Abstract
Bakgrunn
Tumor celle fusjon med bevegelige benmargavledede celler (BMDCs) har lenge vært hevdet som en mekanisme for kreft metastasering. Mens det er mye støtte for dette fra cellekultur og dyrestudier, har det ennå ikke bekreftet i kreft hos mennesker, som svulsten og marg-avledet celler fra samme pasient ikke kan lett skilles genetisk.
Metoder
Vi har gjennomført genotyping av en metastatisk melanom til hjernen som oppsto etter allogen benmargstransplantasjon (BMT), ved hjelp av rettsmedisinske kort tandem repeat (STR) lengde-polymorfisme å skille donor og pasient genomer. Tumorceller ble isolert uten leukocytter av laser mikrodisseksjon, og tumor og pre-transplantasjon blod lymfocytt DNA ble analysert for donor og pasient lene på 14 autosomal STR loci og kjønnskromosomer.
Resultater
alle alleler i donor og pasient pre-BMT-lymfocytter ble funnet i tumorceller. Lene viste uforholdsmessig relative Forekomsten i lignende mønstre i hele svulsten, som indikerer svulsten ble initiert av en klonal fusjon hendelse.
Konklusjoner
Våre resultater sterkt støtter fusjon mellom en BMDC og en svulst celle spille en rolle i opprinnelsen til denne metastaser. Avhengig av hyppigheten av slike hendelser, kan funnene ha viktige implikasjoner for forståelsen av den generasjonen av metastaser, inkludert opphavet til kreft initiere celler og kreft epigenome
Citation. Lazova R, LaBerge GS, Duvall E, Spoelstra N, Klump V, Sznol M, et al. (2013) En melanom hjernemetastaser med en Donor-Patient Hybrid Genome følgende benmargstransplantasjon: Første Bevis for Fusion i Human Cancer. PLoS ONE 8 (6): e66731. doi: 10,1371 /journal.pone.0066731
Redaktør: Eva Mezey, National Institutes of Health, USA
mottatt: 27 februar 2013; Godkjent: 09.05.2013; Publisert: 26 juni 2013
Copyright: © 2013 Lazova et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt delvis av en ubegrenset gave fra Amway Corporation og fra University of Colorado Cancer Center NCI Support Grant (P30CA046934). Ekstra kostnader ble dekket internt ved institusjonene: Yale University, University of Colorado, og Denver Politiet Crime Lab. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Midler til denne studien ble gitt delvis av en ubegrenset gave fra Amway Corporation. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tumor celle fusjon med bevegelige leukocytter som myeloide avstamning celler eller stamceller har blitt satt frem som en samlende forklaring på metastase [1] – [4]. Mer enn et århundre siden Aichel slås at kreft kan skyldes fusjon mellom bevegelige leukocytter og andre somatiske celler, med de kvalitative forskjeller mellom kromosomer forårsaker hybrid å bli «kastet ut av banen av modercellene til å danne det som har kommet for å bli kjent som en ondartet celle «[5]. Kreft cellefusjon ble først oppdaget at når human glioblastom-celler ble implantert i hamstere og metastaser utviklet med en human-hamster karyotype [6]. Dette ble etterfulgt av rapporter fra mange laboratorier kreft cellefusjon i kultur og mus [1] – [3]. I den senere tid, da dårlig metastatiske Cloudman S91 mus-melanomceller ble sammensmeltet med normale mus eller humane makrofager i kultur, hybrider implantert i mus viste høy forekomst av metastasering med redusert overlevelsestider av vertene i forhold til de for kontrollmelanomceller anvendt som fusjonspartnere [7]. Metastatiske hybridene var sterkt pigmentert, karakteristisk for melanocytt-avstamning, og også uttrykkes tallrike myeloide cellelinjen egenskaper som forbedret kjemotaktisk motilitet, autophagy og makrofaglignende glykosyleringsmønstre [8] – [10]. Når humane makrofager ble anvendt som fusjonspartnere med musemelanomceller, hybrider uttrykt både humane og muse SPARC gener, noe som indikerer at epigenomes til begge fusjonspartnere ble aktivert [11]. Tilsvarende, når fluorescent-merkede mus benmarg-avledede celler ble innført gjennom parabiosis i mus med tarmsvulster, makrofag-kreftcellehybrider dannet som uttrykte transcriptomes som er karakteristiske for både parenfusjonspartnere [12]. Likeledes implantasjon av menneskelig glioblastom eller Hodgkins lymfom celler til hamster kinnene resulterte i metastatisk menneske-hamster hybrider med co-uttrykk for menneskelige og hamster gener [13] – [14]. Dermed mus-mus, menneske-mus og menneske-hamster hybrider alle co-uttrykt kreftcelle og normal celle gener og viste forbedret metastatiske evner. I andre studier, sammensmelting av kreftceller med BMDC s i kulturen indusert Aneuploidy, medikamentresistens, økt invasivitet og tumor heterogenitet [15] – [20]. I menneskelige melanomer, «stealth» melanomceller ble påvist i lymfeknutemetastaser som viste egenskaper forenlig med å være fusion hybrider [21]. Sirkulerende tumorceller tatt fra blodet av pasienter med melanom, bukspyttkjertel og kolorektal kreft co-uttrykt karsinom og leucocyttisk markører tyder BMDC-tumor celle fusjon [22].
