Abstract
Bakgrunn
Overlevelsesraten av tykktarmskreft (CRC) pasienter bærer villtype KRAS er betydelig økt ved å kombinere anti-EGFR monoklonalt antistoff (mAb) med standard kjemoterapi. Men motstridende data finnes i både villtype KRAS og muterte KRAS grupper, som sterkt utfordrer CRC anti-EGFR behandling. Her har vi gjennomført en meta-analyse i et forsøk på å gi mer pålitelig informasjon om anti-EGFR behandling i CRC-pasienter.
Metoder
Vi søkte fullstendige rapporter om randomiserte kliniske studier ved hjelp av Medline, den amerikanske Society of Clinical Oncology (ASCO), og European Society for Medical Oncology (ESMO). To etterforskere uavhengig skjermet publisert litteratur i henhold til våre inkluderende og eksklusive kriterier og de relative data ble hentet. Vi brukte omtale manager 5.2 programvare for å analysere dataene.
Resultater
Tillegg av anti-EGFR mAb til standard kjemoterapi betydelig forbedret både progresjonsfri overlevelse (PFS) og median total overlevelse (MOS ) i villtype KRAS gruppe; hazard ratio (HRS) for PFS og MOS var 0,70 [95% konfidensintervall (CI), 0,58 til 0,84] og 0,83 [95% CI, 0,75 til 0,91], henholdsvis. I under analyser av villtype KRAS gruppe, når PCR-baserte analyser er ansatt, PFS og Mos særlig øke: HRS var 0,74 [95% CI, 0,62 til 0,88] og 0,87 [95% CI, 0,78 til 0,96] hhv. I under analyser av mutert KRAS gruppe, verken PCR-baserte analyser eller direkte sekvense forbedre PFS eller Mos.
Konklusjon
Våre data tyder på at PCR-baserte analyser med høy sensitivitet og spesifisitet tillate nøyaktig identifikasjon av pasienter med villtype KRAS og dermed øke PFS og Mos. Videre slike analyser frigjøre pasienter med mutert KRAS fra unødvendige bivirkninger, og gi dem en mulighet til å få nødvendig behandling. Dermed etablere en presis standard referansetesten vil vesentlig optimalisere CRC-målrettet terapi
Citation. Shan L, Li M, Ma J, Zhang H (2014) PCR-baserte analyser versus direkte Sekvensering for å vurdere effekten av KRAS Status på Anti-EGFR respons på behandling hos pasienter med kolorektal kreft: en systematisk oversikt og meta-analyse. PLoS ONE ni (9): e107926. doi: 10,1371 /journal.pone.0107926
Redaktør: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 07.04.2014; Godkjent: 21 august 2014; Publisert: 26.09.2014
Copyright: © 2014 Shan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Finansieringen ble gitt av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 30901727, 81372496). HZ mottatt utlysninger fra Forskningsrådet. URL for 81372496: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. URL for 30901727: https://isisn.nsfc.gov.cn/egrantindex/funcindex/prjsearch-list. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Ingen forfattere erklært eventuelle interessekonflikter
Innledning
i løpet av de siste to tiårene, betydelig fremgang om molekylærbiologi av tykk- og endetarmskreft (CRC) har bemerkelsesverdig økt de biologiske behandlingsalternativer [1]. Et viktig gjennombrudd var oppdagelsen av to monoklonale antistoffer (mAb) rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR): kimære immunoglobulin G1 mAb (cetuximab) og et fullt humanisert immunoglobulin G2 mAb (panitumumab). Disse antistoffer er blitt funnet å være meget effektiv i kombinasjon med standard kjemoterapi eller som enkle terapeutiske midler for kjemoterapi-resistente metastatisk CRC (mCRC) [2], [3]. I 2004, USA Food and Drug Administration (FDA) godkjente cetuximab som første mAb hemme