Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en aggressiv kreft som ofte diagnostisert på et avansert stadium med dårlig prognose. Her rapporterer vi kjemoterapeutiske effekten av bioaktive proantocyanidiner fra drue frø (GSPS) som vurderes ved hjelp av
In Vitro Hotell og
In vivo
modeller. Behandling av humane kreft i bukspyttkjertelen celler (Miapaca-2, PANC-1 og ASPC-1) med annonser i Gmail
In Vitro
redusert cellelevedyktighet og øket G2 /M fase arrest av cellesyklusen som fører til induksjon av apoptose i en dose- og tidsavhengig måte. Den annonser i Gmail-indusert apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler var assosiert med en reduksjon i nivåene av Bcl-2 og Bcl-xl og en økning i nivåene av Bax og aktivert caspase-3. Behandling av Miapaca-2 og PANC-1-celler med annonser i Gmail også reduserte nivåene av fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) og fosforylering av Akt i ser
473. siRNA knockdown av PI3K fra kreft i bukspyttkjertelen celler også redusert fosforylering av Akt. Videre kosttilskudd administrering av annonser i Gmail (0,5%, w /w) som suppleres AIN76A kontroll kosthold vesentlig hemmet veksten av Miapaca-2 bukspyttkjertel tumorxenotransplantater dyrket subkutant i atymiske nakne mus, som ble assosiert med: (
i
) hemming av celleproliferasjon, (
ii
) induksjon av apoptose av tumorceller, (
iii
) økte ekspresjon av Bax, redusert ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner og aktiveringen av caspase-3- -positive celler, og (
iv
) redusert uttrykk av PI3K og p-Akt i tumor xenograft vev. Sammen disse resultatene tyder på at annonser i Gmail kan ha en potensiell kjemoterapeutisk effekt på kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
Citation. Prasad R, Vaid M, katiyar SK (2012) Grape Proantocyanidin Hemme kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
In Vitro Hotell og
In Vivo
gjennom induksjon av apoptose og ved å målrette PI3K /Akt Pathway. PLoS ONE 7 (8): e43064. doi: 10,1371 /journal.pone.0043064
Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: May 17, 2012; Godkjent: 16 juli 2012; Publisert: 08.08.2012
Copyright: © Prasad et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Veterans Administration Merit omtale Award (SKK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen regnes som den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA. Det er en aggressiv kreft som ofte diagnostisert på et avansert stadium med dårlig prognose; den samlede fem års overlevelse er mindre enn 5% [1], [2]. Bare 20% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er kvalifisert for kirurgisk fjerning, som fortsatt er den eneste potensielle helbredende terapi [3]. Selv om en kombinasjon av kjemoterapi og strålebehandling kan forbedre overlevelse, de fleste pasienter dør av sykdomsutvikling som ofte er assosiert med ervervet eller iboende motstandsdyktighet overfor kjemoterapi [4], [5]. Derfor er utvikling av mer effektive terapeutiske strategier som kan målrette molekylene forbundet med bukspyttkjerteltumorvekst og omgå eller overvinne motstand mot apoptose kan føre til bedre resultater i pasienter som lider av kreft i bukspyttkjertelen.
Ikke giftig fytokjemikalier tilby lovende muligheter for utvikling av effektive kjemoterapeutiske strategier for ulike typer kreft. Noen case-kontrollerte epidemiologiske studier støtter ideen om at forbruket av bioaktive diett fytokjemikalier reduserer risikoen for kreft i bukspyttkjertelen [6], [7]. Grape seed proantocyanidiner (GSPS) er bioaktive fytokjemikalier som har vist anti-kreftfremkallende aktivitet i enkelte dyretumormodeller [8], https://carcin.oxfordjournals.org/cgi/content/full/24/8/1379 – B10 # B10and ser ut til å utvise minimal toksisitet hos forsøksdyr [9], [10]. Annonser i Gmail kan lett ekstraheres fra drue-frø, og er en blanding av dimerer, trimerer, tetramerer og oligomerer av monomere katekiner og /eller (-) – epikatekiner [9], [10]. Annonser i Gmail har vist seg å ha anti-inflammatorisk, anti-oksidanter og anti-metastatiske egenskaper i både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller [8] – [12]. De hemmer ultrafiolett radiation- og kjemisk carcinogen-indusert hud kreftutvikling i musemodeller [9], [13]. Nylig har vi vist at diett administrering av annonser i Gmail med AIN76A kontroll diett resulterte i en doseavhengig inhibering av vekst av ikke-småcellet lungekreft tumorxenografter [14]. Annonser i Gmail hemme invasiv potensial for melanom og hode og nakke plateepitelkarsinom celler som vurderes å bruke
in vitro
modeller [11], [12]. Men anti-kreftfremkallende potensialet av annonser i Gmail mot kreft i bukspyttkjertelen er stort sett uutforsket.
phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) /Akt veien er en grunnleggende signalveien som formidler flere cellulære prosesser, herunder celleproliferasjon, vekst , celleoverlevelse og motilitet [15]. Økt aktivering og dereguleringen av komponentene i det PI3K /Akt reaksjonsveien har vært implisert i mange ondartede sykdommer og i utviser resistens mot kjemoterapi [16]. Akt er et godt karakterisert serin /treonin kinase. Økt Akt-aktivitet har blitt implisert i flere typer kreft, hvor den fremmer celleoverlevelse gjennom virkninger på en rekke nedstrøms mål, deriblant inaktivering av pro-apoptotiske proteiner, aktivering av anti-apoptotiske gener og progresjonen av cellesyklusen [17]. Aktivering av Akt er en hyppig hendelse i kreft i bukspyttkjertelen, og er assosiert med dårlig prognostiske variabler og utfall [18] – [20]. En studie viste at 59% av bukspyttkjertelen adenokarsinomer viste hyperaktive av Akt [18]. Noen studier tyder på at hemming av PI3K /Akt sti sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til apoptotiske effekten av cellegift både
in vitro Hotell og
in vivo product: [21] -. [23]
i denne studien, vurderte vi det kjemoterapeutiske effekten av annonser i Gmail på bukspyttkjertelkreft ved hjelp av Miapaca-2, PANC-1 og ASPC-1 humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer som
in vitro
cellekultur modeller. Hvis du vil kontrollere
in vitro
data, gjennomførte vi
in vivo
svulst xenograft studier. Våre resultater viser at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med GSPS resulterer i hemming av celleproliferasjon, induksjon av apoptose og inhibisjon av den PI3K /Akt svei.
Materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
De primære antistoffer ble oppnådd som følger: antistoffer som er spesifikke for Bax, Bcl-2, Bcl-xl, spaltet caspase-3, PI3K, Akt, p-Akt og β-aktin ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); Cyclin B1, Cdc25B, Cdc25c, Ki-67, og de sekundære antistoffer, som ble horseradishperoxidase-konjugert, ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). Den PI3K siRNA kit ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California). Den Annexin V-konjugert AlexaFluor488 Apoptose Detection Kit ble kjøpt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Den proteinanalysesett var fra Bio-Rad (Hercules, CA). MTT (3- [4,5-dimetyl-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromid) og alle andre kjemikalier var av analytisk kvalitet og innkjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). De Annonser i Gmail ble hentet fra Kikkoman Corporation (Japan). Den kjemiske sammensetningen og stabilitet av annonser i Gmail har blitt beskrevet tidligere [9], [10].
Cells og kultur vilkår
Menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer, ASPC-1, Panc-1 og Miapaca -2, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD), og dyrket som anbefalt som monolag i DMEM supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 100 mikrogram /ml penicillin og 100 ug /mL streptomycin fra Invitrogen (Carlsbad, CA) i en fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. De annonser i Gmail ble oppløst i en liten mengde dimetylsulfoksyd (DMSO, 100 ul) før tilsetning til mediet. Den maksimale konsentrasjon av DMSO i mediet ikke overstige 0,1% (v /v). Celler behandlet med DMSO bare fungerte som et kjøretøy kontroll.