Men fusjon og genomisk hybridisering har ennå ikke påvist på en genetisk basis i human kreft, ettersom genomiske forskjeller mellom cellene fra den samme pasient ikke lett kan skjelnes. For å omgå dette problemet har vi analysert sekundære maligniteter som oppstår legg allogen benmargstransplantasjon (BMT). I to tidligere rapporter viste vi giver alleler i pasientkreftceller, men det var ingen bestemmelse for å identifisere pasient alleler og fusjon kunne dermed ikke bevises [23] – [24]. Her har vi brukt STR lengde-polymorfisme og rettsmedisinske genetiske teknikker for å analysere genomisk DNA i en melanom hjernemetastaser fra en pasient som tidligere hadde fått en BMT fra sin bror. Resultatene demonstrerer tilstedeværelse av donor og pasient alleler i kreftceller i hele tumoren, noe som indikerer at en BMDC-kreftcellefusjon hendelsen hadde initiert genereringen av denne tumor. Patologi analyser og matematisk modellering av allele mønstre støttet denne konklusjonen.
Metoder
Etikk uttalelse
Alle prøver som brukes i denne studien ble forhåndsdefinert og avidentifisert før de blir mottatt av Yale forskerteamet. Dispensasjon er gitt under Yale IRB-protokollen # 070900309 (JP og RL) fra Yale University Menneskelig Forskning Protection Program, Institutional Review Board.
Source of vev
Pasienten var en 68-år- gammel mann som fikk en allogen BMT fra sin bror for behandling av B-celle lymfom. Hans siste engraftment /kimerisme profilen Mottakers 3%; Donor 97%. Seks år senere ble pasienten diagnostisert med metastatisk melanom involverer lymfeknuter, lever og hjerne, som stammer fra en ukjent primærtumor. Vi analyserte en hjernemetastaser (betegnet «MH3») som består av en 0,5 × 0,2 × 0,3 cm formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev. Svulsten ble fjernet kirurgisk, fast i formalin, og i parafin ved hjelp av standard histologiske prosedyrer. Pre-transplantasjon donor og pasient lymfocytter ble lagret ved -90 ° C i Yale-New Haven Hospital Stem Cell Bank og hentet etter kreft analysene ble utført.
Laser mikrodisseksjon
Håndtering og bearbeiding av vevsprøver ble utført ved anvendelse av ultraclean, DNA-fri utstyr. Fem u-tykke histologiske snitt ble kuttet og immunostained for LCA /CD45 (klon 2B11 + PD7 /26, Dako, kataloger N1514) ved hjelp av en Autostainer (DAKO, Carpinteria, CA) på Yale Dermatopathology Laboratories. Antistoffet ble testet med hensyn til farging effektivitet som beskrevet i File S1. Tumorceller ble microdissected gratis LCA /CD45-positive celler fra 9 svulst regioner ved hjelp av en Arcturus XT laser disseksjon mikroskop system. Hver prøve besto av dissekert tumorceller samlet fra ett eller flere områder av den samme delen.
DNA-ekstraksjon
DNA-ekstraksjon og STR analyser var ved Denver Police Department Crime Laboratory DNA Unit bruker standard retts drift og valided prosedyrer [25]. Prøvene ble samlet inn GeneAmp tynne vegger reaksjonsrørene (0,5 ml, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Lymfocytt DNA ble ekstrahert på BioRobot EZ1 plattform med EZ1 DNA Investigator kit spor DNA-protokollen (Qiagen i USA). Totalt menneskelig og mannlig DNA ble vurdert med Quantifiler Duo DNA Kvantifisering Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). To DNA-ekstraksjon prosedyrer ble anvendt. For tumorprøver 1-4, ble DNA ekstrahert med 5% Chelex med proteinase K prosedyre [26]. For prøvene 5-9, ble DNA ekstrahert med RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE- Vev (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), som forbedret DNA utbyttet ca. 5 ganger (ikke vist). Antallet kreftceller microdissected per prøve ble automatisk registrert av Arcturus XT system.