EGFR for behandling av mCRC, som ble etterfulgt av godkjenning av panitumumab i 2006 [4], [5]. Dessverre har nesten en tredjedel av mCRC pasienter ikke har nytte av dette målrettet terapi, men også oppleve følge bivirkninger [6], [7]. Dermed er det viktig å identifisere de pasientene som er mest sannsynlig til å svare for å oppnå personlig behandling. KRAS protein er en viktig signalmolekyl mellom ekstracellulære EGFR-ligander og signalering i cellene. Omfattende retrospektive studier og fase III-studier avslørte at KRAS genet aktiverende mutasjoner er de viktigste negative prediktor for mCRC anti-EGFR terapi [8] – [10]. Basert på disse funnene, FDA endret retningslinjene for å anbefale at cetuximab og panitumumab kun gis til CRC pasienter med villtype KRAS [11]. Imidlertid forskere fortsetter å rapportere motstridende fakta i både KRAS villtype og mutant-grupper, for eksempel, har pasienter som bærer villtype KRAS ikke reagere, mens de som bærer mutante KRAS gjorde [12] – [15]. Slike motstridende data sterkt utfordre mCRC behandling. Uavhengig av sporadisk rapportert innskudd i andre genvariasjoner som BRAF mutasjoner, PIK3CA mutasjoner og tap av PTEN uttrykk [16] – [19], nøyaktigheten av genotyping metoder kan forklare dette fenomenet. For eksempel, en eksperimentell studie støtter denne hypotesen ved å vise svært følsomme metoder for påvisning av KRAS-mutasjoner identifisert 13 flere mCRC pasienter motstandsdyktig mot anti-EGFR mAb sammenlignet med direkte sekvensering [20].
For å systematisk løse dette problemet, vi gjennomført en systematisk oversikt og meta-analyse for å vurdere progresjonsfri overlevelse (PFS) og median total overlevelse (MOS) hos pasienter med KRAS-status ble oppdaget av enten PCR-baserte analyser eller direkte sekvensering. Vi sammenlignet evnen til disse to genotyping metoder for å evaluere effekten av KRAS-status på svar på CRC anti-EGFR behandling.
Metoder
Søkestrategi
Frist for rettssaken publikasjon var 31. desember 2013. Full rapporter om randomiserte kliniske forsøk som er adressert effekten av KRAS-status på svar på CRC anti-EGFR behandling ble samlet gjennom Medline (PubMed: www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed), den amerikanske Society of Clinical Oncology (ASCO, www.asco.org) og European Society for Medical Oncology (ESMO, www.esmo.org). Søkeordene som brukes for å søke var: CRC, KRAS mutasjon, cetuximab, panitumumab, kjemoterapi, randomisert, og anti-EGFR mAb. Vi først utelukket doble antistoffprotokoller som også evaluert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) antistoff. Vi søkte målet forsøkene i henhold til arbeidsflyten vist i figur 1.
pasientgrupper og undergrupper
For å vurdere den samlede effekten av anti-EGFR mAb narkotika som et tillegg til standard kjemoterapi, fordelt vi alle inkluderte pasientene i to grupper: den eksperimentelle gruppen, behandlet med en kombinasjon av anti-EGFR mAb og standard kjemoterapi; og kontrollgruppen, behandlet med standard kjemoterapi. Vi analyserte deretter effekten av KRAS status på respons til anti-EGFR behandling ved ytterligere å dele pasientene inn i villtype KRAS og muterte KRAS grupper. For å utføre sub-analyser for å sammenligne evnen til forskjellige genotyping metoder for å evaluere effekten av KRAS status på respons på CRC anti-EGFR behandling, separeres vi pasienter med forskjellig KRAS status i to undergrupper: PCR-baserte analysen undergruppe og den direkte sekvense gruppen.
