Abstract
Toveis kreftfremmende og anti-kreft effekt av arsen for kreftceller har blitt avslørt i forrige studier. Men hver av disse effektene (kreftfremmende eller anti-kreft) ble funnet i forskjellige celler ved forskjellig behandlet konsentrasjon av arsen. I denne studien har vi for første gang antydet at arsen ved konsentrasjon på 3 mikrometer, lik gjennomsnittlig konsentrasjon i drikkevann i kreftutsatte områder i Bangladesh, samtidig uttrykt sine toveis virkning på menneske plateepitelkarsinom HSC5 celler med forskjellige veier. Behandling med tre mikrometer av arsen fremmet celle invasjon via oppregulering av ekspresjon av MT1-MMP og nedregulering av uttrykk for p14ARF og samtidig indusert celle apoptose gjennom hemming av uttrykk for N-cadherin og økning av ekspresjon av p21 (WAF1 /CIP1) på begge transkripsjon og proteinnivåer i HSC5 celler. Vi viste også at hemming av MT1-MMP uttrykk ved NSC405020 resulterte i reduksjon av arsen-mediert invasjonen av HSC5 celler involverer reduksjon i fosforylerte ekstracellulære signalregulerte kinaser (perk). Til sammen våre biologiske og biokjemiske funn antydet at arsen uttrykt toveis effekter som kreftfremkallende og en anti-kreft agent i menneske plateepitelkarsinom HSC5 celler med forskjellige veier. Våre resultater kan spille en viktig vitenskapelig tydelig for videre studier for å finne ut en bedre måte i behandling av arsen-indusert kreft, spesielt i plateepitelkarsinom
Citation. Thang ND, Yajima jeg, Kumasaka MY, Kato M (2014) Toveis Funksjoner av arsen som kreftfremkall og et middel mot kreft i human plateepitelkarsinom. PLoS ONE 9 (5): e96945. doi: 10,1371 /journal.pone.0096945
Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA
mottatt: 10 februar 2014; Godkjent: 13 april 2014; Publisert: 09.05.2014
Copyright: © 2014 Thang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen er finansiert av Vietnam National Foundation for Science and Technology Development (NAFOSTED) under tilskudd nummer 106-NN.02-2013.07. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Arsen forurensning i drikkebrønnvann er et alvorlig helseproblem i verden [1], [2]. Arsen er et veldokumentert menneskelige kreftfremkallende. Kronisk lavdose eksponering av arsen forårsaket misfarging av huden, kronisk fordøyelsesbesvær, hypertensjon, perifer vaskulær sykdom, iskemisk hjertesykdom, og mange typer kreft, inkludert hud, lunge, blære, lever og nyrekreft [3]. Virkninger av arsen som et middel for karsinogenese og tumorprogresjon eller et anti-tumor legemiddel er avhengig av dens konsentrasjon [4] – [6], varighet av eksponeringen [6], [7] og cancercelletyper [3] – [7] . Tidligere auto røntgen dyrestudier viste at kutant plateepitelkarsinom (SCC) er en av de representative arsen-mediert kreft [8]. Selv om arsen har blitt anerkjent som en kreftfremkallende, det er også blitt klinisk anvendt som et effektivt kjemoterapeutisk middel ved behandling av leukemi hos mennesker [9]. Arsen også uttrykt sin anti-kreft effekt på forskjellige faste kreftformer, inkludert kutane karsinom, ved å arbeide for apoptotisk celledød [10], [11]. De toveis kreftfremmende og anti-kreft effekt av arsen på kreftceller har ført til en vanskelig situasjon for å avklare mekanismen av arsen-mediert kreft. Selv om det var mange studier som fokuserer på å avsløre mekanismen for virkningen av arsen på kreftceller, er det fortsatt uklart.
