Abstract
Vezatin (VEZT), en adherens veikryss trans protein, ble identifisert som en antatt tumor suppressor i vår forrige undersøkelse. Men rollen som VEZT i tumorigenesis fortsatt ukjent. Vi forsøkte å avklare sin epigenetisk regulering og biologiske funksjoner i magekreft. I denne studien viser vi at ekspresjonsnivået av VEZT er involvert i lymfesystemet metastase, dybden av kreft invasjon og TNM trinn i 104 magekreftpasienter. Bisulfat sekvense polymerase kjedereaksjon (BSP) metoder viste at VEZT ble hypermethylated i vev og blod tilsvarende av magekreftpasienter, sammenlignet med friske kontroller.
Helicobacter pylori product: (
H. Pylori
) infeksjon induserer metylering og stanse av VEZT i GES-1 celler. Gjenopprette VEZT uttrykk i MKN-45 og NCI-N87 magekreftceller hemmet vekst, invasjon og tumorigenesis
in vitro og in vivo
. Global mikromatriseanalyse ble anvendt for å analysere den molekylære basis for de biologiske funksjoner av VEZT etter transfeksjon VEZT kombinert med sanntids-PCR og kromatin immunutfelling assay. G-protein-koblet reseptor 56 (GPR56), cellevekst, celledelingen syklus 42 (CDC42), migrasjon /invasjon og transkripsjonsfaktor 19 (TCF19), cellesyklusprogresjon, ble funnet å være direkte VEZT målgener. TCF19, en roman mål av VEZT, ble funksjonelt validert. Overekspresjon av TCF19 i MKN-45 celler økt cellesyklus fremgang og vekst evne. Denne studien tilveiebringer nye innblikk i reguleringen av VEZT-genet, noe som kan representere et potensielt mål for terapeutisk antikreft strategier
relasjon:. Miao R, X Guo, Zhi Q Shi Y, Li L, Mao X, et al. (2013) VEZT, en Novel Antatte Tumor lyddemper, Undertrykker Vekst og tumorgenisiteten av magekreft. PLoS ONE 8 (9): e74409. doi: 10,1371 /journal.pone.0074409
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 1 april 2013; Godkjent: 01.08.2013; Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Miao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra National Youthful Science Foundation of China (81101858), Science Foundation i Shandong-provinsen i Kina (ZR2011HM041, Y2007C102, ZR2011HM076), Key Research Project Natural fra Shandong Science and Technology Commission (2011GGB14158, 2007H2071), Youthful Foundation Science i Shandong-provinsen i Kina (BS2010YY060). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til mannlig kreftrelaterte dødsfall og den tredje største årsaken til kvinnelige kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Det er et stort folkehelseproblem over hele verden [2]. I Kina er det 400.000 nye tilfeller av magekreft og 300.000 dødsfall årlig. Mange saker som led av magekreft har mistet kurativ sjanse med ekstremt dårlig utfall [3]. Derfor er utvikling av nye og effektive terapeutiske metoder er viktig for å redusere magekreft dødelighet. Det har vært kjent at patogenesen av gastriske karsinomer er multifaktoriell, som inkluderer genetisk predisposisjon og miljøfaktorer. Det finnes en rekke genetiske vekslinger inkludert tumorsuppressorgener, onkogener, celleadhesjonsmolekyler og vekstfaktorer [4].
Selv om de molekylære mekanismer for gastrisk carcinogenesis forblir uklar, epigenetisk stanse av tumorrelaterte gener ved promoter hypermethylation har nylig dukket opp som en viktig mekanisme tumorigenesis. Arrangøren hypermethylation profilen er forskjellig i hver krefttype og innen hvert gen, som gir svulst type og gen-spesifikke hypermethylation profiler som kan innebære i den tilsvarende molekylære mekanismen av tumorigenesis. Identifiseringen av en roman genet målrettet av arrangøren hypermethylation kan gi innsikt i mekanismene for inaktivering av tumorundertrykkende stier og er viktig for identifikasjon av tumormarkører i magekreft [5,6].
