Abstract
Bakgrunn
Head and halskreft (HNC) rangerer den fjerde ledende kreft og kreft død i mannlige befolkningen i Taiwan. Til tross for de siste terapeutiske fremskritt, er prognosen for HNC pasienter fortsatt dystre. Nye strategier er sterkt behov for å forbedre chemosensitization til konvensjonelle cellegifter og kliniske reaksjoner fra HNC pasienter. Studier har vist at topisk 5-aminolevulinsyre-formidlet fotodynamisk terapi (PDT-ALA) blir brukt i behandling av forskjellige humane premaligne og maligne lesjoner med noen oppmuntrende kliniske resultater. Men de molekylære mekanismene for ALA-PDT i den terapeutiske effekten i HNC tumorigenesis og om ALA-PDT som chemosensitizer for HNC behandling fortsatt uklare. Samler data støtte kreftstamceller (cscs) bidrar chemo-motstand i HNC. Basert på tidligere studier, formålet med studien er å undersøke effekten av ALA-PDT på cscs og chemosensitization eiendom i HNC.
Metodikk /Principal Finne
cscs markør ALDH1 aktivitet HNC celler med ALA-PDT behandling som vurderes av Aldefluor analysen flowcytometri analyse. Sekundær Sphere dannende selvfornyelse, stemness markører uttrykk, og invasivitet av HNC-cscs med ALA-PDT behandlingen ble presentert. Vi har observert at behandlingen av ALA-PDT signifikant nedregulert den ALDH1 aktivitet og CD44 positivitet av HNC-cscs. Videre ALA-PDT redusert selvfornyelse eiendom og stemness signaturer uttrykk (Oct4 og Nanog) i sfæren dannende HNC-cscs. ALA-PDT sensibilisert svært tumorigene HNC-cscs til konvensjonell kjemoterapi. Til slutt, synergistisk effekt av ALA-PDT og Cisplatin behandling svekket invasivitet /colongenicity eiendom i HNC-cscs.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater gir innsikt i den kliniske utsiktene til ALA-PDT som en potensiell chemo-adjuvant behandling mot hode og nakke kreft gjennom å eliminere cscs eiendom
Citation. Yu CH, Yu CC (2014) Fotodynamisk terapi med 5-aminolevulinsyre (ALA) svekker Tumor Starte og Chemo-Resistance eiendom i head and Neck Cancer-Avledet kreftstamceller. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10,1371 /journal.pone.0087129
Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA
mottatt: 06.12.2013; Godkjent: 22 desember 2013; Publisert: 24 januar 2014
Copyright: © 2014 Yu Yu. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien støttes av forskningsstipend fra National Science Council (100-2632-B-040-001-My3, 101-2314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) .De finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og nakke kreft (HNC) er en av de vanligste kreftformene i verden, og en av årsakene til kreft-relaterte dødsfall på grunn av hyppige tilbakefall etter kjemoterapi motstand [1]. Til tross for forbedringer i diagnostikk og behandling av HNC, har langsiktige overlevelse forbedret bare marginalt over det siste tiåret [1]. Nye legemidler eller strategier er sterkt behov for å forbedre chemosensitization til konvensjonelle cellegifter og kliniske reaksjoner fra HNC pasienter [2].
Nyere studier har pekt på motstand mot vanlige radiotherapies /chemotherapies behandling er en stor kliniske kriteriene for karakter kreft stamceller (cscs) med selvfornyelse og svært tumorigenenic kapasitet i maligne svulster inkludert HNC [2] – [4] Både intracellulær ALDH1 + og CD44 + celler har vært foreslått å stille cscs egenskaper og har blitt brukt som cscs funksjonelle markører for hode og hals kreft-avledet kreft stamceller (HNC-cscs) [5] – [7]. Likevel søker en effektiv tilnærming rettet mot HNC-cscs å forbedre HNC -relaterte malignitet er raskt behov [7].
Fotodynamisk terapi (PDT) innebærer to individuelt ikke-giftige komponenter, lys og fotosensibiliserende [8]. PDT er en ny behandling og har betydelige løftet for mange solide svulster [9]. Studier har vist at topisk 5-aminolevulinsyre-mediert PDT (ALA-PDT) blir brukt i behandling av forskjellige humane premaligne og maligne lesjoner med noen oppmuntrende kliniske resultater [10] – [13]. PDT kan ha potensial til å hemme metastasering av ufullstendig behandlet HNC [14]. I en mus Lewis-lungekarsinom modell, reduserte ALA-PDT metastasen av kreftceller in vivo [15]. I tillegg ALA-PDT øker apoptotiske evne til muntlig kreftceller gjennom NF-kB /JNK signaliserer [16]. ALA-PDT også opphevet migrasjon kapasitet på muntlige kreftceller ved nedregulering av FAK og ERK [17].