arrest av cellesyklus og apoptose er relatert til celledød og for å bli betraktet som viktige måter for cancer behandling [12] – [15]. Tidligere studier viste at arsen induserer apoptose i kreftceller via aktivering av uttrykk av tumor undertrykkere av p21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF (p19ARF i mus) [12] – [15]. P21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF spiller viktige roller i regulering av cellesyklus-stans ved å regulere aktiviteten av cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK) [16] – [19]. p21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF er i stand til å hemme cellevekst gjennom cellesyklus arrest av hud kreftceller inkludert melanom, plateepitelkarsinom og basalcellekreft [20] – [24]. Andre rapporter viser at eksponering for arsen årsaken celle transformasjon gjennom hemming av både protein og genuttrykk av tumor suppressors p19ARF [22] – [24].
Invasion er hall mark for malignitet grad av kreftceller. Det er rapportert at arsen reduserer invasive og metastatiske egenskaper til gliom-tumorceller via inhibering av aktivering av matriksmetalloproteinase-14 (MT1-MMP) [7], [25], som er i stand til å drive invasjon av kreft celler i stor grad av nedbrytning av ECM barrierer. MT1-MMP er også ansett som en oppstrøms ERK. ERK er en nøkkel molekyl i de store signalerings kassetter av mitogen-aktivert protein kinase pathway [26]. ERK spiller en viktig rolle i utviklingen av kreft, [26], [27]. Således kan MT1-MMP være i stand til å regulere nivået av fosforylert ERK [26], [27]. Imidlertid, i andre studier, høy konsentrasjon av arsen forbedrer MT1-MMP-ekspresjon i fibroblastceller [28] – [30]. Tidligere studier har også rapportert at arsen reduserer uttrykk for E-cadherins [31], [32]. Nedregulering av E-cadherin er korrelert med oppregulering av N-cadherin, en invasjon promoter molekyl [33] -. N-cadherin-avhengige adhesjon svekker oppregulering av den cyklin-avhengige kinase inhibitor p21 [37], [38]. Ektopisk uttrykk for N-cadherin øker tumor cellemotilitet [35], [39].
Vår forrige rapport viste at det er ca 3 um (210,7 mikrogram /L) av arsen i arsen forurenset drikkevann godt vann (n = 72) i kreftutsatte områder i Bangladesh [40]. Det finnes mange typer kreft, inkludert plateepitelkarsinom (SCC) forekommer i disse områdene [40]. I denne studien har vi for første gang viste at arsen ved konsentrasjon av 3 mikrometer samtidig fungerte som kreft-promoter og anti-kreft narkotika i menneskelige plateepitelkarsinom HSC5 celler med forskjellige veier.
Materialer og metoder
Reagenser
Sodium arsenide (arsen) ble kjøpt fra Sigma. NSC405020 ble kjøpt fra Millipore. Arsen ble oppløst i vann for anvendelse. NSC405020 ble oppløst i DMSO for bruk.
Cell kultur
Menneskelige transform keratinocytter HSC5 celler [40] (Health Science Forskningsressurser Bank, Japan) ble dyrket i RPMI-1640, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO2.
Krystallfiolett fiolett~~POS=HEADCOMP analyse
krystallfiolett analyse ble utført ved anvendelse av fremgangsmåten som tidligere er beskrevet [40]. I korthet celler (3 x 10
4-celler) ble sådd ut i seks-brønns plater og dyrket i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med arsen og dyrket i ytterligere 3 dager. De levedyktige adherente celler ble fiksert med 10% formalin og farget med 0,1% krystallfiolett. Absorbans ved 595 nm i de fargede cellene solubilisert med 0,1% SDS, ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser.
Invasion assay
celle invasjon egenskaper ble evaluert ved invasjon assay i henhold til den fremgangsmåte som tidligere er rapportert [41 ]. I korthet, 2 x 10
5-celler i 300 ml kulturmedium med 0,5% FBS ble anvendt på matrigel-belagte øvre kammer med 8 mm i diameter (8 mm porestørrelse). Da de øvre kamrene ble plassert i 24-brønners kulturplater inneholdende 600 ml kondisjonert medium med 0,5% FBS for å utløse invasjon aktivitet og ble inkubert i 12 timer. Invaderende celler ble farget med hematoxyline-eosin eller krystallfiolett og telles under et mikroskop.