Nylig vi har identifisert en adherens veikryss trans protein, VEZT som kandidat tumor-suppressor genet. Vi forsøkte å avklare epigenetisk regulering og biologiske funksjoner av VEZT i magekreft. VEZT, en allestedsnærværende integrert protein, er indirekte forbundet med E-cadherin-catenin kompleks og aktin cytoskjelettet [7,8]. Funksjonene har i hovedsak vært utforsket i epitelceller. Tap av VEZT er progressivt skadelig for embryoutvikling [9,10], og VEZT er avgjørende for å bevare integriteten av mobiltelefon veikryss ved langvarig mekanisk stress oppstår på nivå av indre øret hårcellene i respons til lyd. Dessuten fører det indre øret spesifikke VEZT betinget omstøtelse til progressiv døvhet [7]. VEZT er høyt uttrykt i hjernen [8,11]. VEZT er beriket i dendrittutløperne i mus hippocampus nevroner. Bruke VEZT knock-down og betinget knockout før (D6cre) eller etter (CamKIIαcre) fødsel, regulerer VEZT ryggrad morfologi. Morfologiske endringer er ikke forbundet med kompromitterte synaptiske kontakter, men postsynaptiske VEZT spiller en avgjørende rolle i morpho-funksjonelle modning av eksitatoriske postsynaptiske elementer [12].
inaktivering av VEZT genet har blitt identifisert i magekreft, og metyleringen av CpG øyer innenfor promoter-regionen til genet VEZT bidra til dens inaktivering som bestemt ved en tidligere studie utført av vårt laboratorium [13]. Mekanismen for metylering og eksakte rolle VEZT i utviklingen av magekreft er foreløpig ukjent. Målgenene og tilhørende veier av VEZT har ennå ikke blitt identifisert. I denne studien vi systematisk analysert mekanismen for metylering og metylering status av promoteren til VEZT genet. Vi har også analysert sine funksjonelle egenskaper etter oppløsning av VEZT uttrykk
in vitro og in vivo
.
Materialer og metoder
Cellelinjer og vevsprøver
MKN -45, MKN-28, SGC-7901, den udødeliggjort human mage mucosal cellelinje GES-en (gitt av institutt for fordøyelses kirurgi for Ruijin sykehuset tilknyttet Shanghai Jiao Tong University) [13,14,15,16,17] og menneskenavlevene endotelceller (HUVECs) ble bevart i vårt institutt. Gastric kreftcellelinjer SNU-1 og NCI-N87 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). I korthet ble cellene dyrket i RPMI1640 supplementert med 10% føtalt kalveserum og 2 mM L-glutamin. Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2.
Primær gastrisk tumor og normal gastrisk mucosal vev ble oppsamlet fra hver rutine terapeutisk kirurgi eller gastrointestinal endoskopi ved instituttet. Resten var
H. pylori
smittestatus ble bestemt på grunnlag av den raske urease test som tidligere beskrevet [18].
Etikk erklæringen
Skriftlig informert samtykke i studien ble innhentet fra alle deltakerne. 4 uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i Animal Laboratory Center of Provincial Hospital Affiliated til Shandong University (Jinan, Kina) på en 12/12 timers lys /mørke syklus (lysene av på 19: 00) med mat og vann tilgjengelig ad lib. De dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Provincial Hospital Affiliated til Shandong University (Permit Number: SHANS87492). Studien protokollen ble godkjent av etisk komité av Provincial Hospital Affiliated til Shandong University.
Behandling av Laser mikrodisseksjon for vev og celler
Vev ble fjernet så snart som mulig etter reseksjon og festes formalin, innstøpt i parafin, og skåret i 8-mikrometer tykke seksjoner for hematoxylin og eosin (H E) farging. Alle vev ble undersøkt histologisk, og erfarne patologer bekreftet diagnoser. En del av hver prøve ble innebygd i Tissue-Tek
® Optimal Cutting Temperatur ™ (OCT) compound medium (VWR Scientific Produkter, San Diego, CA, USA) i en cryostat og snaps frosset for mikrodisseksjon.