Basert på tidligere studier, formålet med studien er å undersøke effekten av ALA-PDT på chemosensitization og cscs eiendom i HNC. Samlet vi først demonstrerte ALA-PDT effektivt redusere CSC-lignende eiendom, inkludert ALDH1 aktivitet, CD44 positivitet, selvfornyelse, invasjon, og forbedret kjemosensitivitet i HNC. ALA-PDT vil være en potensiell chemo-adjuvant behandling og kan være gunstig for anti-cscs behandling i HNC.
Materialer og metoder
Primær dyrkede celler fra HNC vev
kirurgiske vevsprøver fra HNC pasienter ble samlet etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke og denne studien ble godkjent av Institutional Review Board i Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH No: CS10249). Primære HNC-celler ble etablert som tidligere beskrevet [6], [18]. I korte trekk, etter kirurgisk fjerning av HNC vev, ble vevene vasket 3 ganger i glukoseinneholdende HBSS, og deretter ble prøvene skiver med en tykkelse på 300 um og skiver vev ble neddykket i 0,1% (vekt /vekt) kollagenase inneholder glukose inneholdende HBSS i 15 minutter ved 37 ° C og underkastet rotasjon riste rysting ved 125 rpm. HNC primærkultur ble dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum, supplementert med 1 mM natriumpyruvat, ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 100 enheter /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 95% luftfuktighet, 5% CO
2).
Chemicals
5-ALA ble erholdt kjøpt fra Sigma (St . Louis, MO, USA). Like før bruk, ble 5-ALA ytterligere fortynnet i dyrkingsmedium til passende sluttkonsentrasjoner.
HNC cellelinjer dyrking og 5-ALA-basert fotodynamisk terapi
For ALA-PDT studier, cellene ble inkubert med 5-ALA i 3 timer, og deretter bestrålt med rødt lys på 635 ± 5 nm ved forskjellige doser.
Anriking av kule dannende HNC kreft stamceller (HNC-cscs)
Spheres fra HNC-celler ble isolert i medium bestående av serum-fritt DMEM /F12 medium (GIBCO), N2-supplement (GIBCO), 10 ng /ml human rekombinant basisk fibroblast vekstfaktor (basisk FGF), og 10 ng /ml epidermal vekst faktor (EGF) (R kanin anti-GAPDH (MDBio, Inc., Taipei, Taiwan); og mus anti-β-aktin (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Immunreaktive proteinbånd ble oppdaget av ECL deteksjonssystemet (Amersham Biosciences Co, Piscataway, NJ, USA).
In vitro
celle invasjon analysen
For Transwell migrasjon analyser , 2 x 10
5-celler ble sådd ut i den øverste kammer av en Transwell (Corning, Acton, MA, USA) med en porøs membran (8,0 um porestørrelse). Celler ble sådd ut i medium med lavere serum (0,5% FBS) og medium supplert med høyere serum (10% FBS) ble anvendt som en kjemoattraktant i det nedre kammer. Cellene ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C, og celler som ikke vandrer gjennom porene ble fjernet ved en bomullspinne. Celler på den nedre overflate av membranen ble farget med Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for å vise kjernen; fluorescens ble påvist ved en forstørrelse på 100x ved anvendelse av en fluorescens-mikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Antallet fluorescerende celler i et totalt fem tilfeldig valgte områder ble tellet. In vitro celle invasjon analysen var som beskrevet tidligere [19].
Soft agar kolonidannende analyse
Hver brønn (35 mm) av en seks-brønns kultur tallerken ble belagt med 2 ml bunnagar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Etter at bunnlaget var stivnet, 2 ml toppagar-medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) inneholdende 2 x 10
4 celler ble tilsatt, og retter ble inkubert ved 37 ° C i 4 uker. Platene ble farget med 0,005% Crystal Violet da koloniene ble telt. Det totale antallet kolonier med en diameter ≥100 mikrometer ble regnet over fem felt per brønn for totalt 15 felt i tre eksemplarer eksperimenter [3].
Statistisk analyse
Statistiske Package for samfunnsvitenskap software (versjon 13.0) (SPSS Inc., Chicago, IL) ble anvendt for statistisk analyse. Student «s
t
test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjellene mellom eksperimentgrupper;
p
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Nivået av statistisk signifikans ble satt til 0,05 for alle tester.