Cell levedyktighet og celledød analyser
Effekten av annonser i Gmail på levedyktigheten til bukspyttkjertelen carcinoma celler ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse som beskrevet tidligere [24 ]. I korthet ble cellene behandlet med eller uten annonser i Gmail i 24 og 48 timer. Ved slutten av fastsatt tid, ble cellene behandlet med 50 ul av 5 mg /ml MTT og de resulterende formazankrystaller ble oppløst i 150 ul DMSO. Fargen absorbans ble registrert ved 540 nm ved hjelp av en Bio-Rad 3350 mikroplateleser. Effekten av annonser i Gmail på cellelevedyktigheten ble beregnet i form av prosent av kontroll, som ble vilkårlig gitt en verdi på 100% levedyktighet. Annonser i Gmail-indusert celledød ble bestemt ved anvendelse av en trypan blått fargestoff utelukkelse assay som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene behandlet med eller uten annonser i Gmail i 24 og 48 timer. Deretter ble cellene høstet, behandlet med 0,25% trypan-blått fargestoff, og cellene som hadde tatt opp fargestoffet ble tellet under et mikroskop ved bruk av et hemocytometer. Den annonser i Gmail-indusert celledød er uttrykt som gjennomsnitt ± SD prosentandelen av døde celler i hver behandlingsgruppe fra tre gjentatte forsøk.
cellesyklusanalyse
Miapaca-2 og PANC-1-cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av annonser i Gmail (0, 20, 40 og 60 ug /mL) i komplett medium i 48 timer. Cellene ble deretter høstet, og bearbeidet for cellesyklusanalyse, som beskrevet tidligere [24]. I korthet, den 1 x 10
5-celler ble resuspendert i 50 ul kald PBS hvortil 450 pl kald metanol ble tilsatt, og cellene ble deretter inkubert i 1 time ved 4 ° C. Etter sentrifugering ble pelleten inkubert med RNase A (20 ug /ml) i 30 min. Cellene ble inkubert med propidiumjodid (50 ug /ml) på is i mørket. Cellesyklus distribusjon av cellene ble deretter bestemt ved hjelp av en FACS Calibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) utstyrt med Cell quest 3.3-programvare i Core Facility av UAB Comprehensive Cancer Center.
apoptotisk celledød analyse av flowcytometri
Annonser i Gmail-indusert celledød ved apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler ble bestemt kvantitativt ved flowcytometri bruke Annexin V-konjugert Alexa Fluor 488 apoptose Detection Kit følge produsentens protokoll, som tidligere beskrevet [24]. I korthet, etter behandling av celler med annonser i Gmail i 48 timer, ble cellene høstet, vasket med PBS og inkubert med Annexin V Alexa fluor488 (Alexa488) og propidiumjodid i 10 min i mørket. De fargede cellene ble deretter analysert ved fluorescens aktivert celle sortering ved hjelp av FACSCalibur instrument (BD Biosciences) og Cell quest 3.3 software.
Western blot analyse
Etter behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med eller uten annonser i Gmail ble cellene høstet, vasket med kald PBS og lysert med iskald lyseringsbuffer supplert med protease-inhibitorer som beskrevet tidligere [24]. For western blot analyse, ble proteiner løst på 10% Tris-glysin gels og overført til en nitrocellulosemembran. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter, ble membranen inkubert med det primære antistoff ved 4 ° C over natten. Membranen ble deretter inkubert med det passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff og de immunoreaktive proteinbånd ble visualisert ved hjelp av forbedrede Chemiluminescence reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Membranen ble deretter strippet og reprobed med anti-actin β-antistoff for å bekrefte lik proteinet blir lastet på gelen.
