGAP1 merkede strukturer i SGZ vurdert i 3 seksjoner atskilt med 240 mikrometer (mellom Bregma -1,68 mm og -2,16 mm).
For å undersøke de aktive formene (fosforylert) av P70S6 kinase (p-P70S6K), hjerne deler av kjøretøyet og everolimus-behandlede mus ble fiksert, vasket, og den p-P70S6K-ekspresjon ble målt ved hjelp av det primære antistoff anti-p-P70S6K (Abcam ab60948, Paris, Frankrike) fortynnet 1:200 i blokkeringsløsning, og det sekundære antistoff var Alexa 488-konjugert esel-anti-kanin-IgG på 1:400 i blokkeringsløsning. P-P70S6K merkede strukturer ble vurdert i 2 eller 3 seksjoner atskilt med 240 mikrometer (mellom Bregma -0,98 mm og -1.70 mm for bue, Re, Rh, submed, VM, mellom -1,22 mm og -1,94 mm for EP, ect og PRH,. mellom -2,06 mm og -2.54 mm for PSTh) med Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon instrument, Champigny-sur-Marne, Frankrike) interfaced med bildebehandlingsprogrammer NIS-Elements
Culture of neural stilk celler og endotelceller
For nevrale stamceller (NSC) kultur, hjernen fra C57BL /6J Rj nyfødte mus ble vasket i trypsin. Cellesuspensjonen ble sentrifugert ved 100 G i 4 minutter, og cellene ble plassert i friskt serumfritt medium. Dette mediet besto av Neurobasal (100 ml, Gibco, Saint-Aubin, Frankrike) supplert med 5 mM HEPES buffer (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankrike), 1 ml B27 og 1 mL N2-vekstsupplement (Gibco), 20 ul epidermal vekstfaktor (20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankrike), 10 ul basisk fibroblast vekstfaktor (10 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, Frankrike), og 7,32 mL heparin (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrike) og ble lagt inn med 33 mM glukose. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 100 levedyktige celler pr mikroliter i dette medium og ble dyrket i 25 cm
2 kolber ved 37 ° C i en 5% CO
2-95% luft fuktet inkubator. På dag 7 ble det godt utviklede neurosfærer oppsamlet og spaltet i trypsin i 10 minutter ved 37 ° C. Sekundære Neurosfærer (P
1) og senere passasjer ble generert av mekanisk og enzymatisk dissosiasjon av primære neurosfærer. Celler ble deretter inkubert i fravær eller nærvær av kjøretøy eller everolimus i 24 til 48 timer. Ved hjelp av en 4 x objektiv av et Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, England) invertert mikroskop, målte vi den midlere diameter av 20 tilfeldig valgte neurosfærer per brønn (mer enn 40 pm i diameter) i det visuelle feltet på 4 forskjellige områder av tre brønner på 24-brønners kulturplater.
for endotelceller kultur, brukte vi polyomavirus middelstore tumor antigen (mT) transformerte mus hjernen kapillær endothelial cellelinje (bEND.3, hentet fra Dr D. Gorecki , Portsmouth University, England). Celler ble dyrket i høy glukose (4,5 g /l) -inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplementert med 1,5 g /l natriumbikarbonat, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO
2. For å bestemme celle-overlevelse og proliferasjon, ble cellene sådd ut i triplikat i flere sett av 12-brønners kulturplater. Inkubasjon ± kjøretøy /everolimus i 24-48 timer var i FBS fritt medium. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved elektronisk telling celle tall (Z2, Beckman Coulter, Villepinte, Frankrike).
Statistisk analyse
vektøkning og romlig læring forestillinger ble analysert ved tre-måter ANOVA med gjentatt målinger etterfulgt av minst signifikant forskjell (LSD) post hoc analyser når de var nødvendig. For sonde test av Morris vannet labyrint, tidsbruk i kvadrant hvor plattformen lå ble sammenlignet med det spådd ved en tilfeldighet ved hjelp av χ
2 tester. Andre atferdsdata, immunhistokjemiske og cytokromoksydase aktivitetsdata ble analysert med Student
t
tester. Disse dataene ble analysert med Statistica © 5.1. Dataene i det hippocampale celleproliferasjon og data for kulturstudier ble analysert med den parametriske Mann-Whitney U-test og ANOVA av Kruskal-Wallis, etterfulgt av Dunn tester med GraphPad Prism 5. For alle statistiske tester, ble terskelen betydning satt til
p
≤.05.