Real-time PCR-analyse
Total RNA ble fremstilt fra cellelinje prøver ved hjelp av en høy Pure RNA Kit (Roche diagnostikk) i henhold til den fremgangsmåte som tidligere er beskrevet [41]. cDNA ble deretter syntetisert ved revers transkripsjon fra total-RNA ved hjelp av Super-criptTMIII revers transkriptase inngår i RT-enzymblandingen og RT-reaksjonsblandingen i henhold til protokollen beskrevet [41]. Real-time kvantitativ RT-PCR med SYBR grønn ble utført ved hjelp av makt SYBR1 Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) i en ABI Prism7500 sekvens detection system (Applied Biosystems). Uttrykket nivåer av p14ARF, p21 (WAF1 /CIP1), MT1-MMP og N-cadherin transkripsjoner målt ved kvantitativ RT-PCR (real-time PCR) ble justert gjennom avskrift uttrykk nivå av TATA-boks-bindende protein (TBP) . PCR ble utført ved anvendelse av 10 ml kraft SYBR1 grønn PCR masterblanding (Applied Biosystems) inneholdende 900 nM forover primer og 900 nM revers primer i et sluttvolum på 20 ml. Sekvenser av primere er presentert som følger:
Forward: GTGGTCTCGGACCATGTC
og bakover: GTAGCCATATTGCTGTAGCC for MT1-MMP
Videresend. ATTGCTGTTTTGGACCGAGA
og bakover: CACTTGAGGGGCATTGTCAT for N-cadherin
Videresend. AAGTCAGTTCCTTGTGGAGC
og bakover. ATTAGCGCATCACAGTCGCG for p21 (WAF1 /CIP1)
Forward: ATGGTGCGCAGGTTCTTGGT
og revers : TGCCCATCATCATGACCTGG for p14ARF
Videresend. CACGAACCACGGCACTGATT
og bakover. TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC for TBP
immunoblotanalyse
Immun analyse ble utført i henhold til metoden beskrevet tidligere [42]. Kanin polyklonale første antistoffer mot fosforylert treonin 202 i ERK1 og fosforylert tyrosin 204 i ERK2 (Cell Signaling), anti-matriksmetalloproteinase-14 (MT1-MMP) hengsel region antistoff (Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling), Goat polyklonale antistoffer mot p14ARF og p21 (WAF1 /CIP1) (Santa Cruz), mus monoklonalt antistoff mot N-cadherin (
BD
biovitenskap) og mus monoklonalt antistoff mot alfa-tubulin (SIGMA).
Statistisk analyse
Statistisk analyse i denne studien ble utført ifølge fremgangsmåten som tidligere er beskrevet [40]. Resultater fra tre uavhengige eksperimenter i hver gruppe ble statistisk analysert ved t-test. SPSS (versjon 18) programvarepakke (SPSS Japan Inc.) ble benyttet for disse statistiske analyser, og signifikansnivået ble satt til p. 0,05
Resultater
Arsen indusert apoptose av HSC5 celler
Vår tidligere feltarbeid viste at konsentrasjonen av arsen i arsen forurenset drikkevann i kreftutsatte områder i Bangladesh er ca 3 um (210,7 mikrogram /L) [40]. Det er imidlertid et faktum at det er vanskelig å identifisere effekten av arsen på kreftutvikling [3] – [11] derfor bestemte vi oss for å undersøke effekter av arsen på apoptose av HSC5 celler. HSC5 celler ble behandlet med arsen ved 0, 1,0, 3,0, 5,0 og 10,0 pM i 24 timer. Den viste at jo høyere konsentrasjonen av arsen som skyldes den sterkere apoptose av cellene. Ved konsentrasjon på 1 uM, arsen hadde ingen effekt på celle død (figur 1A). Men på 3 uM og 5 uM, arsen forårsaket reduksjon av cellenes levedyktighet nesten 2 og 5 folder, respektivt (figur 1A). 10 uM av arsen førte til nesten alle celler døde (data ikke vist). Vi undersøkte deretter effekten av tre mikrometer av arsen på de døde av HSC5 celler med en gang selvfølgelig. Behandling med arsen i 24 timer, 48 timer og 72 timer signifikant redusert levedyktighet av celler HSC5 1,4, 1,8 og 1,7 ganger, henholdsvis (figur 1B). Disse resultatene indikerte at apoptose av HSC5 celler ble direkte forårsaket av arsen.