PCR forsterkning
PCR ble utført med AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA ). Generelt ble 1 ng av total DNA rettet i hver PCR-amplifikasjon. I prøver med mindre DNA ( 0,1 ng /mL), ble prøvene konsentrert 5-20 ganger ved hjelp av en Microcon sentrifugal filter (Ultracel YM-100, Millipore, Bille, MA, USA)
Forensic genetiske analyser. av STR loci
Hver STR locus ble valgt til å være nøytral i forhold til andre koplingsgruppe eller foreninger med enten mendelsk eller ikke-mendelsk lidelser. Den loci var polymorfe og utstilt akseptable nivåer av heterozygositet, typisk 70% eller høyere. De kunne bli analysert sammen som en PCR multipleks og var robust for nedbrutt DNA [25]. Genotyping av PCR-produkter og tolkning av Short Tandem Gjenta-STR alleler ble utført ved hjelp av kapillær elektroforese på en ABI Prism 3130 Genetic Analyzer med GeneMapper ID Software versjon 3.2 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). X og Y-kromosomer ble påvist ved hjelp av amelogenin analysen samtidig med autosomal STR analyser [25]. Kvalitative og kvantitative signal-til-støy-terskler ble bestemt med ABI Identifiler Kit. Alle topper 50 relative fluorescens enheter ble scoret som sanne alleler basert på a) høyde og b) peak morfologi [25]
Allelic stamme
allel signaltopper kan overlappe teknisk «stamme». posisjoner fra andre alleler. Valideringsstudier har etablert retningslinjer tolking for retts markører for å skille sanne allel signaler fra stamme for enhver allele til enhver locus [27] – [28]. Alle allel samtaler anses vesentlig i denne studien dannet disse retningslinjene, og ble ikke stammer overlappinger.
statistisk modellering og analyse
Bayesianske statistiske modeller for fusjon og donorcelle forurensning ble montert og sammenlignet ved hjelp av Markov kjede Monte Carlo metoder [29] implementeres ved hjelp Jags [30] og R [31] programvaren som beskrevet i File S2.
Resultater
patologi analyserer
Vi utførte omfattende patologi analyser for å sikre at laser dissekert tumorprøver ikke ble forurenset ved å infiltrere giver leukocytter. For å detektere leukocytter vi brukte et antistoff til leukocytt felles antigen (LCA /CD45) uttrykt på overflaten av modne leukocytter og hemopoietiske stamceller. I positive kontrolleksperimenter antistoffet viste . 99% farging effektivitet mot test tilfeller av dermatitt og lymfom (Fig. S1 og S2, Tabell S1 i File S1)
Farging av MH3 melanom for LCA /CD45 avslørt at noen regioner inneholdt LCA /CD45-positive leukocytter blandede med LCA /CD45-negative melanom celler (fig. 1a). Disse ble ansett som ikke egner seg for laser mikrodisseksjon. Men andre områder inneholdt rene bestander av LCA /CD45-negative melanomceller i grupper på titalls til hundrevis som var egnet for mikrodisseksjon (Fig. 1B-D). Tilsvarende, når tumoren var farget for å påvise S100 melanomceller [32], ble enkelte tumor regioner infiltrert med S100-negative leukocytter, mens andre inneholdt kun S100-positive melanomceller (Fig. 2A og B). Således kan to forskjellige Immunokjemiske analyser viste at den inneholdt tumoren MH3 områder av praktisk talt rene maligne melanomceller som kan være en ren microdissected med mindre enn 1% forurensende leukocytter. En mer detaljert analyse av S100 farging er presentert i fig. S3 og S4 i File S1.
A. Et område med brune LCA /CD45-positive leukocytter (pil) blandede med blå LCA /CD45-negative kreftceller. B-D. Tilstøtende områder fra den samme delen inneholder bare blå LCA /CD45-negative kreftceller.
Å. Et område på S100-positive tumorceller blandet med infiltrerende S100-negative leukocytter (piler). B. Et område som kun inneholder S100-positive tumorceller. Mer detaljerte patologi analysene er presentert i figurene S3 og S4 i File S1.