Resultater
Everolimus-indusert vektøkning endringer
Vi først vurderes konsekvensene av en kronisk mTOR-hemming på kroppsvekt i mus. Administrering av everolimus (5 mg /kg) daglig til unge mus ved gavage i løpet av 2 uker, ikke ga noen tilsynelatende morbiditet og /eller mortalitet. Mens kontroll (emulsjon) gruppe fortsatte å få vekten i løpet av eksperimentet, hadde everolimus-behandlede mus redusert vekt (behandling x dag interaksjon: F
23 552 = 8,29,
p
. 001) fra den 17rd dag etter innføringen av mTOR inhibitor, og fortsatte å veie mindre utover følgende forsøksperioden (LSD post hoc
p
0,01;. fig. 1)
Kroppsvekt vekt~~POS=HEADCOMP av kjøretøy- og everolimus-behandlede mus ble evaluert på lang sikt etter slutten av behandlingsperioden (grå bar). Mus fikk bilen eller everolimus en gang om dagen i løpet av 14 sammenhengende dager. Barer representerer standard feil av gjennomsnittet. ANOVA, Behandling x Day samhandling
p
0,001 fulgt av LSD post hoc: **
p
0,01, ***
p
. 001.
Kortsiktig effekt av everolimus på cerebral cytokromoksydase aktivitet og P70S6 kinase phosphotylated skjema
for å evaluere virkningen av mTOR-hemmer på cerebral celle metabolisme, en histokjemisk analyse avslører cytokrom oksidase-aktivitet har blitt utført i hjernesnitt for kontroll og behandlede mus (tabell 1). I everolimus-behandlede mus, 4 dager etter slutten av behandlingsperioden, en signifikant reduksjon (
p
0,05) av cytokrom oksidase-aktivitet var til stede i skallet del av kjernen accumbens (t
13 = 2,52), den prelimbic cortex (t
15 = 2,20), den laterale preoptic området (t
14 = 2,33) og motoren trigeminal nucleus (t
13 = 2,38). Videre everolimus behandling resulterte i økt metabolsk aktivitet i ectorhinal cortex (t
14 = -2,61), den entopeduncular kjernen (t
13 = -2,27), den parasubthalamic kjernen av hypothalamus (t
14 = -2,91), den ensomme kjernen (t
13 = -2,49), og i thalamic reuniens (t
14 = -2,48), rhomboid (t
14 = -2,31), submedius (t
14 = -2,30), og ventromediale (t
14 = -2,56) kjerner (alle
p
0,05) (figur 2A og tabell 1).. For å undersøke den potensielle direkte eller indirekte inhibering av mTOR i disse hjerneområder ble aktiviteten av en nedstrøms effektor av mTOR veien bedømt ved immunfargete nivåer av fosfo-P70S6 kinase (p-P70S6K) i forskjellige hjerneområder som oppviser eller ikke CO metabolske forandringer. Behandlingen var ikke signifikant endre P70S6K-positiv merking i ectorhinal cortex, entopeduncular kjernen, reuniens, rhomboid, ventromediale og submedial thalamic kjerner og parasubthalamic kjernen stiller endrede CO aktiviteter, samt i perirhinal cortex og bueformet hypothalamus kjernen viser ingen endringer i CO aktiviteter (fig. 2B og C).
(a) CO aktivitet i selektive kjøretøy- og everolimus-behandlede mus hjerneområder. (B) Representative bilder av Phospho-P70S6K (p-P70S6K) immunolabeling i cortex, entopeduncular kjernen, thalamus og hypothalamus kjøretøy eller everolimus-behandlede mus. (C) Gjennomsnittlig prosent av P-P70S6K-merkede overflate (normalisert til kjøretøy) (+ SEM) i de forskjellige hjerneområder. Arc: bueformede kjernen; Ect: ectorhinal cortex; EP: entopeduncular kjernen; PRH: perirhinal cortex; PSTh: parasubthalamic kjernen; Re: reuniens thalamic kjernen; Rh: rhomboid thalamic kjernen; Submed: submedial thalamic kjernen; VM:. Ventromediale thalamic nuleus
Ingen emosjonelle og kognitive endringer etter everolimus behandling
Emosjonell atferd
Syv dager etter slutten av behandlingsperioden. har andelen av åpen arm oppføringer i forhøyet pluss labyrinten (Se Materiale og metode S1) var ikke signifikant forskjellig mellom de 2 behandlingsgruppene, noe som tyder på at everolimus ikke påvirker angst-lignende oppførsel (t
24 = 1,66,
p
0,05 fig. S1 A). I den tvungne svømmetest, immobilitet varighet var ikke statistisk forskjellig mellom gruppene, noe som indikerer at everolimus ikke endre depressive-lignende oppførsel (t
24 = 0,65,
p
0,05 Fig. S1B ).