Levedyktighet av HSC5 celler behandlet med 0, 1,0, 3,0 og 5,0 uM av arsen ble evaluert ved krystallfiolett (CV). Celler ble presentert i bilder (A) og prosenter av arsen behandlet levende celler og kontroll levende celler ble presentert i en graf (B). ** Signifikant forskjellig (p 0,01) fra kontroll ved t-test
Arsen fremmet invasjon av HSC5 celler
Vi neste undersøkt effekter av arsen på invasjon av. HSC5 celler. Celler ble forbehandlet med arsen ved forskjellige konsentrasjoner (0, 1,0, 3,0, 5,0 og 10,0 um) i 24 timer før høsting for invasjon assay. Behandling med en mikrometer av arsen hadde ingen effekt, men 3 um og 5 um fremmet invasjon av HSC5 ca 1,8 og 3,7 folder, henholdsvis (figur 2A). Ved 10 uM, arsen forårsaket død nesten alle celler, og derfor var det ikke mulig å undersøke effekten av arsen på invasjon av celle ved denne konsentrasjonen. Vi undersøkte deretter effekten av 3 uM av arsen på invasjon av HSC5 celler med et tidsforløp på 0, 24, 48 og 72 timer. Forbehandlet med arsen i 24, 48 og 72 timer økt invasjon av celler HSC5 2,14, 2,27 og 1,75 folder, respektivt (figur 2B). Der resultatene antydet at arsen resulterte i markedsføringen av invasjonen av HSC5 celler. Behandling med 3 uM eller 5 uM av arsen økt apoptose (figur 1) og samtidig fremmet invasjon av HSC5 celler (figur 2). Disse resultatene er vitenskapelig evidents for bifunctions av arsen som kreftfremkallende og anti-kreft agent i kreft plateepitelkarsinom HSC5 celler. Basere på disse resultatene og data fra feltarbeid, bestemte vi oss for å bruke tre mikrometer av arsen for videre forsøk.
Invasive evne til HSC5 celler behandlet 0, 1,0, 3,0 og 5,0 mikrometer av arsen ble evaluert av invasjon analyse. Antall invaderende HSC5 celler behandlet med arsen i invasjonen analysen ble presentert i fotografiene (A) og en kurve (B). ** Signifikant forskjellig (p 0,01). Fra kontroll ved t-test
Arsen fremmet invasjon av HSC5 celler ved oppregulering av MT1-MMP og nedregulering av p14RAF både transkripsjon og uttrykk nivåer
Vi neste undersøkt den molekylære mekanismen for arsen-mediert cellulær invasjon i HSC5 celler. Behandling med tre mikrometer av arsen indusert transkripsjon og uttrykk nivåer av MT1-MMP (figur 3A-B) og hemmet transkripsjon og uttrykk nivåer av p14ARF (Figur 3C-D). Tidligere studier [20] – [24], [27] indikerte at MT1-MMP og p14ARF kan spille viktige roller i å modulere vekst og invasjon av squamous cell carcinoma celler. I samsvar med disse tidligere rapporter [20] – [24], [27], våre resultater antydet at arsen kan fremme invasjon av HSC5 celler via oppregulering av MT1-MMP og nedregulering av p14ARF
A og C). avskrift uttrykk nivåer av MT1-MMP og P14 ble målt ved real-time PCR. **, Signifikant forskjellig (p 0,01) fra kontrollgruppen ved t-test. B og D) Protein ekspresjonsnivåer av MT1-MMP og P14 ble målt ved hjelp av immunblot. Tubulin ble anvendt som en positiv kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og de samme resultater ble oppnådd.