Cells og frosne delen lysbilder var farget like før laser capture mikrodisseksjon (LCM) på is. Kort, delene var laser microdissected bruke en LM200 system (Olympus, Japan /Arcturus Engineering Inc, USA). Områder av interesse ble valgt under mikroskopisk veiledning, og dekket med etylen vinyl termo (EVA) film som er montert på optisk transparent lokk. Infrarød laser ble aktivert ved å trykke på en knapp, som smelter filmen rett over målet celler. Denne smelte forårsaket en binding for å danne mellom cellene og overføringen film som var sterkere enn bindingen mellom cellene og skinnene. De brukes til LCM parametere inkludert en laser diameter på 7,5 mikrometer, laser makt 50-60 mW. Fem tusen laser puls utslipp per eksemplar ble brukt til å «fange» ca 10 000 morfologisk celler fra hvert enkelt tilfelle. Hver populasjon ble estimert til å være mer enn 95% «homogen», som bestemt ved mikroskopisk visualisering av de fangede cellene. Caps med fangede celler ble deretter montert på 0,5 ml microcentrifage rør. Etter mikrodisseksjon kan DNA, RNA eller protein ekstraheres fra porsjoner av microdissected prøver.
Metylering analyse
Genomisk DNA oppnådd fra microdissected cellelinjer, magekreft vev og plasma (0,2 ml ) ble renset ved anvendelse av DNAzol (Invitrogen). Renset DNA ble behandlet med natriumbisulfitt (Sigma, Phoenix, USA) og deretter analysert ved BSP eller spesifikk polymerasekjedereaksjon (MSP) som tidligere beskrevet [13,15]. Amplifiserte bisulfitt-PCR-produktene ble subklonet inn i en TA-vektor-system (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA-sekvensering ble utført på tre individuelle kloner (Sangong). PCR-produktene ble bekreftet ved agarosegelelektroforese og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Primere som brukes er oppsummert i tabell S1.
Electron mikroskopisk observasjon
H. pylori
stammer NCTC11637 (både CagA- og VacApositive) ble gitt av professor Guo ved Institutt for medisinsk mikrobiologi og parasittologi, Institutes of Medical Sciences, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.
H. pylori
stammene ble dyrket rutinemessig i 72 timer på Columbia-agar base (bioMérieux, Frankrike) med 5% saueblod i blandede luft som inneholdt 10% CO
2, 5% O2 og 85% N
2 i 37 ° C. Deretter konverterte vi
H. pylori anbefale til flytende medium inneholdende hjerne-hjerte-infusjon (BD, USA), 10% saueblod, og de samme antibiotika som de som anvendes i Columbia-agar basen. Det flytende medium ble ristet på en ristemaskin (Forma Scientific, USA) med en konstant rotasjonshastighet på 120 rpm.
H. pylori
ble telt ved bruk av et spektrofotometer (Biospec-min, Shimadzu Scientific Instruments, Japan) og vasket med sterilt PBS (pH 7,4, 5000 rpm, 10 min) før bruk. GES-1-celler (4 x 10
5) ble dyrket til konfluens på glass dekkglass i seks-brønners plater, og deretter GES-1-celler ble infisert med
H. pylori
ved en mangfoldighet av infeksjon (MOI) på 100: 1. Etter inkubering i 24 timer, ble de morfologiske forandringer av GES-1 celler observert ved hjelp av en H-800 transmisjons-elektronmikroskop.
Sanntids QRT-PCR-analyse
Renset totalt RNA ble oppnådd fra microdissected celler, ble total RNA ekstrahert ved Trizol løsning. Revers transkripsjon (RT) ble utført i en 20-mL reaksjon i henhold til produsentens anbefalinger (Qiagen). Sanntids QRT-PCR-analyser ble utført ved hjelp av primere som er oppført i tabell S1. Transkripsjons ekspresjonsnivåer ble bestemt ved å kvantifisere intensiteten av PCR-produkt normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ekspresjon. Kvantitativ måling av mRNA-nivåer ble utført ved anvendelse av ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Disse dataene ble analysert ved hjelp av sammenlignende Ct metoden.