Dyr og tumor xenograft modell
Dame atymiske nakne mus av 4-5 uker etter alder ble kjøpt fra National Cancer Institute (Bethesda, MD) og plassert i Animal Resource Facility ved University of Alabama i Birmingham i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. Dyret protokoll som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham, og dyret protokollnummer er: 101109267. Mus ble levert med en sterilisert AIN76A diett og vann
ad libitum
. For å bestemme
in vivo
kjemoterapeutisk effekt av kosttilskudd annonser i Gmail mot menneskehandel i bukspyttkjertelen svulst xenograft vekst, eksponentielt voksende Miapaca-2 celler (5 × 10
6 i 100 mL PBS) ble injisert subkutant i høyre flanke hver mus. En dag etter tumorcelle inokulering ble dyrene tilfeldig fordelt i to grupper med åtte mus per gruppe. Én gruppe mus fikk AIN76A kontroll diett, mens den andre gruppen av mus fikk en 0,5% annonser i Gmail-supplert AIN76A kontrolldiett i pelletform gjennom hele eksperimentet perioden. Forsøket ble avsluttet ved 11
th uke etter tumorcelle vaksinasjon. Tumorvekst og kroppsvekt per mus per uke ble registrert. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av Vernier calipers og volumene ble beregnet ved bruk av hemiellipsoid modell formel: tumorvolum = ½ (4π /3) (l /2) (w /2) h, hvor l = lengde, w = bredde og h = høyde . Basert på IACUC retningslinjer, bør tumorstørrelse ikke øke mer enn 1,5 cm
2 eller størrelse med en krone. På dette trinn ble forsøket avsluttet, ble musene avlivet, tumor fra hver mus ble skåret ut og den våte vekten av hver tumor i hver gruppe ble notert. En del av tumoren ble anvendt for å fremstille tumor lysater av western blot-analyse, og den andre delen av vev ble parafin-innleiret og anvendt for immunhistokjemisk analyse.
Immunohistokjemisk påvisning av Ki-67-positiv, p-Akt -positive og aktivert kaspase-3-positive celler
parafininnstøpte tumorseksjoner (5 um tykke) ble deparaffinized og rehydrert, som tidligere beskrevet [25]. Etter rehydrering, ble antigenet gjenfinning utføres ved å plassere objektglassene i 10 mmol /l natriumcitrat-buffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 20 minutter etterfulgt av 20 minutters kjøling. Snittene ble deretter vasket i PBS og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 1% bovint serumalbumin med 2% geiteserum i PBS før inkubering med enten anti-Ki-67, anti-p-Akt eller anti-spaltet caspase-3- antistoff. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert streptavidin. Seksjonene ble videre inkubert med 2,4-diaminobenzidin substrat og motfarget med hematoksylin. De Ki-67-positive og spaltet kaspase-3-positive celler i et avsnitt ble telt i minst 4-5 forskjellige felter og fotografert ved hjelp av et Olympus mikroskop (modell BX40F4, Tokyo, Japan) utstyrt med en Q-farge 5 Olympus kamera.
TUNEL analyse for apoptotiske celler
tunel analysen ble utført ved hjelp av blindgaten
TM Colorimetric TUNEL System Kit (Promega Corporation, USA) etter produsentens protokoll. I korthet, etter antigen henting, tumorseksjoner (5 um tykke) ble fiksert ved inkubering med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C. De permeabiliserte seksjoner ble inkubert med terminal deoksynukleotidyl transferase rekombinant (rTdT) enzym-katalyserte reaksjons og nucleotide blandingen i 60 minutter ved 37 ° C i mørket. Etter nedsenking i stopp /vaskebuffer i 15 min ved romtemperatur, ble seksjonene vasket med PBS for å fjerne ikke-inkorporerte fluorescein-12-dUTP og kjernene motfarget med hematoksylin. TUNEL-positive celler ble undersøkt og tellet under mikroskop. Tunel-positive celler er uttrykt som en prosentandel av totale celler i mikroskopiske feltet.