Arsen indusert apoptose av HSC5 celler ved nedregulering av N-cadherin og og oppregulering av p21 (WAF1 /CIP1) ved begge transkripsjons og ekspresjonsnivåer
Vi deretter undersøkt den molekylære mekanismen for arsen-mediert apoptose i HSC5 celler. Behandling med tre mikrometer av arsen sterkt redusert transkripsjon og uttrykk nivåer av N-cadherin (figur 4A-B) og fremmet transkripsjon og uttrykk nivåer av p21 (WAF1 /CIP1) (figur 4C-D). Tidligere studier [20] – [24], [29] – [36] har vist at N-cadherin og P21 (WAF1 /CIP1) kan spille viktige roller i moduler av apoptose av humane squamous cell carcinoma-celler. Våre resultater i denne studien antydet at arsen kan forårsake apoptose av HSC5 cellene gjennom nedregulering av N-cadherin og /eller oppregulering av p21 (WAF1 /CIP1).
A og C) transkripsjon ekspresjonsnivåer av N-cadherin og p21 ble målt ved real-time PCR. ***, Signifikant forskjellig (p 0,001) fra kontroll ved t-test. B og D) Protein expression nivåer av N-cadherin og p21 ble målt ved hjelp av immunblot. Tubulin ble anvendt som en positiv kontroll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og de samme resultater ble oppnådd.
Hemming av arsen-mediert fremme invasjon HSC5 celler ved en MT1-MMP inhibitor
Vi neste undersøkt effekten av NSC405020 en MT1-MMP inhibitor, på arsen-mediert invasjon av HSC5 celler (figur 5). Siden MT1-MMP er blitt rapportert å være potensielle plassert oppstrøms av ERK [41], [42], og kan være assosiert med arsenikk-mediert invasjon (figur 2). Behandling med 3 uM arsen igjen økt invasjon (figur 5A) med en økning i ekspresjon nivå av MT1-MMP (figur 5B). Men det var ingen endring i fosforylert nivået av ERK (perk). Disse resultatene indikerer at toveis effekter av arsen på denne konsentrasjonen på perk var balanse. Arsen-mediert invasjonen ble blokkert ved behandling med en mikrometer av NSC405020 (figur 5A). NSC405020 (1 mm) forårsaket for å redusere uttrykksnivået MT1-MMP samt reduksjon av fosforylert av ERK i HSC5 celler (figur 5B).
A), Invasive aktivitet HSC5 behandlet med 3 mikrometer av arsen ble evaluert invasjon assay. Nivå av invasive egenskaper er presentert som antall av invaderende celler i et diagram (venstre) og fotografier (høyre). **, Signifikant forskjellig (p 0,01) fra kontroll ved t-test. Fosforylerte nivåer av ERK (P-ERK) og protein uttrykk nivåer av MT1-MMP og ERK i HSC5 celler behandlet med 3 uM arsen i 24 timer blir presentert. Tubulin protein uttrykk nivåer presenteres som en intern kontroll.