Statistiske analyser
Vi hentet hazard ratio (HRS) for PFS og MOS med 95% konfidensintervall (cIS) fra de registrerte studier. PFS og MOS-data for hvert forsøk er representert ved log for HR og dens varians av eksperimentelle sammenlignet med kontrollgruppen i begge pasienter med villtype og mutant KRAS, i henhold til en tidligere beskrevet metode [21]. En HR 1 indikerer en forbedring i PFS eller mos. Hvis forsøkene rapportert log HR og varians, brukte vi dem direkte. Ved forsøkene ikke gir disse verdiene, ble ekstrahert vi data fra overlevelseskurver, når det er tilgjengelig, for å beregne verdiene av log HR og varians. Når overlevelseskurver for behandlingsgruppene ikke var tilgjengelig, andre data, for eksempel log-rank test P-verdier og antall hendelser i hver gruppe, ble hentet for å tillate estimering av loggen HR og varians. For å få sammendrag timer med den eksperimentelle gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, ble logg HRS samlet bruk av et tilfeldig effekt modell eller fast effekt modell for kontinuerlige utfall med konfigurasjons satt til 95% betydning [22]. For å finne riktig modell, benyttet vi omtale manager 5.2 programvare for å analysere inter-studie heterogenitet. Når
P
verdi for heterogenitet var mindre enn 0,05, vi valgte en tilfeldig effekt modell. Når
P
verdi for heterogenitet var større enn eller lik 0,05, vi valgte en fast effekt modellen.
Resultater
Valgte Trials
identifisert ti forsøk i henhold til arbeidsflyten vist i Figur 1 [13], [23] – [31]. Disse forsøkene er oppført i tabell 1. Totalt 6699 pasienter ble evaluert i denne meta-analysen.
progresjonsfri overlevelse (PFS)
Resultatene viser tillegg av anti -EGFR terapi med standard kjemoterapi er presentert i figur 2. for alle pasienter, med eller uten KRAS mutasjoner, tilsetning av anti-EGFR-terapi bemerkelsesverdig forbedret PFS [HR 0,84, (95% CI, 0,73 til 0,98), p = 0,02] i henhold til et tilfeldig effekt modell (P-verdi for heterogenitet 0,00001). Når vi har evaluert data basert på KRAS status, observerte vi en betydelig forbedring i PFS hos pasienter med villtype status [HR 0,70, (95% CI, 0,58 til 0,84), P = 0,0001] i henhold til en tilfeldig-effekt modell ( P-verdi for heterogenitet 0,00001), men ikke i pasienter med mutert KRAS [HR 1,06, (95% CI, 0,91 til 1,25), P = 0,44] i henhold til en tilfeldig-effekt-modellen (P-verdi for heterogenitet = 0,009). I sub-analyser av villtype KRAS gruppe, PFS betydelig økt i PCR-baserte analysen undergruppe [HR 0,74, (95% CI, 0,62 til 0,88), p = 0,0009] i henhold til en tilfeldig-effekt modell (P-verdi for heterogenitet 0,0001), men ikke i den direkte sekvensering gruppen [HR 0,55, (95% CI, 0,29 til 1,05), P = 0,07] i henhold til en tilfeldig-effekt-modellen (P-verdi for heterogenitet = 0,002). I sub-analyser av det mutante KRAS gruppe, hverken PCR-basert analyse og heller ikke direkte sekvense forbedret PFS [HR 0,99, (95% CI, 0,78 til 1,27), p = 0,96], i henhold til en fast effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,97) og [HR 1,08, (95% KI, 0,89 til 1,32), p = 0,43] i henhold til et tilfeldig effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,0003), henholdsvis.
median total overlevelse (MOS)
for generelle pasienter, tillegg av anti-EGFR ikke bemerkelsesverdig bedre Mos [HR 0,94, (95% KI, 0,83 til 1,05), p = 0,26] ifølge en randomisert effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,002). Men observerte vi en betydelig forbedring av MOS i villtype KRAS gruppe [HR 0,83, (95% KI, 0,75 til 0,91), P 0,0001] i henhold til en fast effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,06). I sub-analyser av villtype KRAS gruppen, økt MOS i PCR-baserte analysen undergruppe, [HR 0,87, (95% CI, 0,78 til 0,96), p = 0,004] i henhold til en fast effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,55). Den direkte sekvense undergruppe bare tatt en prøveperiode, og er ikke relevant for meta-analyse. I mutanten KRAS-gruppen, var det ingen åpenbar forbedring i MOS [HR 1,09, (95% CI, 0,98 til 1,21), P = 0,11] i henhold til en fast effekt modell (P-verdi for heterogenitet = 0,49). I under analyser av mutant-type KRAS undergruppe, gjorde PCR-baserte analyser ikke åpenbart endre terapi for CRC [HR 1,10, (95% KI, 0,99 til 1,23), P = 0,009] i henhold til en fast effekt modell ( P-verdi for heterogenitet = 0,42). I direkte sekvensegruppen, ikke enkelt rettssaken ikke tillate for meta-analyse. Disse dataene er vist i figur 3.