Spatial læring og hukommelse.
i løpet av tilvenningsfasen av Morris vannet labyrint test, svømmehastighet (t
24 = -0,69,
p
ikke vist), krysset avstand (t
24 = 0,49,
p
0,05; ikke vist), og tiden det tar for å finne det fremkom plattformen (t
24 = 0,93
p
0,05 fig. 3A) ble ikke signifikant endret av behandling, noe som indikerer at motivasjon og visuo-motorisk evne var upåvirket av everolimus. Under innsamlingsfasen, fikk everolimus ikke endre romfølelse ytelse 15 dager etter slutten av behandlingsperioden, som escape latency (F
1,24 = 0,94,
p
0,05; fig . 3B) og avstand krysset (F
1,24 = 0,32,
p
0,05 fig. 3C) var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene. Forestillinger vesentlig forbedret som testen ble gjentatt (rømme latency F
3,72 = 18,38,
p
0,001 og avstand krysset F
3,72 = 19,51,
p
0,001). Under sonde test, alle mus brukt betydelig mer tid i tidligere riktig kvadrant enn forutsett ved en tilfeldighet (kjøretøy: X
2
11 = 117,67,
p
0,001; everolimus: X
2
13 = 231,80,
p
0,001 fig. 3D). Under henting fasen, fikk everolimus-behandlede mus ikke vise romlig minneytelse nyrefunksjon, da deres flukt latency (t
24 = 0,49,
p
0,05 Fig. 3B) og avstand krysset ( t
24 = 0,40,
p
.05, fig. 3 C) ikke skiller seg vesentlig fra de av kjøretøy mus
(A) Motivasjon og visuo-motoriske evner etter. kjøretøy eller everolimus behandling (Student
t
test,
p
0,05). (B og C) Under trening og gjenfinning (R) faser, ventetid (B) og avstand krysset (C) etter kjøretøy eller everolimus behandling (ANOVA, Dag effekt ***
p
0,001) . (D) Under sonde test, tid brukt av dyr i begge grupper i kvadrant hvor plattformen ble plassert under treningsfase (χ
2, ***
p
0,001
vs
sjanse). Under overføringen fasen, rømme latency (E), avstand krysset (F), og svømmehastighet (G) i kjøretøy- eller everolimus-behandlede mus (ANOVA, Behandling effekt *
p
0,05, Trial effekten ***
p
0,001 fulgt av LSD post hoc
##
p
0,01). (H) i løpet av første dag av overføringsfasen, tid brukt i tidligere riktig nordvestre delen etter kjøretøy eller everolimus behandling (Student
t
test,
p
0,05). Dataene er midler + SEM
Under overføringen fase av Morris vannet labyrint test, dyr forbedret sine forestillinger over studiene (escape latency. F
3,72 = 9,76,
p
0,001; avstand krysset F
3,72 = 14,99,
p
0,001 fig. 3E og 3F). Lærings plastisitet, bestemt ved daglig modifikasjon av plattformen sted, var ikke påvirket av behandling; unnslippe ventetid før du finner den skjulte plattformen var lik mellom gruppene (F
1,24 = 3,36,
p
0,05 Fig. 3E). Men avstanden krysset av everolimus-behandlede mus var signifikant økt sammenlignet med kjøretøy mus (F
1,24 = 6,08,
p
0,05, Fig. 3F). ANOVA vurderingen viste en signifikant behandling × prøve samhandling i form av svømmehastighet (F
3,72 = 3,69,
p
0,05). LSD post hoc analyser indikerte at everolimus-behandlede mus svømte raskere enn bilens mus i løpet av de første og tredje forsøk (
p
0,01, Fig. 3G). Under dag en av overføringsfasen, fikk everolimus ikke endre tidsbruk i kvadrant som var riktig i treningsfasen (t
24 = -0,39,
p
0,05 Fig. 3H ), noe som tyder på fravær av atferdsperseverasjon.
spontan aktivitet og anerkjennelse minne.
Everolimus ikke endre spontan bevegelses og vertikale aktiviteter. Avstanden krysset og lener antallet var ikke signifikant forskjellig mellom behandlingsgruppene (t
24 = 0,63,
p
0,05 og t
24 = 0,39,
p
0,05, henholdsvis. figurene S1C og S1D). I objektet anerkjennelse test, dyr av begge gruppene oppdaget nyhet, med lengre lete varigheten av romanen objekt
vs
de kjente seg (biler: t
11 = -2,90,
p
0,05; everolimus: t
13 = -4,51,
p
0,001; figur S1E).. Som vist på fig. Scale bar, 100 mikrometer. Fig. Scale bar, 100 mikrometer.