Western blotting
Totalt protein ble hentet fra microdissected celler. Signal proteinekstraksjon buffer en system (430-7608-HMS) fra Bio-Rad Corporation ble anvendt for proteinutvinning i våre eksperimenter, og konsentrasjonen ble målt ved hjelp av DC-proteinanalysefremgangsmåten ifølge Bradford (Bio-Rad). En samlet mengde av 100 mikrogram protein fra hver prøve ble separert ved 10% SDS-PAGE-gel og overført til en ekvilibrert polyvinylidendifluorid-membran (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) Proteinene ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL , USA) etter inkubasjon med spesifikke primære antistoff VEZT (1: 2000), IL-6 (1: 2000), AKT (1: 1000), Cag A (1: 3000), IL-8 (1: 3000), ATF3 (1: 2000), og IRX5 (1: 2000) ved 4 ° C over natten og deretter det sekundære antistoff. Protein nivåer ble normalisert til total GAPDH bruker et monoklonalt anti-GAPDH antistoff (Sigma) som tidligere beskrevet [15].
Konstruksjon av ekspresjonsvektor for VEZT og TCF19
VEZT og TCF19 overekspresjon vektor pEGFP -N1-VEZT og pEGFP-N1-TCF19 ble konstruert ved å bruke overlappings-PCR eller PCR-metoden, henholdsvis og primerne anvendt for to vektorer er oppsummert i tabell S1. PCR-produktene ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering og klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren pEGFP-N1 som tidligere beskrevet [15]. MKN-45 og NCI-N87 magekreftcellelinjer ble brukt til overekspresjon studier. Vi innhentet stabilt transfektert kloner av G418 seleksjon (Promega). En stabil transfektant av pEGFP-N1 tom vektor ble anvendt som en kontroll. For transfeksjon, ble kompleksene av Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carlsbad, USA) og en av de plasmider som er nevnt ovenfor fremstilles i henhold til produsentens instruksjoner, og disse kompleksene var direkte blandet med cellene i 24-brønners cellekulturplater ved en tetthet på 4 × 10
4 celler per brønn. Nivået på VEZT eller TCF19 uttrykk etter transfeksjon ble analysert ved real-time PCR.
invasjon, migrasjon og endothelial tube dannelse analyser
Cell invasjon, migrasjon og endotelceller tube formasjons analysene ble utført ved hjelp av MKN -45 og NCI-N87 celler. Cellekultur ble utført i Transwell kamre (Corning, NY, USA). For invasjonen analysen, ble innleggs membraner belagt med fortynnede Matrigel (San Jose, CA, USA). -Celler (1 x 10
5) ble tilsatt til det øvre kammer, og ble dyrket i 48 timer. For overføringen analysen, ble innsatsens membranene ikke er belagt med Matrigel men ble dyrket under de samme betingelser. Til slutt ble membranene innsatsens kuttet og farget med krystallfiolett (0,04% i vann, 100 ml), og de migrerte celler ble tellet under et invertert mikroskop og ble fotografert
In vitro angiogenese ble vurdert ved hjelp av en. endothelial tube-analysen kit (San Diego, California, USA). Kort beskrevet, ble hver brønn av forhåndsavkjølt 96-brønners dyrkningsplater belagt med et tynt lag av ECM gel. HUVECs ble resuspendert i supernatanter samlet fra transfekterte celler. HUVECs (2 x 10
4 celler /brønn) ble tilsatt til den polymeriserte ECM gelen med 300 ml av supernatantene. Etter 18-timers inkubering, ble røret formasjonen egenskaper evaluert ved bestemmelse av rørformede nummer, den rørformede lengde og antall rørformede kryssende noder i fem tilfeldig felt ved bruk av Image Pro Plus software (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA) i henhold til Mirshahi metode [19].