Statistisk analyse
Den statistiske betydningen av forskjellen mellom verdiene av kontroll- og behandlingsgrupper ble bestemt av enten student
t
test eller enkle enveis ANOVA etterfulgt av Tukey sin
post hoc
test for multiple sammenligninger ved hjelp GraphPad Prism versjon 4.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego, California, USA, www. graphpad.com. I hvert tilfelle,
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Annonser i Gmail hemme levedyktighet og indusere død av kreft i bukspyttkjertelen celler
antiproliferative. effekter av annonser i Gmail på bukspyttkjertelkreft cellelinjer, Miapaca-2, PANC-en og ASPC-1, ble bestemt ved hjelp av en MTT analyse. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av annonser i Gmail (0, 10, 20, 40 og 60 ug /ml) i 24 og 48 timer. En doseavhengig reduksjon i levedyktigheten av de Miapaca-2-celler ble observert som varierte 2-35% (
P
0,05) etter 24 timer, og 20 til 60% (
P
0,01) etter 48 timers behandling med annonser i Gmail, som vist i Figur 1A. Under identiske betingelser ble det tilsvarende virkninger av annonser i Gmail observert på behandling av Panc-1 og ASPC-1 celler (figur 1B og 1C, venstre paneler), bortsett fra at den annonser i Gmail-indusert reduksjon av levedyktigheten til ASPC-1-celler var mindre enn den som ble observert for de andre cellelinjer. Vi har også bestemt den cytotoksiske effekten av annonser i Gmail på bukspyttkjertelkreft cellelinjer i form av celledød ved hjelp av trypan blått fargestoff eksklusjon analysen. Som vist i figur 1A (høyre panel), sammenlignet med de ikke-annonser i Gmail-behandlede kontrollceller, behandling av Miapaca-2-celler med annonser i Gmail resulterte i en signifikant og doseavhengig økning i celledød. Behandling for 24 timer resulterte i en 5-28% (
P
0,05) økning i celledød, mens behandling i 48 timer resulterte i 9-38% (
P
0,05 -0,001) celledød. Ved hjelp av identiske betingelser ble det tilsvarende cytotoksiske effekter observert ved behandling av Panc-1 og ASPC-1 celler med annonser i Gmail (figur 1B og 1C, høyre panel).
(A) Miapaca-2-celler, (B) PANC -1-celler, og (c) ASPC-1-cellene ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av annonser i Gmail for de angitte tidsperioder. Venstre paneler: Livskraftig av cellene ble bestemt ved hjelp av MTT analyse som beskrevet i Materialer og metoder. Dataene er uttrykt i form av prosent av kontrollceller (ikke-annonser i Gmail behandlet) som gjennomsnitt ± SD av 8 replikater. Høyre panel: Den cytotoksiske effekten av annonser i Gmail på kreft i bukspyttkjertelen celler ble bestemt ved anvendelse av trypan blått fargestoff utelukkelse analyse som beskrevet i Materialer og metoder. Celledød data presenteres som gjennomsnittlig prosent av døde celler fra tre eksperimenter ± SD
vs.
Kontrollgruppen (ikke-annonser i Gmail-behandlet). Signifikant forskjell
vs
kontrollgruppen,
*
P
. 0,001;
**
P
. 0,05
Annonser i Gmail indusere G2-M fasen cellesyklus arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler
Forstyrrelse av den normale celle- syklusprogresjon og divisjon er viktige hendelser i utviklingen av kreft. For å bestemme de mulige mekanismer av anti-proliferative effekter av annonser i Gmail, ble cellesyklusanalyse foretas ved hjelp av Miapaca-2 og PANC-1-cellelinjer som ble behandlet med 20, 40 eller 60 ug /ml av annonser i Gmail. Som vist i figur 2A, etter behandling av Miapaca-2-celler med annonser i Gmail i 48 timer var det signifikant høyere antall celler i G2-M-fase ved alle konsentrasjoner anvendes: 20 pg /ml (15,5%,
P
0,05), 40 pg /ml (23,9%,
P
0,01) og 60 mikrogram /ml (29,4%,
P
0,001) sammenlignet med den ikke-annonser i Gmail-behandlede kontroller (5,9%). Ved 24 timers tids punkt, effekten av annonser i Gmail på G2 /M cellesyklus-stans var betydelig mindre enn det som ble observert etter behandling i 48 timer. Lignende effekter av annonser i Gmail på G2 /M fase arrestasjonen ble funnet ved hjelp av PANC-en cellelinje (figur 2B). Vi har fastslått ved virkningen av annonser i Gmail på cellesyklusregulerende proteiner som er involvert i G2 /M-fasen av cellesyklusprogresjon. Resultatene av Western-blotting viste at behandling av Miapaca-2 og PANC-1-celler med varierende konsentrasjoner av annonser i Gmail i 48 timer førte til en doseavhengig reduksjon i den cyklin B1 ekspresjon, så vel som en reduksjon i uttrykket nivåer av Cdc25B og Cdc25C proteiner som regulerer G2 /M-fasen av cellesyklus (figur 2C).