Laser mikrodisseksjon og STR analyser
tumorsnitt ble farget med LCA /CD45 før laser disseksjon og kreftceller ble dissekert fri for LCA /CD45-positive leukocytter. Tumorceller ble isolert fra 9 regioner i hele tumoren (prøvene 1-9) og DNA ble ekstrahert og forsterkes for lene på 14. STR loci. Alle alleler som finnes i den pre-transplantasjon donor og pasient blodlymfocytter ble også påvist i tumorceller. For hvert locus var det minst ett allel som er felles for både donor og pasient, i samsvar med broder forholdet. Åtte loci utstilt giver- spesifikke alleler og seks av disse utstilt både giver og pasientspesifikke-alleler. Dette indikerte at tumorcellene ble donor-pasient hybrider (fig. 3, tabell 1). Spesielt, tumor alleliske forholdene varierte mellom loci, men for en gitt locus de alleliske forholdstall var tilsvarende i alle 9 regioner av svulsten. Dette antydet en forholdsvis stabil genotype og sannsynligvis klonal opprinnelse av metastasering. De resterende loci var uninformative om fusjon med kun felles eller pasientspesifikke alleler og ingen giver alleler (Tabell 2, Fig. S5 i File S1).
vises er «informative» loci utstilling donor og pasientspesifikke alleler i pre -BMT lymfocytter. Tumor loci er oppført i rekkefølge av relative overflod av donor-spesifikke alleler (rød stjerne) i forhold til pasientspesifikk (blå stjerne) og felles alleler (svart stjerne). Allel topper 50 relative fluorescens enheter ble sensurert som «no call» (åpne sirkler). Loci uten påvisbare lene etter PCR forsterkning (-).
Til slutt, vi passer statistiske modeller for å sammenligne sannsynligheten for donor BMDC-tumor celle fusjon versus donor leucocyte forurensning (fig . 4), som er beskrevet i detalj i fig. S6, S7, S8, S9, Tabell S2 i File S2. Fusjons modellen passer dataene bedre, som vist med sine mindre avvik (fig. 4A og B) og dens høyere log pseudo-marginal sannsynlighet (LPML), som overskrider den LPML for forurensning modellen ved en forskjell på 71,4 (Fig. 4C og D, rød linje). . En kalibreringen [33] – [34] for å vurdere betydningen av denne forskjellen ga sannsynlig
P
0,005 for forurensning og
P
0,3 for fusjon (figur 4C og D ), som viser at den observerte LPML forskjellen er meget sjelden under forurensning modellen, men ikke sjelden under fusjon modell. Dermed disse dataene sterkt støtte fusjon i løpet av donorcelle forurensning som forklaringen på de observerte allele doser
Paneler A og B:. Avvik i henhold til forurensnings og fusion-modeller; mindre avvik indikerer bedre passform. Panelene C og D: En kalibreringsprosedyren viser den observerte forskjellen LPML (røde linjer) er sjelden under forurensning modellen, men typisk under fusjon modell. Mer detaljerte statistiske analyser er presentert i File S2.
Diskusjon og Konklusjon
STR analyser av svulsten DNA viste at donor og pasient lene var tilstede sammen på flere loci og at det var utbredt allele ubalanser og Aneuploidy. En ulempe var den manglende evne til å utføre STR analyser av individuelle tumorceller, men for denne tumoren den nedre grense for DNA gjenoppretting for STR analyser var ca 500 celler, selv ved bruk av DNA-ekstraksjonsprosedyren for FFPE-celler som forbedrede DNA-utvinning. Dermed kunne vi ikke definitivt utelukke at mønsteret kan skyldes en kimære blanding av pasienttumorceller og giver BMDCs. Men dette er usannsynlig av følgende grunner: 1) For et gitt locus den alleliske forholdstall var lik over hele tumoren. Det er vanskelig å forklare disse gjentatte mønstre som på grunn av kimære blandinger som dette ville kreve at de forskjellige celletyper eksisterte sammen i de samme forhold i hele tumoren. Spesielt, mens det meste av den informative svulst loci hadde pasient og felles alleler i større relativ overflod til donorspesifikke alleler, ble svulsten locus D13S317 reversert, med pasienten spesifikke allelet fraværende og donor-spesifikke allel i fremtredende. Siden den første dosen av genomisk DNA for hver prøve var bestemmende for PCR-produktet intensitet og varieres innen vide grenser mellom prøver, gitt konsistens i alleliske forhold fra prøve til prøve reversering av DNA dosering ved lokuset D13S317 kan ikke forklares ved preferanse PCR eller leukocytt forurensning. 2) tumorceller ble dissekert fra områder fri for LCA-positive celler (Fig. 1). 3) Det er usannsynlig at resultatene skyldtes kontaminerende DNA fra eksogene kilder. Enhver forurensende DNA ville måtte komme fra donor eller pasienten siden alle alleler påvist i kreftceller kan bli redegjort for i pre-transplantasjon lymfocytter fra den ene eller den andre av disse personene. En kilde for slik forurensning kan være lymfocyttene seg selv som de inneholdt store mengder DNA, sammenlignet med de i tumorprøver. Dette ble imidlertid utelukket fordi lymfocytter ble hentet fra langtidslagring i flytende N
2 først etter kreft analysene ble utført. Dessuten hadde det vært en gjennomgripende kilde av forurensende DNA i svulsten, bør det ha vært til stede på tilsvarende nivå i det nekrotiske områder, og dette var ikke tilfelle, som omtalt ovenfor. 4) Våre statistisk analyse av alleliske mønstrene sterkt favoriserte BMDC-melanomcellefusjon i løpet av leukocytter forurensningsmodeller.