Resultater
Hemming av ALDH1 aktivitet i HNC celler etter ALA-PDT behandling
ALDH1, en cytosolic isoenzymet som er ansvarlig for oksidasjon av retinol til retinsyre under tidlig stamcelledifferensiering har begge vist seg å være CSC markører i hode- og halskreft [20], [21]. For det første har vi brukt in vitro celle-baserte ALDH-aktivitet assay-system, som er vist som en HNC-cscs markør, for å undersøke virkningene av ALA-PDT for ALDH1 aktivitet i HNC cellelinjer og primære dyrkede HNC-celler ved flowcytometri beskrevne i materiale og metoder. Våre data foreslo ALA-PDT behandlingen reduserer ALDH1 aktivitet HNC celler (Fig. 1) betydelig.
(A) HNC cellelinjer (SAS og Ca9-22) og primær HNC celler (HNC-en og HNC- 2) ble sådd ut i 1 x 10
6 celler /brønn i 6-brønn-plate og deretter forbehandlet 1 mM ALA i 3 timer etterfulgt av PDT med rødt lys i en dose på 4 J /cm2 eller ALA eneste behandling kontrollgruppe . ALDH + celler ble bestemt ved Alderfluor analyse og levedyktige celler (7-AAD negative) ble benyttet for analyse. DEAB-behandlede celler ble anvendt som negativ kontroll. (B) Kvantifiseringsmidlene Resultatene er vist i stolpediagram. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og representative resultater ble vist. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD *, p. 0,05
ALA-PDT eliminerer effektivt selvfornyelse kapasitet, CD44 positivitet, og stemness signaturer i HNC-cscs
Tidligere vi undersøkte vellykket sfære formasjon over serie passasjer av kultur, en av indekser for å vurdere den vedvarende selvfornyelse tilhører kreft stamceller, og viste at selvfornyelse kapasitet på alle HNC-cscs [22]. For å undersøke effekten av ALA-PDT i å opprettholde selvfornyelse HNC-cscs, vurderte vi det sekundære sfære dannende evne med ALA-PDT behandling i HNC celler. Behandling av HNC celler med ALA-PDT forstyrret kuler kroppsstørrelse og antall HNC-cscs (Fig. 2A) med. Strømningscytometri-analyse av CD44 ekspresjon indikerte at ALA-PDT behandling reduserte prosenten av både CD44 + celler i HNC-cscs (Fig. 2B). For ytterligere å avgjøre om reduksjon i tumor sfære formasjon effektivitet med ALA-PDT behandlingen skyldtes redusert stemness markører uttrykk, stemness gener (oktober-4 og Nanog) av sfære dannende HNC-cscs med kontroll og ALA-PDT behandlingen ble bestemt av western blot-analyse. Resultatene bekreftet at ALA-PDT behandlede HNC-cscs markert redusert uttrykket transkripsjon (fig. 2C) og proteinnivå (Fig. 2D) av stemness gener.
(A) For selvfornyelse analyse, single celle~~POS=TRUNC ble oppnådd fra primære HNC-cscs kuler med accutase fordøyelse og sekundære sfære formasjon kapasitet ble bestemt med primær sfære kultur fremgangsmåte med unntagelse av pletteringscelletettheten som 10.000 celler /ml. (B) Ekspresjon av CD44 positivitet for kontroll og ALA-PDT-behandlede HNC-cscs ble bestemt ved strømningscytometri-analyse. Dataene som vises her er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05 vs. kontroll. SAS eller Ca9-22-avledet HNC-cscs behandlet med kontroll eller ALA-PDT og analysert utskrifter og protein nivå av oktober-4 og Nanog ved real-time RT-PCR (C) og immunblotanalyse (D), henholdsvis. *, P. 0,05 vs. kontroll
ALA-PDT behandlingen levering forsterker effekten av kjemoterapi i HNC-cscs
cscs er relativt motstandsdyktig mot kjemoterapi [6]. Funnene som ALA-PDT behandling regulert cscs egenskaper foreslått en rolle for ALA-PDT som en potensiell chemo-adjuvant behandling. Celleviabilitet analyser viste at den cytotoksiske effekt på HNC-cscs til cisplatin og fluorouracil (5-FU) ble betydelig øket med den ALA-PDT kombinasjonsbehandling (fig. 3A). Strømningscytometri-analyse av multiresistens (MDR) gener indikerte at den reduserte chemoresistance av ALA-PDT behandling kunne tilskrives den reduserte ekspresjon av ABCG2 (Fig. 3B). Disse data tyder på at ALA-PDT behandlingen bedres stoffet motstanden HNC-cscs til cisplatin og fluorouracil (5-FU) behandling gjennom ABCG2 nedregulering.
(A) HNC-cscs med ALA-PDT eller kontroll behandling ble underkastet behandling med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin eller 5-FU. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. (B) Flowcytometri analyse av uttrykket nivået av multiresistent markør ABCG2 uttrykk i HNC-cscs som angitt.