Miapaca-2 og PANC-1-cellene ble behandlet med enten bærer (0,1% DMSO) eller annonser i Gmail (20, 40 og 60 ug /mL) i komplett medium. Etter 48 timers behandling, ble cellene høstet og spaltet med RNase. Cellulær DNA ble farget med propidiumjodid og strømningscytometrisk analyse ble utført for å analysere cellesyklusfordeling, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. De representative cellesyklus histogrammer fra to uavhengige eksperimenter i Miapaca-2 (A) og PANC-1 (B) celler etter behandling med forskjellige doser av annonser i Gmail er vist. (C) Virkning av annonser i Gmail på G2 /M-fase cellesyklusregulerende proteiner i Miapaca-2 og PANC-1-celler. Cellene ble behandlet med enten bærer eller annonser i Gmail (20, 40, 60 ug /ml i DMSO) i 48 timer og deretter høstet, cellelysater fremstilt og deretter utsatt for SDS-PAGE etterfulgt av western blot-analyser for forskjellige proteiner. β-aktin ble benyttet for å bekrefte lik belastning av prøvene. Representative blotter fra tre individuelle forsøk er vist.
Annonser i Gmail indusere apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler
For å undersøke om reduksjonen i celle levedyktighet og induksjon av G2 /M fase arrest i menneskelig bukspyttkjertelen kreftceller hos annonser i Gmail behandling var knyttet til induksjonen av apoptose ble Miapaca-2 og PANC-1-celler behandlet med varierende konsentrasjoner av annonser i Gmail og andelen av apoptotiske celler ble vurdert ved hjelp av Alexa488 apoptotisk Detection Kit. Apoptotisk celledød ble bestemt i form av tidligfase eller sent stadium apoptotiske celler, som er vist henholdsvis i nedre høyre (LR) og øvre høyre (UR) kvadranter av FACS histogrammer (figur 3A). Behandling av de Miapaca-2 og PANC-1-celler med annonser i Gmail for 48 timer resulterte i signifikant induksjon av apoptose i begge cellelinjer. Prosentandelene av totale apoptotiske celler (i UR + LR kvadranter) i Miapaca-2 celler etter GSPS behandlinger var som følger: 5,2% (bærerbehandlet kontroll), 16,6% (20 ug /ml,
P
0,01), og 35,8% (60 ug /ml,
P
0,001), som oppsummert i panel B Det ble ikke observert. Lignende annonser i Gmail-induksjon av apoptose når PANC-1-cellene ble behandlet med annonser i Gmail i 48 timer, som vist i figur 3A og 3B.
(A) Miapaca-2 og PANC-1-cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av annonser i Gmail (0, 20, 40 og 60 ug /mL) i komplett medium i 48 timer og deretter høstet for analyse av apoptotiske celler ved FACS-analyse ved bruk av Annexin V-Alexa Fluor488 Apoptose Vybrant Assay Kit (Alexa488) etter produsentens protokoll. Den nedre høyre (LR) kvadrant av FACS histogrammer viser prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (Alexa488-farget celler) og øverst til høyre (UR) kvadrant viser prosentandelen av sen apoptotiske celler (Alexa488 + propidiumjodid–farget celler). (B) Total prosentandeler av apoptotiske celler i hver behandlingsgruppe etter 48 timer er sammenfattet med data presentert som gjennomsnitt ± SD av to eksperimenter. Signifikant forskjell
vs
kontrollgruppen (ikke-annonser i Gmail-behandlet), *
P
. 0,001; **
P
0,05. (C) Behandling av Miapaca-2 og PANC-1-celler med varierende konsentrasjoner av annonser i Gmail i 48 timer resulterer i en doseavhengig reduksjon i uttrykket nivåer av anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og Bcl-xl) og samtidig øke uttrykk for den pro-apoptotiske proteiner Bax. Annonser i Gmail også øke aktiveringsnivå caspase-3 i cellene.