cellevekst og Soft agar-kolonidannelse analysen
Gastric kreftceller (2 × 10
3 celler) ble inkubert med 100 ul kulturmedium i 96 -multiwell plater for en dag ved 37 ° C i 5% CO
2. Cellene ble transfektert med plasmid for 24, 48, 72, 96 og 120 timer. Celletallet ble vurdert ved hjelp av celletelling kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan). I korthet ble CCK-8 (10 ul) tilsatt til hver brønn. Etter 1 time med inkubering ved 37 °, ble absorbans ved 450 nm målt ved bruk av ARVO MX-plateleser (PerkinElmer, Massachusetts, USA). Antallet celler ble bestemt ved den relative absorbans ved 450 nm.
magecancer-celler ble trypsinert til enkeltcellesuspensjoner av 3 x 10
3-celler og deretter ble sådd ut i seks-brønns plater i fullstendig kulturmedium inneholdende 0,3% agar lagvis på toppen av 0,6% agar. Platene ble inkubert ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2 i 16 dager. Kolonier som inneholder minst 50 celler ble scoret. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av fem vilkårlig skåret felt.
tumorvekst i nakne mus
-celler (1 x 10
6-celler i 100 mL) fra kreftcellene linjer transfektert med tom vektor eller en VEZT ekspresjonsvektor ble samlet og inokulert subkutant i høyre flanke regionene i fire uker gamle BALB /c naken mus (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). Tumornoduler ble målt etter 4 dager med calipers. Mus ble avlivet etter 1 måned. Tumorvekstkurver og veksthemmingsrater ble beregnet. To mus ble benyttet for de eksperimentelle og kontrollgrupper, og tre uavhengige eksperimenter ble utført som tidligere beskrevet [15,16].
Global cDNA mikromatriseanalyse og målgenet verifisering
Renset total RNA var oppnådd fra microdissected cellene. Hele menneskelige genom oligo mikromatriser (Agilent, Santa Clara, CA, USA) ble brukt. Etter hybridisering og vasking ble microarray lysbilder skannes med en Agilent DNA microarray scanner. De resulterende tekstfiler hentet fra Agilent Feature Extraction programvare (versjon 9.5.3) ble importert til Agilent GeneSpring GX-programvaren (versjon 7.3) for videre analyse. Differensielt uttrykte gener ble identifisert gjennom fold-endring screening. For målet genet verifikasjon vi brukte real-time PCR og kromatin immunoprecipitation analysen. Primerne for målgener er oppført i tabell S1.
Flowcytometrisk analyse av cellesyklus
En dag før transfeksjon, 1 × 10
6 celler av MKN-45 celler ble sådd inn i 6-brønners kulturplater uten antibiotika. Cellene ble transfektert med tom vektor eller en TCF19 ekspresjonsvektor. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene høstet og fiksert i 70% etanol ved -20 ° C over natten, og deretter farget med 250 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich), 5 pg /ml RNase A (Sigma-Aldrich) og 5 mmol /l EDTA i PBS (pH 7,4) i 30 min. Cellesyklus analyse ble gjort av FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA).
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp SPSS15.0 programvare (SPSS Inc, USA). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik fra minst tre separate forsøk. Korrelasjonen mellom VEZT uttrykk i svulstene og clinicopathologic variabler ble beregnet med Kruskal-Wallis rang test og Mann-Whitney U test. Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av t-test og Chi-kvadrat test. En verdi på
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Forholdet mellom VEZT uttrykk nivåer og clinicopathological faktorer hos pasienter med magekreft
Vi undersøkte sammenhengen mellom VEZT uttrykk nivåer i 104 sammen mage kreft vev og clinicopathological faktorer hos pasienter med magekreft. Vi har oppdaget at ekspresjonsnivået av VEZT var forbundet med betydelig lymfatisk metastase, dybden av kreftinvasjon og TNM trinn (tabell 1,
P
0,05). Imidlertid ble VEZT uttrykk nivåer ikke er knyttet til kjønn, alder, tumorstørrelse, celledifferensiering, brutto utseende, stedet for svulst og fjernmetastaser.