Diskusjoner
Nye molekylære målrettet behandling har vært mye brukt i CRC behandling med fremstående fordelene med høy spesifisitet og lav toksisitet [32]. Nåværende bevis har godkjent at CRC pasienter med villtype KRAS vil svare på anti-EGFR behandling. Men noen pasienter med villtype KRAS ikke viser den forventede responsen, mens noen pasienter med mutert KRAS reagerer godt. En viktig forklaring på slike motstridende observasjon kan være fordi nøyaktigheten av dagens genotyping metoder varierte mellom ulike laboratorier og ulike kliniske studier. I denne studien har vi systematisk analysere mulighetene til PCR-baserte analyser versus direkte sekvensering for å evaluere effekten av KRAS-status på respons på anti-EGFR behandling.
Som forventet, bekrefter nåværende meta-analyse de kliniske fordelene når anti-EGFR-terapi tilsettes til standard kjemoterapi for behandling av mCRC pasienter som hadde villtype KRAS, med en betydelig forbedring i PFS. Når vi utført sub-analyser basert på de ulike genotyping metoder, både PFS og MOS forbedret når PCR-baserte analyser ble ansatt. I disse 10 forsøk, forskere brukt PCR-baserte analyser, inkludert PCR klem-smeltekurve fremgangsmåte og et allel-spesifikk real-time PCR, for å oppdage KRAS mutasjoner. Følsomheten til disse to metodene er 0,1% og 0,5% [33], [34], respektivt. Til sammenligning var sensitiviteten for direkte sekvensering er 10-20% [35]. Dermed PCR-baserte metoder gjør det mulig sensitiv påvisning av lav overflod KRAS-mutasjoner, øke oppklaringsprosenten, utelukker de fleste pasienter med mutert KRAS, og dermed forbedre PFS og Mos. Derfor har vi utsatt en ny ledetråd om motsetningen i mCRC behandling: det er en undergruppe av mCRC pasienter bærende lavnivå KRAS-mutasjoner mellom pasienter med villtype KRAS og de med rikelig mutant KRAS. På grunn av begrenset sensitivitet av analysemetodene er denne undergruppe pasienter vanligvis ikke gruppert på riktig måte, slik at behandling for å gå i feil retning. Dette resulterer i et uforutsigbart utfall for den enkelte pasient, samt dramatisk forvirrer mCRC behandlingsstrategi. En løsning på dette problemet vil forbedre behandlingen av mCRC pasienter.
I forhold til den høye spesifisiteten direkte sekvensering, må vi vurdere spesifisiteten av PCR-baserte analyser når vi bruker genotyping resultatene for å estimere effektiviteten av anti- EGFR målrettet terapi. Den potensielt høye falske positive feilrate av PCR-baserte analyser kan ekskludere pasienter bærer villtype KRAS fra å motta riktig behandling. Her foreslår vi at PCR-baserte analyser vil gruppen noen villtype KRAS pasienter inn i mutant gruppe, og dermed feilaktig øke PFS og mos av mutant gruppen. Interessant, vi ikke observere dette fenomenet i vår studie, noe som tyder på at PCR-baserte analyser som brukes i disse studiene er spesifikke nok til å avsløre mutant KRAS. En av disse analyser er PCR klem- og smeltekurven metoden. Den klemme som er brukt her er peptid-nukleinsyre (PNA), hvor sukkerfosfatryggraden i naturlig nukleinsyre er erstattet med et syntetisk peptid ryggrad og gjenkjenner en sekvens spesifikk DNA adlyder den Watson-Crick hydrogenbinding ordningen [36]. PNA-DNA heterodupleks oppviser usedvanlig termisk stabilitet, mens inkorporering av enhver mistilpasning i duplex vil senke den termiske stabilitet på mer enn 10 ° C; Dette gjør det mulig meget spesifikk mutasjon påvisning [33], [36]. Mutasjon deteksjon av allel-spesifikk real-time PCR er basert på det prinsipp at utvidelsen er effektiv når det 3′-terminale base av en primer samsvarer med sin target, er mens forlengelse ineffektive eller ikke-eksisterende når terminalen basen er feilaktige, og viste også god spesifisitet i tidligere søknader [37], [38]. Den allel-spesifikke real-time PCR benyttes i den aktuelle registrert kliniske forsøk er et assay kommersialisert av DxS Ltd., noe som ytterligere garanterte den høye spesifisitet [39]. I sum, til nettopp direkte personlig CRC behandling, anbefaler vi på det sterkeste slike svært spesifikke metoder eller andre metoder med høy spesifisitet.