Effekt av annonser i Gmail på proteiner av Bcl-2 familien i kreft i bukspyttkjertelen celler
Medlemmer av Bcl-2 familien av proteiner spiller avgjørende roller i regulering av apoptose ved å virke som aktivatorer eller inhibitorer av celledød [26] – [28]. Western blot analyse viste at behandling av Miapaca-2-celler med annonser i Gmail (20, 40, 60 ug /ml) i 48 timer førte til en doseavhengig reduksjon i Bcl-2 og Bcl-xl proteinekspresjon (figur 3C), mens uttrykket av Bax var markert oppregulert med økende konsentrasjoner av annonser i Gmail (figur 3C). Tilsvarende effekt av annonser i Gmail på proteinene i Bcl-2-familien ble også funnet når PANC-1-cellene ble behandlet med annonser i Gmail i 48 timer. Som spaltes kaspase 3 er ansett for å være et kjennetegn på apoptose, vi bestemmes også effekten av annonser i Gmail på det spaltede caspase-3 i disse prøvene, og bekreftet at annonser i Gmail økte aktivering eller spalting av caspase-3 i både Miapaca-2 og PANC -1 celler (Figur 3C).
Annonser i Gmail hemme PI3K /Akt uttrykk i kreftceller
Som PI3K /Akt signalveien spiller en avgjørende rolle i kreft celle overlevelse og utvikling av kreft, vi undersøkte effekten av annonser i Gmail på denne celleoverlevelsesreaksjonsveien. Miapaca-2 og PANC-1-cellene ble behandlet med annonser i Gmail i 48 timer, cellelysater fremstilt og nivåene av PI3K og fosforylering av Akt ved Ser
473 bestemt ved western blot-analyse. Resultatene viste at behandling av disse cellelinjer med annonser i Gmail i 48 h reduserte nivåene av både den regulatoriske (P85) og katalytiske (P110) underenheter av PI3K og også redusert fosforylering av Akt ved Ser
473 i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4A). Som det er vel kjent at Akt-aktivitet reguleres vanligvis ved hjelp av aktiv PI3K, vi videre bekreftet at Akt reguleres av PI3K i kreft i bukspyttkjertelen celler. For dette formålet, vi banket ned PI3K i Miapaca-2 og PANC-1 celler ved hjelp PI3K siRNA kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) etter produsentens protokoll. Som vist i figur 4B, western blot analyse viste at siRNA knockdown av PI3K resulterte i markert reduksjon i nivåene av p-Akt i begge Miapaca-2 og PANC-1-celler. Effekten på total Akt ekspresjon ikke ble observert i disse cellelinjer om siRNA knockdown av PI3K. Knockdown av PI3K proteiner ble også bekreftet ved hjelp western blotting.
(A) Behandling av Miapaca-2 og Panc-1 celler med annonser i Gmail reduserer uttrykket nivået av PI3Kp85 (regulatorisk) og PI3Kp110 (katalytisk), og fosforylering av Akt i en doseavhengig måte. Etter behandling i 48 timer, ble cellene høstet, og cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse for å bestemme ekspresjon av forskjellige proteiner. β-aktin ble benyttet for å bekrefte lik lasting av proteinprøvene. (B) siRNA knockdown av PI3K i kreft i bukspyttkjertelen celler resulterte i reduksjon av p-Akt nivåer sammenlignet med siRNA kontrollgruppen.
Kostholds annonser i Gmail hemme veksten av pankreas tumorxenotransplantater i atymiske nakne mus
som disse
in vitro
studier indikerte at behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med annonser i Gmail reduserer levedyktighet og induserer apoptose av disse cellene, forsøkte vi å finne ut om kosttilskudd administrasjon av GSPS hemmer
in vivo
tumorvekst ved hjelp av en xenograft mus modell. Som den terapeutiske effekten av annonser i Gmail på Miapaca-2 og PANC-1-cellelinjer ble identiske, vi valgte Miapaca-2-cellelinje for disse
in vivo
studier. I tidligere studier har vi også funnet ut at kosttilskudd annonser i Gmail ved dose på 0,5% induserte betydelige veksthemmende effekt på svulster [9], [29], har vi valgt denne dosen av annonser i Gmail for videre
in vivo
studien. Musene ble gitt AIN76A kontrolldiett alene, eller den samme diett supplert med annonser i Gmail (0,5%, vekt /vekt). De gjennomsnittlige kroppsvekt for annonser i Gmail-behandlede og ikke-annonser i Gmail-behandlede mus var sammenlign gjennom hele forsøksperioden (data ikke vist). Tilsvarende hadde musene som ble gitt annonser i Gmail i kostholdet ikke oppviser noen fysiske tegn på toksisitet eller unormal oppførsel (data ikke vist). Disse dataene antyder at administrasjon av annonser i Gmail i kosten på konsentrasjonen brukt i disse studiene ikke er assosiert med tilsynelatende brutto toksisitet.