Faktorer
No. av pasientene
Mean uttrykk for VEZT（mean±SD)
P
-value
GenderMale5714.87±2.031.382Female4715.47±3.15Age(year) 654918.62±2.150.584≥655513.11±3.45Tumor størrelse 5cm5117.16 ± 3.052.682≥5cm5311.26 ± 3.52Cell differentiationPoor differentiation6818.21 ± 1.651.827Moderate differentiation3616.6 ± 2.46Gross appearanceBorrmann Ⅰ + Ⅱtype3217.25 ± 3.462.361Borrmann Ⅲ + Ⅳtype7215.21 ± 6.58Site av tumorCardia2119 0,34 ± 2.530.692Body3611.24 ± 2.61Antrum4717.35 ± 2.87Lymphatic metastasisPositive747.42 ± 7.250.027 * Negative3018.26 ± 9.32Depth av kreft invasionT22518.35 ± 7.820.041 * T36322.12 ± 4.21T41624.78 ± 5,41 distal metastasisPositive249.34 ± 6.091.032Negative8012.35 ± 8.62TNM # StageⅠ156.35 ± 7.160.0385 * ⅱ2816.37 ± 4.56Ⅲ4817.24 ± 1.41Ⅳ137.41 ± 2.36Table 1. Forholdet mellom VEZT uttrykk nivåer i kreft vev og clinicopathological faktorer hos pasienter med magekreft.
Vi analyserte forholdet mellom VEZT uttrykk nivåer i kreft vev og clinicopathological faktorer i magekreftprøver versus tilstøtende normalt vev (n = 104). Vi har oppdaget at ekspresjonsnivået av VEZT var signifikant assosiert med lymfatisk metastase, dybden av kreftinvasjon og TNM trinn (tabell 1,
P
0,05). Men VEZT uttrykk nivåer var ikke forbundet med kjønn, alder, tumorstørrelse, celledifferensiering, brutto utseende, stedet for svulst og fjernmetastaser #:. TNM, tumor-node-metastaser; *
p
0,05. CSV Last ned CSV
Metylering analyse av normal mage vev, primære mage kreft vev og perifert blod fra mage karsinom pasienter og friske kontroller
Basert på en tidligere studie fra vår lab, vi postulerte at metylering av VEZT promoter var annerledes i mage karsinom pasienter og friske kontroller; Vi brukte nettet bioinformatikk programvare for å analysere den promoter-regionen og metylering status for VEZT genet (figur 1A). Vi undersøkte metylering nivået av VEZT promoteren i 30 vevsprøver DNA fra pasienter med primære magekreft vev, noe som tilsvarer plasma DNA og kontroll ved hjelp av BSP metoder, som dekket de regionene i -171bp til -428bp (figur 1A). De midlere metylert nivåene av VEZT i 30 primærmagekreft vev og 30 normale gastrisk vev var 67,78 ± 25,90% og 42,42 ± 30,30%, henholdsvis (figur 1B). Primære magekreft vev viste høyere metylering nivåer i VEZT promotorområdet sammenlignet med normal gastrisk vev (figur S1A, figur 1B, P 0,05). Gjennomsnittlig metylert nivået av plasma DNA i grunnskolen mage kreftpasienter og friske kontroll tilfeller var 69,00 ± 23,90% og 46,71 ± 26,31%, henholdsvis (figur 1C). Den metylert nivået av plasma DNA i grunnskolen magekreftpasienter viste høyere metylering nivåer i VEZT promoter regionen sammenlignet med friske kontroll saken (Figur S1B, figur 1C, P 0,05). Således ble signifikant metylering observert i magekreft-gruppen sammenlignet med friske kontrollpersoner. Nivået av metylert VEZT i vev og plasma kan tjene som en molekylær markør for magekreft.
(A) Nett bioinformatikk programvare ble brukt til å analysere den promoter-regionen og metylering status for VEZT genet. (B) Metylering status av 34 CpG stedene i VEZT promoter fra 30 normale mage vev og 30 primær mage kreft vev. Primære tumorvev viste høyere metylering nivåer i VEZT promotorområdet sammenlignet med normal gastrisk vev. (C) Metylering status av 34 CpG områder av VEZT promoteren fra perifert blod plasma-DNA av 30 gastrisk karsinom pasienter og 30 friske kontroller. Perifert blod fra mage karsinom pasienter viste høyere metylering nivåer i VEZT promoter regionen sammenlignet med friske kontroller. Hver rad med sirkler representerer en integrert metylering forhold fra tre kloner, og hver sirkel representerer en enkelt CpG nettsted. Åpen sirkel representerer unmethylated cytosin, mens fylte sirkler eller delvis fylte sirklene representerer metylert forholdet mellom CpG nettsteder.