I stilk cellebiologi både transdifferensiering og fusjon synes å være operativ i transformasjonen av stamceller i differensierte somatiske celler [ ,,,0],35] – [38]. Men opprinnelsen til kreft stamceller /tumor initiere cellene er kontroversielt. I to tidligere rapporter om sekundære malignances som oppstår hos pasienter poste allogen benmargstransplantasjon, ble donor gener funnet i kreftceller, sterkt foreslå fusjon [23] – [24]. Men ikke i noen tilfelle var pasientspesifikke gener også identifisert i kreftceller og alternative mekanismer til fusjon kan ikke utelukkes, for eksempel transdifferensiering av donor stamceller til kreftceller. Men i den tumor som er beskrevet her, rettsmedisinske analyser STR viste at både donor og pasient alleler var tilstede i tumorcellene gjennom og tumoren viste seg å bestå hovedsakelig om ikke utelukkende av BMDC-tumorcellehybrider. Videre er de gjentatte alleliske mønstre for hvert locus i hele tumoren indikerte en klonal opprinnelse av metastase og antydet at tumoren ble generert fra en tidligere hendelse fusjon mellom en giver og en pasient BMDC tumorcelle. Således, i det minste i dette tilfelle vi konkludere med at den tumor-initiering av cellen var en BMDC-tumorcellehybrid. I hvilken grad denne mekanismen er operativ i andre svulster gjenstår å fastslå.
I tidligere studier, eksperimentelle kreft hybrider generert
in vitro
mellom kreftceller, inkludert melanom, og normale epitelceller eller fibroblaster ble vanligvis undertrykkes i tumordannelse og ekspresjon av differensierte funksjoner, som fører til oppdagelsen av tumorsuppressorgener [39] – [40]. Men senere, ved hjelp av makrofager som fusjonspartnere med melanomceller, dermed gi hybrider uttrykte gener og differensierte egenskaper fra både foreldre og metastase ble markert forbedret [7] – [11]. Dette indikerte co-uttrykk for epigenomes fra begge foreldrenes slektsnavn. Co-uttrykt hybrid genomer kunne gjøre rede for kompleksiteten i genuttrykksmønster i kreftceller og også hvordan ondartet celler kan ha et slikt stort repertoar av myeloide-lignende evner som angiogenese, matrix endringer, bevegelighet, chemotaxis og immunsignalveier, samt som gjennomgår epidermal-mesodermal overgang [1], [41].
En modell for metastasering som følge av sammensmeltingen av benmarg-avledede celler diagramed skjematisk i figur 5. Selv om dette har i stor grad blitt bekreftet i dyretumormodeller og cellekultur, bevis for fusjon i human cancer har hittil vært mangelfull. Våre funn viser for første gang i et menneske kreft som generasjon av en metastase og erverv av avvikende genetiske mønstre resultat av fusjon og genomisk hybridisering mellom en BMDC og en kreftcelle. Avhengig av hyppigheten av slike hendelser, kan funnene ha viktige implikasjoner for forståelsen av metastaser, inkludert opphavet til kreft initiere celler og kreft epigenome.
En motile BMDC (rød), slik som en makrofag eller stamcelle er trukket til en kreftcelle (blå). De ytre cellemembraner av de to cellene blitt festet. Fusjon finner sted med dannelse av en bi-kjernedannet heterokaryon som har en kjerne fra hver av fusjonspartnere. Den heterokaryon går gjennom genomisk hybridisering skape et melanom-BMDC hybrid med co-uttrykt epigenomes, overdragelse deregulert celledeling og metastatisk kompetanse til hybrid.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Figurene S1, S2, S3, S4, S5 og tabell S1
doi:. 10,1371 /journal.pone.0066731.s001 product: (PDF)
Fil S2.
Figurene S6, S7, S8, S9 og Tabell S2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0066731.s002 product: (PDF)
Takk
Vi takker professor Douglas Brash, Yale School of Medicine, for første foreslå bruk av andre maligniteter følgende BMT og for hans hjelp med manuskriptet.