Ukentlig måling av tumorvolumet indikert at den gjennomsnittlige tumorvekst i form av total tumor volum /mus var høyere hos de ikke-annonser i Gmail-behandlede mus enn de GSPS-behandlede grupper. Som vist i figur 5A, i mus som mottok annonser i Gmail ved en dose på 0,5% i kostholdet, tumorvolumet ved avslutningen av eksperimentet var 64% (
P
0,005) mindre. Forsøket ble avsluttet på 11
th uke etter tumorcelle implantasjon. På dette tidspunkt ble musene avlivet, tumorene høstet, og den våte vekt av tumor /mus i hver behandlingsgruppe ble registrert. Som vist i figur 5A (høyre panel), den våte vekten av svulstene var 68% lavere (
P
0,005) i mus administrert 0,5% annonser i Gmail i dietten i forhold til de tumorer fra ikke-annonser i Gmail behandlede mus.
(A) Dietary administrering av annonser i Gmail (0,5%, w /w) hemmer veksten av Miapaca-2 celler dyrket som xenotransplantater i atymiske nakne mus. Gjennomsnittlig tumorvolum ± SD /mus (mm3) i hver behandlingsgruppe ble målt på ukentlig basis. Tumor xenograft vev ble høstet ved avslutningen av eksperimentet på 11 uker, og den våte vekt av tumor /mus i hver gruppe er rapportert i gram som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikant forskjell mellom kontroll og annonser i Gmail-behandlede grupper ble analysert ved en-veis ANOVA etterfulgt av Bonferroni
t
test, n = 8. statistisk signifikans
vs
tumorer fra ikke-GSPs- behandlede kontroll mus, *
P
0,005. (B) Den immunohistokjemisk påvisning av TUNEL-positive celler i tumor xenograft vev fra mus administrert annonser i Gmail i kosten og mus som ikke fikk annonser i Gmail er vist, og resulterende data på TUNEL-positive celler er oppsummert. (C) Immunohistokjemisk påvisning av aktiverte caspase-3-positive celler i tumor xenograft vev fra annonser i Gmail-behandlede og ikke-annonser i Gmail-behandlede mus. Immunhistokjemiske data i form av prosentandelen av positive celler er presentert som gjennomsnitt ± SD av 5-6 tumorprøver fra hver gruppe. TUNEL-positive eller caspase-3-positive celler ble telt i fire til fem ulike felt, og dataene er oppsummert i form av prosent positive celler fra 5-6 tumor xenograft prøver. Representative mikrografer vises. (D) Dietary annonser i Gmail hemme ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner og samtidig øke ekspresjonen av pro-apoptotiske protein, Bax, og nivåene av aktiverte caspaser-3 i tumor xenograft vev. Tumor lysater ble fremstilt fra tumor-xenografter som samles ved slutten av eksperimentet beskrevet i figur 5A og utsatt for Western blot-analyse, som beskrevet i Materialer og metoder. Representative blotter vises fra uavhengige forsøk fra minst fem svulster fra fem forskjellige mus per gruppe med identiske observasjoner.
Kostholds annonser i Gmail forbedre apoptotisk celledød av pankreas svulstceller i xenografter
Å bestemme hvorvidt inhibering av tumorvekst med kosten annonser i Gmail er forårsaket av død av tumorceller i xenograft vev, evaluerte vi virkningen av annonser i Gmail på den apoptotiske indeksen av tumorceller i xenograft prøver ved å bruke en TUNEL assay.