H. pylori
infeksjon induserer metylering og stanse av VEZT
Et betydelig antall studier har blitt publisert demonstrere at
H. pylori
infeksjon er en uavhengig risikofaktor for metylering [20,21,22]. Derfor antar vi at
H. pylori
fører VEZT metylering og senere kreftutvikling. Til å begynne med, undersøkte vi metylering nivået av VEZT promoteren i DNA fra 23 vevsprøver fra pasienter med
H. pylori
-positivt kronisk gastritt og kontrollene ved hjelp BSP og MSP metoder, som dekket regionene -171bp til -428bp og -342 bp til -513 bp, henholdsvis (figur 1A). De gjennomsnittlige metylering nivåer av VEZT arrangøren i
H. pylori
-positivt og kontrollen var 75,74 ± 28,16% og 31,20 ± 25,67%, henholdsvis. Dermed ble det observert en signifikant forskjell i metylering i
H. pylori
-positivt kronisk gastritt gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,01, figur 2A). Promoterregionen av VEZT ble metylert generelt hos pasienter med kronisk gastritt ifølge MSP-analyse (tabell S2); men fant vi fire tilfeller av
H. pylori
-positivt kronisk gastritt som var relativt unmethylated. Vi har observert 19 tilfeller av
H. pylori
-positivt kronisk gastritt som vises hypermethylation (tabell S2). For å avgjøre om
H. pylori
infeksjon induserer arrangøren metylering av VEZT genet
in vitro
, vi har oppdaget at
H. pylori-infeksjon
var assosiert med ekspresjon av IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 og IRX5 protein etter
H. pylori-infeksjon
og inkubert i 24 timer i GES-1-celler ved hjelp av Western blotting. Våre resultater viste
H. pylori-infeksjon
fremmet ekspresjon av IL-6, AKT, TNF-а, IL-8, ATF3 og IRX5 protein og
H. pylori
infeksjon var vellykket i GES-1 celler (figur 2B, 2C). For ytterligere å bekrefte at at
H. pylori
infeksjon er faktisk ansvarlig for metylering eller stanse av VEZT, vi analyserte arrangøren metylering status for VEZT i GES-1 celler ved MSP og BSP. Som vist på figur 2D og 2E, promotoren av VEZT var hypermethylation i
H. pylori
-infected GES-1 celler, men unmethylation ble observert i cellene friske med
H. pylori plakater (figur 2D og E). Protein uttrykk nivået av VEZT var også lavere i
H. pylori
-infected celler enn i cellene friske med
H. pylori product: (Figur 2C).
(A)
H. pylori
-positive gastritt pasienter viste høyere metylering nivåer i VEZT promoter regionen sammenlignet med
H. pylori
-negative gastritt pasienter. Hver rad med sirkler representerer en integrert metylering forhold fra tre kloner, og hver sirkel representerer en enkelt CpG nettsted. Åpen sirkel representerer unmethylated cytosin, mens fylte sirkler eller delvis fylte sirkler representerer metylert forholdet mellom CpG nettsteder. (B) Etter 24-h infeksjon med
H. pylori
, feste av
H. pylori
ble observert ved transmisjonselektronmikroskopi på overflaten av GES-1 celler i forsøkscellene i forhold til kontrollcellene. (C) VEZT ekspresjonsnivået i GES-1-celler ble redusert etter en 24-h
H. pylori
infeksjon i forhold til negative kontrollceller; Men
H. pylori
infeksjon indusert IL-6, AKT, TNF-α, IL-8, ATF3 og IRX5 ekspresjon ved western blot-analyse. (D) metylering av den VEZT promoteren ble påvist ved MSP etter en 24-h
H. pylori
infeksjon i GES-1 celler (merket som M), mens metylering av VEZT promoter i GES-1 celler som ikke var infisert med
H. pylori
ble ikke observert (merket som U). (E) Skjematisk oppsummering av 34 CpG steder i promoter-regionen i VEZT genet fra -171 til -428 av BSP analyse. GES-1 celler viste en høyere grad av metylering etter
H. pylori-infeksjon
i forhold til kontrollprøvene. Baren representerer 5000 nm.