Andre aspekter å vurdere en PCR-basert analysen inkluderer gjennomstrømming, forurensning og bekvemmelighet. Kombinasjonen av PCR-amplifisering og real-time PCR i disse to typer av PCR-baserte metoder, PCR klem-smeltekurve analyse og allel-spesifikk real-time PCR, gir høy gjennomstrømning og lukket rør test for påvisning av DNA-mutasjoner uten tungvint post-PCR-metoder. I tillegg sanntidsovervåking mal forsterkning betydelig forbedret tolkning av PCR-resultater [40]. I dag har begge metodene blitt brukt for å søke etter ulike genmutasjoner i ulike tumorprøver. For eksempel, KRAS mutasjoner i Bile [41], EGFR mutasjoner i NSCLC [42], BRAF mutasjoner i CRC [35]. Den DxS gir også validert biomarkør kit for EGFR, RAF, BCR-ABL og andre gener som viser en sammenheng mellom pasient mutasjonsstatus og narkotika respons [39].
Konklusjon
I CRC anti- EGFR behandling, PCR-baserte analyser med høy sensitivitet og spesifisitet muliggjøre effektiv ekskludering av pasienter med muterte KRAS, samt redusere bivirkninger og øke PFS og MOS i KRAS pasienter villtype. Samtidig slike metoder tillater nøyaktig identifisering av KRAS muterte pasienter slik at vi kan virkelig smal pasienten undergruppe med KRAS-mutasjoner og undersøke mer effektive behandlingstilbud for disse pasientene. Derfor er en nøyaktig standard referansetest presserende behov for å optimalisere mCRC-rettet behandling. Selv om de nåværende PCR-baserte metoder har utviklet seg mye bedre enn før, deres sensitivitet og spesifisitet kan ikke bli ytterligere forbedret på grunn av den begrensede oppløsning av det analoge signalet, og de uunngåelige bakgrunns molekyler. Denne begrensningen betydelig reduserer verdien av visse viktige kliniske prøver som krakk og blod hvor mål-DNA utgjør bare en liten brøkdel av den totale DNA. For eksempel, tumor-avledet DNA i blodet patenter med lavere stadium tumor er 0,01 til 0,12% [43]. Den siste tiden utviklet digitale PCR (dPCR) metoden besitter den høyeste potensial til å forbedre gjenkjenning nøyaktighet i form av både sensitivitet og spesifisitet. I dPCR, er maler i en prøve oppdelt i mange minutt individuelle reaksjoner, hver inneholdende høyst en enkelt mal. En slik oppdeling i seksjoner reduserer effektivt støy og øker forsterkningen spesifisiteten av lavnivå maler [44], [45]. Den rapporterte sensitivitet på dPCR nådde 0,0005% [44]. Mer praktisk enn real-time PCR, ikke dPCR ikke krever etablering av standardkurven, og når det gjelder gjennomstrømning 96-brønners versjon dPCR har blitt utviklet [44], [45]. Denne lovende metoden vil tillate oss å vesentlig forstå svulst heterogenitet og forbedre målrettet kreftbehandling [46], [47]. Som konklusjon, gir denne forskningen et mye bredere visjon for hele kreftbehandling feltet.
Hjelpemiddel Informasjon
Sjekkliste S1.
PRISMA sjekkliste
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107926.s001 plakater (DOC)