Diskusjoner
Arsen har vært ansett som en agent for kreftutvikling og tumorprogresjon for lenge siden [1], [2 ]. Basert på analyse av 52 202 hånd tube-brønn vannprøver i løpet av de siste 14 årene i Bangladesh viste at rundt 36 millioner og 22 millioner mennesker kan være å drikke As-forurenset vann over 10 og 50 mikrogram /l, henholdsvis [43]. Dette kan være den viktigste årsaken til alvorlig problem for kreftutvikling, spesielt for hudkreft i Bangladesh [3]. I en kontrast måte, arsen også har vært brukt som et medikament for behandling av mange typer kreft [8] – [11]. Basere på vår forrige resultat [40] undersøkte vi effekten av tre mikrometer arsen på cellular invasjon, et kjennetegn på malignitet grad av kreft celle og apoptose, en markør for celle død i kreftbehandling. Vår Resultatet viste at arsen samtidig sterkt indusert apoptose (figur 1) og promotert invasjon (figur 2) av HSC5 celler. Disse resultatene antydet at ved denne konsentrasjon uttrykt arsen sin toveis funksjoner i squamous cell carcinoma HSC5 celler. Vi undersøkte de molekylære mekanismene knyttet til disse hendelsene i HSC5 celler. Våre resultater viste at 3 uM arsen forbedret cellulær invasjon ved oppregulering av membrantype, en matriksmetalloproteinase (MT1-MMP) (figur 3A), som spiller viktige roller i tumorgenese [7], og nedregulering av p14ARF (figur 3B), som er en inhibitor for celleproliferasjon [20] – [24] ved begge transkripsjons og ekspresjonsnivåene. Dette er første gang vi viste at det er en mulighet i samarbeid mellom MT1-MMP og p14ARF i kreftutvikling i HSC5 celler. På den annen side er resultatene viste at 3 uM arsen induserte apoptose av HSC5 celler via nedregulering av N-cadherin (figur 4A), som spiller rolle i celledifferensiering, transformasjon, samt invasjon [33] – [36] og oppregulering p21 (WAF1 /CIP1) (figur 4B), en tumor suppressor [20] – [24] på begge transkripsjon og uttrykk nivåer. Våre resultater i overensstemmelse med tidligere studier [37], [38] har foreslått at N-cadherin kan delta i den tilhørende cellesyklus-stans ved den kjernefysiske akkumulering av cyclin-avhengige kinase-inhibitorer p21. Selv om både p14ARF og p21 (WAF1 /CIP1) ble rapportert som molekyler som spiller viktige roller i regulering av cellesyklus-stans ved å regulere virksomheten til cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK) [16] – [19], i denne studien disse molekylene uttrykt sine distinkte effekter på invasjon og apoptose av HSC5 celler. Videre viste vi at NSC405020, en MT1-MMP inhibitor, hemmet arsen-mediert fremme invasjon HSC5 celler (figur 5). Det kan forklares at behandling med NSC405020 resulterte i synkende uttrykksnivået MT1-MMP. I sin tur, MT1-MMP regulert fosforylerte nivået av ekstracellulære signalregulerte kinaser (Perk) [26], [27], som spiller en viktig rolle i cellulær invasjon, proliferasjon og tumorutvikling [26], [27]. Til slutt, nedregulering av MT1-MMP og Perk ved NSC405020 ført til synkende invasjonen av HSC5 celler (figur 5). Toveis kreftfremmende og anti-kreft effekt av arsen etter kreftceller cellene er blitt avslørt. Imidlertid arsen som en kreftfremmende middel eller et anti-kreft legemiddel ble funnet i forskjellige celler ved forskjellig behandlede-konsentrasjonen i en bestemt rapport [1] – [3], [8] – [11]. Dette er første gang vi viste samtidig til toveis funksjoner av arsen i menneskelige plateepitelkarsinom HSC5 celler med forskjellige molekylære stier. Denne studien bidro til å forklare grunnen til at selv om det er mange mennesker har blitt eksponert for arsen, ikke alle av dem har arsenicosis sykdommer, inkludert kreft. Våre resultater gitt en viktig informasjon for andre studier i fremtiden for å finne ut en bedre måte i behandling av arsen-indusert kreft, spesielt i plateepitelkarsinom.