Funksjonsanalyse etter gjenoppretting VEZT uttrykk in vitro
Den hyppige stanse eller nedregulering av VEZT i magekreft cellelinjer tyder på at det er sannsynlig en tumor-suppressor genet i vår forrige undersøkelse. For å teste dette punktet, vist vi VEZT uttrykk i flere magekreft cellelinjer ved real-time PCR og Western blot. Forskjellige VEZT ekspresjonsnivåer ble funnet i de seks cellelinjer analysert (figur 3A). Vi har konstruert en pEGFP-N1-VEZT ekspresjonsvektor og transfektert pEGFP-N1-vektoren inn i magekreft cellelinje MKN-45 og NCI-N87, som viste ingen eller lavt nivå av VEZT uttrykk. Etter transfeksjon, undersøkte vi uttrykket av VEZT i disse cellelinjer ved sanntids-PCR, noe som viste at transkripsjon ekspresjonsnivået av VEZT var oppregulert 41,99 ganger (figur 3B, P 0,01) i disse cellelinjer sammenlignet med kontroll-transfekterte celler. Vi har også undersøkt kapasiteten til magekreftceller overekspresjon VEZT å invadere og migrere av transwell invasjonen og migrasjonsanalyser (Figur 3C). Den invasive evne MKN-45 celler i VEZT /N1 gruppe ble betydelig redusert sammenlignet med kontroll-transfekterte celler (78,32 ± 5,27 vs. 174,13 ± 2.45,
P
0,001). Antallet av MKN-45-celler i VEZT-transfekterte prøve som migrerte inn i transwell innskuddet ble også betraktelig redusert når sammenlignet med kontroll-transfekterte celler (48,28 ± 2,16 vs. 142,13 ± 7,42,
P
0.001).
(A) De forskjellige uttrykk nivåer av VEZT i fem magecancercellelinjer og en immortalisert gastrisk mucosal cellelinje. (B) Uttrykk for VEZT ble oppregulert i MKN-45 og NCI-N87 celler ved VEZT vektor transfeksjon forhold til N1-kontroller. (C) Invasiv, trekkende og rørformede formasjons kapasitet VEZT-transfekterte MKN-45 og NCI-N87-celler ble undertrykket som bestemt ved transwell og rørformede formasjonstester. (D) Overekspresjon av VEZT fører til cellevekstarrest som bestemmes av CCK-8-analyse. (E) kolonidannelse priser var signifikant forskjellig mellom VEZT-transfekterte celler og N1-kontrollene i MKN-45 og NCI-N87 celler. (F) overekspresjon av VEZT i MKN-45 og NCI-N87 celler hemmet tumordannelse i nakne mus. Tumorknuter resekterte fra VEZT-transfekterte gruppe var mindre enn de fra N1-kontroller. (G) Tumor vekstkurver for VEZT /N1 gruppe og N1-kontroller viser rask tumorvekst i MKN-45 eller NCI-N87 /N1control grupper. *
P
0,05. Hver søyle representerer middelverdien ± standardavvik fra tre uavhengige eksperimenter.
HUVECs ble suspendert i supernatantene samlet fra kontroll- og VEZT /N1. Etter 18-timers inkubering, supernatanten innhøstet fra VEZT /N1-celler viste sterk inhibitorisk effekt på dannelsen av rørformede strukturer av HUVECs med hensyn til antall, lengde og kryssende noder sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3C). Som vist i figur 3D, cellevekst av MKN-45-celler ble signifikant undertrykt av den restaureringen av VEZT uttrykk i forhold til kontrollgruppen (
P
0,05). pylori
infeksjon. *
P
0,05. pylori
infeksjon.
H.