Samtidig administrering av ALA-PDT behandling og cisplatin avskaffet invasivitet og clonogenicity av HNC -CSCs
Siden cscs ser ut til å spille en betydelig rolle i å fremme svulst igangsetting av virksomhet [3], forsøkte vi å måle synergieffekter av ALA-PDT kombinert med cisplatin behandling på invasjon /clonogenicity av HNC-cscs. Enkelt cellesuspensjon av ALA-PDT-behandlede HNC-cscs ble behandlet med eller uten cisplatin behandling ble brukt for analyse av deres invasjon /clonogenicity
in vitro
som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Behandling med cisplatin alene påvirket ikke invasjonen evne i HNC-cscs (fig. 4A), kombinasjonen av ALA-PDT og cisplatin behandling forbedret effekten av disse behandlinger (Fig. 4A). I mellomtiden lignende synergistisk effekt av ALA-PDT behandling og kjemoterapi-behandling ble også observert i kolonidannelse assay (fig. 4B). Kombinasjonen behandling viste en synergistisk effekt i abrogere clonogenicity i HNC-cscs. Disse data indikerer at effektiviteten av cisplatin kjemoterapibehandling på HNC-cscs kan forbedres med ALA-PDT-behandling.
(A) Invasion evne og (B) kolonidannende evne i HNC-cscs ble undersøkt etter behandlingen med enten ALA-PDT eller cisplatin kjemoterapi eller begge deler. *, P 0,05 ALA-PDT vs. kontroll; #, P 0,05 ALA-PDT + Cisplatin vs. ALA-PDT alene
Diskusjoner
cscs anses å være ansvarlig for initiering, forplantning og metastasering av svulster [23. ]. Viktigere, kan eksistensen av cscs forklare kreft tilbakefall, selv etter klinisk behandling med enten radioterapi eller kjemoterapi på kreftpasienter [24]. Derfor søker romanen behandlingsstrategi rettet mot cscs forhåpentligvis gi oss nye terapeutiske tilnærminger. I denne rapporten har vi først viste ALA-PDT gitt en terapeutisk effekt i HNC-cscs ved å hemme cscs-lignende egenskaper av hode og nakke kreft, slik som stemness signatur, migrasjon evne, og chemoresistance. Så langt vi kjenner til, er dette den første studien som viser den kritiske rollen som en ALA-PDT-basert terapi i målretting HNC-avledet CSC-lignende celler og i blokkering HNC-cscs-mediert svulst initiere aktivitet.
epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en prosess avgjørende for riktig embryoutvikling, og det er også re-engasjert i voksne under tumorigenesis [25]. EMT er allment akseptert som en av de cscs egenskaper, [26] og Oct4 /Nanog signalering har vist seg å være involvert i regulering av EMT og metastasering [27]. Oral kreft epitelceller kan skaffe mesenchymale trekk som letter migrering og invasjon gjennom EMT prosess. [28] Det er kjent at EMT kan gi opphav til celler med stamcelle, og kreft initiere stamceller egenskaper som har gjennomgått EMT er derfor mer motile og metastasized . [26]. Siden vi har funnet at effekten av ALA-PDT på invasjonen evne i HNC-cscs, utforske om ALA-PDT formidlet cscs og invasjons evner, avhengig EMT veien vil bli undersøkt i fremtiden.
Kjemoterapi er dagens plattform for behandling HNC pasienter med metastase [29]; imidlertid, er det kjemoterapeutiske virkning begrenset, og dens bivirkninger i stor grad innvirke på livskvaliteten til pasientene. Cscs er klinisk preget av motstand mot kjemoterapi [29]. Tilstedeværelsen av cscs resulterer i lav effektivitet av anti-cancer-terapier og svikt i tumor utrydding og til slutt fører til tumormetastase tilbakefall og [30]. Den HNC-cscs var svært motstandsdyktig mot kjemoterapi [18], og den chemoresistance av disse cellene ble signifikant inhibert når de ble behandlet med ALA-PDT. Det er bemerkelsesverdig at ALA-PDT behandlingen resulterte i reduserte MDR protein nivåer i HNC-avledet cscs etter chemotreatment. De detaljerte mekanismer av regulatoriske nettverk mellom ALA-PDT-behandling på resistente gener krever videre undersøkelser.
I konklusjonen, denne studien demonstrerte de hemmende effekter av ALA-PDT på stilk-lignende egenskaper og chemoresistance i HNC . Spesielt her er stort behov for å løse de underliggende mekanismene i ALA-PDT-mediert veien i HNC-cscs og for ytterligere å vurdere de terapeutiske mulighetene for ALA-PDT behandling klinisk.
